李 恒，馬 碩，馮曉楠，董欣宇，宋 偉，李 海，楊 春

結(jié)直腸癌(CRC)是世界上第三大最常見的癌癥之一，其發(fā)病率為10.2%，死亡率為9.2%。結(jié)直腸癌的發(fā)展經(jīng)息肉腺瘤或扁平腺瘤過渡而癌變并發(fā)展為進(jìn)展性癌甚至向遠(yuǎn)處擴(kuò)散,歷時可達(dá)20多年。因此結(jié)直腸發(fā)生發(fā)展有明顯的時間窗，這也為結(jié)直腸癌的早期預(yù)防提供了可能[1]。近年來的研究表明，麥麩在預(yù)防結(jié)腸癌方面具有重要作用,并逐漸成為研究熱點。烷基間苯二酚(ARs)是在小麥、黑麥中發(fā)現(xiàn)的一類特殊的酚類脂，研究結(jié)果提示，食用麥麩可降低結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險。但有關(guān)5-ARs抑制結(jié)直腸癌的機(jī)制尚未闡明,本實驗旨在探討5-ARs對HCT116侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，分析谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾劑(GCLM)、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)及核因子類紅細(xì)胞相關(guān)因子2(Nrf2)可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑：細(xì)胞培養(yǎng)液購自GIBCO,山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購自ABCAM，F(xiàn)BS購自Hyclone，PS、PAGE、SDS、CCK-8試劑盒、BCA蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自凱基生物，脫脂牛奶、ECL、TEMED購自Thermo，0.45μmPVDF膜購自密理博，GCLM、GCLC、Nrf2和β-actin抗體購自Abcam，5-ARs C17:0購自Abcam，甲醇、TBST、Tris-甘氨酸緩沖液購自海利克斯；PBS購自海利克斯，30%聚丙烯酰胺購自奧林巴斯。

1.1.2 實驗儀器：CO2培養(yǎng)箱(美國Bio-Rad,型號:02793-867);高速冷凍離心機(jī)(CBS,型號2236)，凝膠成像儀(美國Bio-Rad,GELDOC2015);倒置相差熒光顯微鏡(美國Bio-Rad,型號665);紫外可見酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad Laboratories,型號Discover.V39)。

1.1.3 細(xì)胞系:人結(jié)直腸細(xì)胞(HCT116)購自美國ATCC細(xì)胞庫(Manassas,VA);細(xì)胞培養(yǎng)條件:10%胎牛血清的McCoy′5A培養(yǎng)基、PS(100 U/mL鏈霉素和100 μg/mL青霉素，雙抗),置于37℃，95% O2、5%CO2細(xì)胞恒溫室培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)：取出液氮罐中凍存的HCT116細(xì)胞,放入37.5 ℃恒溫水浴鍋中,搖動促細(xì)胞懸浮液融化,待細(xì)胞懸浮液完全融化后消毒轉(zhuǎn)移至超凈臺,并用培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞吸取至10 mL離心管中離心(1 000 r/min,5 min),棄上清,加入含有10% FBS的McCoy′5A培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞,再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,將培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁生長情況,隔1～2d換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%左右時,用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞,按1∶3傳代,取對數(shù)生長期的細(xì)胞繼續(xù)下一步實驗用。

1.2.2 藥物干預(yù)：設(shè)多組藥物干預(yù)組，分別選用濃度為0、15、30、60、90、120、150、180、210 μg/mL的5-ARs干預(yù)HCT116細(xì)胞,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,相差顯微鏡觀察不同濃度的5-ARs對HCT116細(xì)胞增殖的影響及細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.2.3 CCK-8實驗：細(xì)胞懸液在計數(shù)板計數(shù)下不同分組細(xì)胞數(shù),接種到96孔板內(nèi),按比例1∶2依次用培養(yǎng)基稀釋成一個細(xì)胞濃度,按表1的藥物濃度梯度分別干預(yù)孔板內(nèi)的細(xì)胞，每組4個復(fù)孔。接種后在恒溫箱培養(yǎng)2～4 h使細(xì)胞貼壁,加入CCK，培養(yǎng)24 h,37 ℃干燥溫箱孵育1 h,待變色后放置于酶標(biāo)儀上選擇450 nm測定光吸收值OD值并計算。細(xì)胞抑制率=(對照孔OD值-實驗孔OD值)/對照孔OD值×100%,計算最佳抑制的5-ARs的濃度，用于繼續(xù)實驗。

1.2.4 細(xì)胞蛋白的提取與濃度測定：將HCT116細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度90%左右,用BCA提取試劑盒(胞漿和胞核蛋白提取試劑盒)在低溫下提取細(xì)胞蛋白,再用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白稀釋成同一濃度備用。按照每4μL蛋白樣品加入1 μL 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液的比例,混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液,于100 ℃恒溫金屬浴中加熱5min左右使蛋白質(zhì)充分變性，分裝至-80 ℃冰箱以繼續(xù)下一步實驗用。

1.2.5 Western-blot實驗：根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量大小以及結(jié)構(gòu)調(diào)整分離膠和濃縮膠至合適比例,將蛋白樣品加入經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠上樣孔，在120 V電泳至分離膠，100 V電泳約1.5 h,然后電轉(zhuǎn)液中濕性電轉(zhuǎn)80 V、1.5 h,電轉(zhuǎn)至PVDF膜,4%脫脂奶粉37 ℃封閉1.5 h,搖床搖勻,洗凈，分別加入各目標(biāo)抗體:GCLC抗體(1∶1000稀釋)、GCLM抗體(1∶1500稀釋)、Nrf2抗體(1∶2000稀釋)、β-actin(1∶1500稀釋),4 ℃搖床60 r/min 12 h。1%TBST洗膜三次每次5min,加入相應(yīng)二抗(鼠抗和兔抗1∶3 000稀釋),室溫孵育1.5 h左右,再給予1% TBST洗膜后加入適宜劑量ECL顯色液在暗室凝膠成像儀下曝光成像,記錄并留圖，用Image J軟件進(jìn)行圖像分析實驗結(jié)果。

1.2.6 Transwell實驗：取出試劑盒，將所需數(shù)目的小室置于新的24孔板中，上室加100 μL無血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中放置1 h。制備無血清細(xì)胞懸浮液，并計數(shù)，細(xì)胞數(shù)根據(jù)預(yù)實驗調(diào)整，一般為105/孔(24孔板)。小心除去上室中培養(yǎng)基并加入100 μL細(xì)胞懸液，下室內(nèi)加入600 μL 30%FBS培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時間。倒扣小室于吸水紙上以去除培養(yǎng)基，用棉拭子輕輕移去小室內(nèi)非轉(zhuǎn)移細(xì)胞，將小室置于4%多聚甲醛固定液中固定0.5 h。固定后，將小室撈出，用吸水紙吸干小室表面固定液，滴入1～2滴染色液到膜的下表面染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞1～3 min后，將小室浸泡沖洗數(shù)次，空氣晾干。顯微鏡拍照：每個Transwell小室，隨機(jī)選取視野，拍100X照片4張，以100X的照片來計數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。比較實驗組和對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的差異，計算各組轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)(Migratory cells per field)，標(biāo)準(zhǔn)差。T-Test分析得到P值，判斷是否有顯著性差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件,2組間比較采用兩樣本t檢驗,多組間比較采用方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-ARs能夠抑制HCT116增殖：將不同濃度5-ARs干預(yù)HCT116后,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)變化。結(jié)果顯示,與對照組相比,HCT116組隨著5-ARs作用時間的延長,細(xì)胞數(shù)明顯減少。

2.2 CCK-8法測定不同濃度5-ARs誘導(dǎo)人HCT116細(xì)胞系的抑制率：將5-ARs預(yù)先設(shè)置成0～210 μg/mL(組距為15 μg/mL的倍數(shù))，分別干預(yù)各組細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 4h,CCK8法檢測細(xì)胞抑制率與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與陰性對照組相比,HCT116-5-ARs抑制率明顯增加;隨著5-ARs的濃度升高,可不同程度地抑制HCT116增殖(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度5-ARs處理HCT116的OD值(μg/mL)

計算細(xì)胞IC50值可得出結(jié)論，在5-ARs兩個恒基組成濃度為33.01μg/mL抑制人HCT116細(xì)胞系效果尤為明顯。并將此濃度值作為下一步實驗用的最佳濃度值。

2.3 Transwell侵襲實驗驗證5-ARs處理過的HCT116細(xì)胞的侵襲能力：上述濃度的5-ARs處理HCT116細(xì)胞后，隨著時間的延長其抑制HCT116細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。

2.4 Western- blot檢測上述濃度的5-ARs處理后HCT116細(xì)胞系的GCLC和GCLM的變化：5-ARs在48 h后可明顯抑制HCT116中GCLC和GCLM表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 Western-blot檢測上述濃度的5-ARs處理后HCT116細(xì)胞系的Nrf2的變化：上述濃度的5-ARs處理的HCT116細(xì)胞系隨著5-ARs作用時間的延長,Nrf2的表達(dá)量在8 h內(nèi)明顯過量表達(dá)，8 h后受抑制，并且24 h后受抑制呈現(xiàn)明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將上述濃度的5-ARs處理HCT116細(xì)胞系分別提取胞漿Nrf2和核內(nèi)Nrf2蛋白經(jīng)Western-blot檢測，在24 h內(nèi)，Nrf2在胞漿內(nèi)表達(dá)明顯上升，而在胞核內(nèi)明顯受抑制，24 h后則呈現(xiàn)Nrf2在胞漿內(nèi)表達(dá)明顯降低，而在胞核內(nèi)明顯增高。

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。麥麩在預(yù)防結(jié)腸癌方面具有重要作用,研究表明食用麥麩可降低大腸癌發(fā)病風(fēng)險。ARs特殊的兩親性使其具有抑菌、提高生物膜的穩(wěn)定性、抗腫瘤、抗氧化等多種生理功能，其作為攝入小麥、黑麥等全谷物食品特殊的生物標(biāo)記受到研究者的廣泛關(guān)注。Howe和Trock等學(xué)者的研究結(jié)果提示增加食用纖維量可以顯著降低結(jié)直腸癌的發(fā)生率。Freudenheim等學(xué)者也發(fā)現(xiàn)增加谷物來源的不溶性纖維比增加蔬菜和水果來源的可溶性纖維能降低大腸癌的發(fā)病風(fēng)險。雖然很多病例對照研究表明麥麩能降低大腸癌發(fā)病風(fēng)險,但麥麩油的主要成分5-烷基間苯二酚(5-ARs)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的具體研究機(jī)制報道較少。

據(jù)報道，GCLC在腫瘤組織中表達(dá)異常增高[2-3]。已發(fā)現(xiàn)GCLC在結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移中過度表達(dá)并促進(jìn)癌細(xì)胞存活[4]。氨基酸合成GSH涉及兩個需要ATP的酶促步驟：第一步是限速和GCL由一個催化(GCLC)和一個改性劑(GCLM)兩個恒基組成,GCLM與癌癥發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[5-6]。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCL)活性[7]與多種癌癥[8]升高的GSH水平密切相關(guān)。作為GCL的成員，GCLC是一種限速酶，參與GSH生物合成的第一步。在參與維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的酶系統(tǒng)中，GSH扮演著主要角色，它不僅參與抗氧化防御系統(tǒng)，還參與許多代謝過程?；钚匝?ROS)[9]是需氧細(xì)胞在生理上產(chǎn)生的，在細(xì)胞損傷的情況下，它們的產(chǎn)量會增加。高水平的活性氧(ROS)或受損的抗氧化防御系統(tǒng)引起的氧化應(yīng)激可能在癌癥的形成[10]和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[11]。氧化應(yīng)激長期以來一直與癌癥的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)，這表明抗氧化治療可能提供預(yù)防癌癥的保護(hù)。實驗表明[9，12]，ARs可負(fù)向調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移能力，并經(jīng)Bax/Bcl-2/caspase通路調(diào)控其凋亡[13]。

GCLC是受Nrf2調(diào)控的典型靶基因之一[14-15]，高水平的GCLC與關(guān)鍵抗氧化劑GSH的含量相關(guān)。核因子類紅細(xì)胞相關(guān)因子2(Nrf2)是一種氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)一系列抗氧化基因和細(xì)胞保護(hù)酶，這些酶構(gòu)成了對氧化應(yīng)激的防御[16]。Nrf2是癌癥新興治療靶點[17]，其參與腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激和鐵代謝作用[18]。Nrf2通過其啟動子中的抗氧化反應(yīng)元件調(diào)節(jié)眾多基因的表達(dá)，以中和自由基并加速清除環(huán)境毒素。[15]可減少疾病發(fā)作或改善預(yù)后。Nrf2還負(fù)向調(diào)節(jié)TGF-β1、ECM和p21的表達(dá)。[14]Nrf2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中以促進(jìn)多種細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)[19]，例如 HO1、NAD(P)H醌氧化還原酶1(NQO1)和谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾劑(GCLM)。Nrf2是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它通過與啟動子中的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合來調(diào)節(jié)多種抗氧化基因的表達(dá)[18，20],有研究表明癌癥患者的Nrf2高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[21]。

眾所周知，小麥、黑麥等麥類中含有大量的ARs,干燥的麥粒中其含量為0.015%～0.3%。小麥等谷物類中的ARs通過改善細(xì)胞的抗氧化[22]和抑制糖脂代謝[23]增加抗腫瘤的作用。5-ARs能夠降低一些間接誘導(dǎo)物質(zhì)的誘導(dǎo)性[24]，與花青素相比較,ARs能夠有效地抑制淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)速率和頻率。Gasiorowski等學(xué)者通過埃姆斯實驗發(fā)現(xiàn)ARs能夠顯著降低四種標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),ARs不僅能夠促進(jìn)具有遺傳毒性的被損傷細(xì)胞的死亡速率加快,還能夠抑制癌細(xì)胞形成。進(jìn)一步的研究表明ARs抑制由過氧化氫引起的結(jié)腸癌細(xì)胞氧化損傷,在癌細(xì)胞中加入ARs，與結(jié)腸癌直接相關(guān)的排泄物的生殖毒性有所降低[21]。

本研究結(jié)果表明，在適宜的干預(yù)濃度(33.01 μg/mL)下，5-ARs可明顯抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的侵襲和轉(zhuǎn)移能力(P<0.05)，并抑制GCLC和GCLM蛋白表達(dá)水平從而抑制谷胱甘肽代謝通路，并且5-ARs在時間和空間上抑制Nrf2的表達(dá)方式，從而調(diào)控HCT116細(xì)胞的凋亡(P<0.05)。具體來說，5-ARs隨著作用HCT116細(xì)胞時間的延長，其抑制HCT116細(xì)胞的生長能力及其侵襲能力效果更加明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在33.01 μg/mL 5-ARs 的最佳作用濃度下，24 h后可抑制GCLC和GCLM蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞HCT116的生長繁殖以及侵襲能力。我們還發(fā)現(xiàn)在33.01 μg/mL的5-ARs 作用下8 h后HCT116細(xì)胞內(nèi)的Nrf2蛋白表達(dá)明顯受抑制，并且存在時空上的差異化表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白受5-ARs 蛋白的調(diào)控存在時間的不同，即在作用24 h內(nèi)，Nrf2在胞漿內(nèi)表達(dá)量明顯上升，而在胞核內(nèi)表達(dá)量明顯受抑制，24 h后則呈現(xiàn)Nrf2在胞漿內(nèi)表達(dá)量明顯降低，而在胞核內(nèi)表達(dá)量明顯過量，從而實現(xiàn)5-ARs蛋白不同方式抑制HCT116的抗凋亡作用，具體調(diào)控方式的機(jī)制有待深入研究。