代香臨,鄭啟航,胡楠楠,李 琦,許秀穎,吳玉柱,劉景圣
(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長春 130118)
淀粉是植物中含碳水化合物最集中的有機(jī)成分,其提供的能量占據(jù)了人類食物能量來源的一半[1]。 淀粉消化率影響餐后血糖應(yīng)答,諸多與飲食相關(guān)的疾病,如Ⅱ型糖尿病、肥胖癥和結(jié)腸癌等均與其相關(guān)[2]。淀粉和淀粉基食品的消化率可以用血糖指數(shù)(Giycemic index,GI)來表征,它反映餐后血液中葡萄糖水平[3]。天然淀粉基食品普遍具有很高的GI 值,會(huì)引起餐后血糖水平迅速升高,因此預(yù)測及控制攝入淀粉基食品的餐后血糖釋放至關(guān)重要。 根據(jù)淀粉的消化率,可分為快速消化淀粉(Rapidly digesting starch,RDS)、 慢速消化淀粉(Slowly digesting starch,SDS)以及抗性淀粉(Rasistant starch,RS),其中SDS 和RS 是低升糖食品,具有緩慢吸收,持續(xù)釋放能量,維持血糖穩(wěn)態(tài),預(yù)防和治療各種疾病的作用[4]。諸多研究表明淀粉的結(jié)構(gòu)與其消化特性密切相關(guān)。例如,Sorndech 等[5]利用麥芽糖酶協(xié)同分支酶改性木薯淀粉,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著淀粉結(jié)構(gòu)的改變,淀粉的抗消化性能顯著提高。Ren 等[6]發(fā)現(xiàn)分支酶的兩階段改性可以顯著提高淀粉分支密度,并且與其慢消化特性密切相關(guān)。 Lee 等[7]發(fā)現(xiàn)諸多因食用GI 未受調(diào)控的食品所引起的慢性疾病,可以通過改變淀粉的結(jié)構(gòu),延長其在小腸中的消化時(shí)間,以達(dá)到預(yù)防及治療的目的。
不同結(jié)構(gòu)的天然淀粉,根據(jù)X-射線衍射圖譜可劃分為A 型、B 型和C 型,其中玉米淀粉(Corn starch,CS)、馬鈴薯淀粉(Potato starch,PS)和豌豆淀粉(Pea starch,PEA/S)分別是3 種晶型的典型代表[8]。研究人員發(fā)現(xiàn)天然玉米淀粉以及蠟質(zhì)玉米淀粉(A 型) 中SDS 含量較高,而馬鈴薯淀粉(B型)中RS 含量較高,表明淀粉的結(jié)晶類型影響其消化特性[9]。據(jù)報(bào)道,使用物理、化學(xué)及酶法處理可以改變淀粉結(jié)構(gòu),從而降低淀粉消化率[10]。 其中,化學(xué)法改性會(huì)引入有害副產(chǎn)物,無法保證食品的安全性。而物理和生物酶法因綠色環(huán)保,改性效率高,不會(huì)引入不良副產(chǎn)物等特點(diǎn),而成為相對理想的改性方式。 通常采用葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來改性淀粉,對其水解以及轉(zhuǎn)糖基化,來達(dá)到緩慢消化的目的[11]。 作為一種重要的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,分支酶(Brachzyme,BE)是通過水解α-1,4 糖苷鍵,并且重連α-1,6 糖苷鍵以改變淀粉結(jié)構(gòu)[12]。 在淀粉消化過程中,α-1,6 糖苷鍵的斷裂速率低于α-1,4糖苷鍵[13],因此提高α-1,6 糖苷鍵的比例是改性的有效方法。 然而,BE 的轉(zhuǎn)糖基化活性會(huì)隨著短鏈的積累而受到抑制[14]。 研究者們將其它酶與BE結(jié)合,來降低淀粉的消化率。 Lee 等[7]的研究發(fā)現(xiàn)相比于單獨(dú)使用BE,BE 與β-淀粉酶聯(lián)合修飾蠟狀玉米淀粉,產(chǎn)生了更高分支度的麥芽糊精并顯示出緩慢消化的特性。相比于其它酶,β-淀粉酶能夠更高效地生產(chǎn)慢消化淀粉。 β-淀粉酶(β-Amylase,BA) 通過水解非還原末端的α-1,4 糖苷鍵,進(jìn)而除去麥芽糖殘基并且縮短部分分支的鏈長,同時(shí)提高分支密度[15]。 通過BE 和BA 的結(jié)合以制備SDS 和RS 是較為理想的策略。 然而,酶易受溫度、pH、鹽離子等因素的影響,不易控制其改性程度[16]。 通過其它技術(shù)輔助提高改性的效率及得率至關(guān)重要。超聲作為新型綠色技術(shù),在諸多領(lǐng)域的應(yīng)用方面展現(xiàn)出巨大的潛力。 超聲與酶具有協(xié)同效應(yīng)[17],Hu 等[18]發(fā)現(xiàn)無論是單頻還是雙頻超聲波都與α-淀粉酶有協(xié)同效應(yīng),其引起的分子運(yùn)動(dòng)能夠克服酶處理過程中內(nèi)部傳質(zhì)障礙,進(jìn)而有效地提高傳統(tǒng)酶改性的效率。
本文選擇CS、PS 和PEA/S 3 種典型晶型的淀粉,采用復(fù)合酶、超聲-復(fù)合酶兩種方法對其改性,研究不同改性方法對淀粉分子結(jié)構(gòu)的影響,并分析改性后的淀粉消化特性,進(jìn)一步探究新型改性淀粉的慢消化機(jī)制。 本研究將為新型功能性淀粉基食品的開發(fā),以及功能性食品的原料來源提供理論依據(jù)。
玉米淀粉和馬鈴薯淀粉,榮振化工公司;豌豆淀粉,河南頌揚(yáng)生物科技公司;直鏈淀粉試劑,格銳思生物公司;α-淀粉酶(豬胰腺)、葡萄糖苷酶,Sigma 公司;GOPOD 試劑盒,愛爾蘭Megazyme 公司;β-淀粉酶,麥克林公司;分支酶,諾維信公司;除有特別說明外,試驗(yàn)中的其它試劑均為分析純級。
Alpha1-4LDplus 冷凍干燥機(jī),德國Christ 公司;AV400NMR 譜儀,瑞士Bruker 公司;VERTEX 70 傅里葉紅外光譜儀,費(fèi)爾伯恩精密儀器公司;D/max200PC X 射線衍射儀,日本理學(xué)公司;恒溫水浴振蕩搖床,深圳優(yōu)米儀器公司;Allegra X-30 高速離心機(jī),美國Beckman 公司;Spectramax190 全波長酶標(biāo)儀,PerkinElmer 公司。
1.3.1 復(fù)合酶改性淀粉的制備 稱取10 g 玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、豌豆淀粉,分別加入至200 mL NaAc(pH 6.5,0.02 mol/L)緩沖液中,配制成淀粉乳0.05 g/mL,放入65 ℃水浴振蕩30 min,加入BE(500 U/g),振蕩12 h。 添加400 mL 無水乙醇,醇沉、抽濾并收集固形物,預(yù)凍12 h 后,冷凍干燥24 h,研磨、過篩。 處理后的淀粉加到200 mL NaAc(pH 5.5,0.02 mol/L)緩沖液中,將其置于55 ℃水浴中振蕩30 min,以達(dá)到BA 作用的最佳溫度,加入BA(干基的0.64%),振蕩12 h。 加入2 倍體積無水乙醇,醇沉、抽濾、收集固形物。接著用上述步驟再次用BE 處理,得到復(fù)合酶改性產(chǎn)物。
1.3.2 超聲-復(fù)合酶改性淀粉制備 稱取10 g 玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、豌豆淀粉,分別加入至200 mL NaAc 緩沖液(pH 6.5,0.02 mol/L)中,配制0.05 g/mL 的淀粉乳,在120 W 的功率下超聲15 min。 將其置于65 ℃水浴中振蕩30 min,加入BE(500 U/g),振蕩12 h。 添加400 mL 無水乙醇,醇沉、抽濾并收集固形物,預(yù)凍12 h 后,冷凍干燥24 h,研磨、過篩。處理后的淀粉加入至200 mL NaAc緩沖液(pH 5.5,0.02 mol/L)中,將其置于55 ℃水浴中振蕩30 min,以達(dá)到BA 作用的最佳溫度,加入BA(干基的0.64%),振蕩12 h。 加入2 倍體積無水乙醇,醇沉、抽濾、收集固形物。用上述步驟再次用BE 處理,得到超聲-復(fù)合酶改性產(chǎn)物。
1.3.3 直鏈淀粉含量測定 分別稱取0.01 g 樣品于離心管中,加入1 mL NaOH,充分混勻,80 ℃水浴提取30 min,4 000 r/min 常溫離心5 min,棄上清,留沉淀。 加入1 mL 石油醚振蕩5 min,4 000 r/min 離心5 min,棄上清液,留沉淀。 加蒸餾水混勻,90 ℃水浴10 min,冷卻,待測。按直鏈淀粉含量試劑盒說明書來添加顯色試劑。 混勻,測定620 nm 波長處的吸光度值。
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:將10 mg/mL 的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋成0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL,按照說明書要求測定吸光度值,以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 直鏈淀粉含量=(樣品OD 值-空白OD 值-b)/a×V提取液/W[19],式中,a——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;b——標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。
1.3.4 分支密度測定 通過核磁共振1H 譜(1H NMR) 測定淀粉α-1,6-糖苷鍵的比例。 淀粉(80 mg/mL)溶解于重水(D2O)中,沸水浴30 min。 糊化后的樣品冷凍干燥72 h 后,重新溶解于重水(40 mg/mL)中,通過1H NMR 測定其α-1,6-糖苷鍵比例。 依據(jù)對應(yīng)峰面積計(jì)算得到α-1,6-糖苷鍵比例[20]。
1.3.5 傅里葉紅外光譜測定 使用傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)測定樣品的結(jié)構(gòu)。 取2 mg 樣品和0.2 g 溴化鉀在紅外燈下研磨混勻,放置于模具中,真空壓片60 s。 以KBr 為背景,在4 000~400 cm-1范圍內(nèi)掃描128 次,分辨率為4 cm-1,得到FT-IR 圖[21]。
1.3.6 結(jié)晶特性測定 通過X 射線衍射儀(XRD)檢測結(jié)晶結(jié)構(gòu)。 參數(shù)設(shè)定為:電流200 mA,電壓40 kV,步寬0.02°,衍射角2θ=5°~40°,掃描速率1.2°/min,在此條件下連續(xù)掃描[22]。
1.3.7 體外模擬消化測定 參考Englyst 方法并稍加修改,對樣品進(jìn)行體外模擬消化測定[23]。 酶解液制備: 取6 g 胰α-淀粉酶加入至40 mL 去離子水中,攪拌30 min,5 000 r/min 離心30 min,取上清34.5 mL 置于預(yù)冷燒杯中;向3.15 mL 葡萄糖苷酶中加入3.6 mL 蒸餾水,稀釋后取4.5 mL 倒入燒杯中制成酶解液。 消化率測定:取1 g 樣品,20 mL乙酸鈉緩沖液 (0.1 mol/L,pH 5.2),6 枚玻璃珠于錐形瓶中,在37 ℃搖床中保溫10 min,滴加5 mL酶解液。 然后,在37 ℃、170 r/min 條件下,反應(yīng)120 min。第20 min 與第120 min 時(shí),分別取出0.5 mL 反應(yīng)液于20 mL 66%乙醇中滅酶。酶解后的葡萄糖含量使用GOPOD 試劑盒測定,具體操作按照說明書完成。 其中RDS、SDS 及RS 含量的計(jì)算公式如下:
式中,Mt——t 時(shí)刻(min),離心管內(nèi)上清液中葡萄糖的質(zhì)量(g);0.9——比例轉(zhuǎn)換系數(shù)。
1.3.8 淀粉消化動(dòng)力學(xué) 基于Yu 等[24]的方法建立一級淀粉消化動(dòng)力學(xué)方程,將消化曲線進(jìn)行擬合,擬合方程如下:C=C∞×(1-e-kt)研究改性淀粉的消化動(dòng)力學(xué)及預(yù)測血糖生成指數(shù) (pGI),式中,C——在t 時(shí)刻消化的淀粉 (g/100 g 干淀粉);C∞——樣品的最終葡萄糖平衡濃度(g/100 g 干淀粉);k——消化速率常數(shù) (min-1);t——消化時(shí)間(min)。 分別測定樣品酶解10,20,30,40,50,60,80,100,120 min 時(shí)的水解率(HR):
式中,M——不同時(shí)間水解后的葡萄糖質(zhì)量(mg);m——樣品質(zhì)量(mg)。
水解指數(shù)(Hydrolysis index,HI)通過樣品和空白對照樣品的消化水解曲線的面積比例求得。樣品的預(yù)測血糖指數(shù)(pGI)通過下式計(jì)算得到:
1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel、Origin 8.5 及AI 等軟件完成;采用SPSS 軟件進(jìn)行Ducan 差異顯著性分析,P<0.05 表示差異顯著。
通過碘藍(lán)法測定3 組樣品的直鏈淀粉含量。如圖1 所示,改性前PEA/S 直鏈淀粉含量最高。經(jīng)復(fù)合酶(BE、BA)處理后,CS 組淀粉、PS 組淀粉和PEA/S 組淀粉的直鏈淀粉含量均下降,其中CS 組及PEA/S 組尤為顯著,分別下降了5.21%和38.48%(P<0.05);隨著超聲的引入,直鏈淀粉含量均進(jìn)一步下降。 以上結(jié)果是由于復(fù)合酶的水解作用,除去了一部分直鏈淀粉,加之BE 的分支作用,引入新的α-1,6 糖苷鍵,形成新的分支點(diǎn),從而將直鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移至支鏈分子上,致使直鏈淀粉比例降低。另外。超聲破壞了淀粉分子表面的水束層,因此提高了復(fù)合酶的作用效率[25]。 在3 種晶型淀粉的改性過程中,PEA/S 直鏈淀粉含量下降幅度最大,表明直鏈淀粉含量越高,改性效果越明顯。
圖1 改性前、后3 種晶型淀粉直鏈淀粉含量Fig.1 Amylose contents of three kinds of starches before and after modification
采用1H NMR 來表征改性后的3 種淀粉的分支密度,通過計(jì)算α-1,6 糖苷鍵比例來量化各樣品的分支密度,如圖2 所示。在淀粉分子中,α-1,4糖苷鍵和α-1,6 糖苷鍵的中端基質(zhì)子化學(xué)位移分別為5.3 ppm 與4.9 ppm。 通過圖2 計(jì)算的峰面積得到以下結(jié)果,與對照組相比各組樣品的α-1,6糖苷鍵比例均有所提高。 其中,CS1、PS1 和PEA/S1 的α-1,6 糖苷鍵比例分別提高了16.4%,26.6%,139%。引入超聲后的各組樣品的α-1,6 糖苷鍵比例又進(jìn)一步提高,相比于CS1、PS1、PEA/S1分別提高了14.5%,26.6%,51.3%。 以上結(jié)果是因?yàn)閺?fù)合酶能夠水解淀粉的α-1,4 糖苷鍵,同時(shí)復(fù)合酶作用后出現(xiàn)鏈轉(zhuǎn)移,進(jìn)而除去麥芽糖殘基并且縮短部分分支的鏈長[26];超聲通過增加淀粉分子的比表面積[26],從而增強(qiáng)了分支酶的轉(zhuǎn)糖激化活性,因此進(jìn)一步提高了淀粉的分支密度。 此外,研究還發(fā)現(xiàn)淀粉底物分支密度低時(shí),改性效果更顯著。
圖2 改性前、后3 種晶型淀粉核磁共振氫譜分析圖Fig.2 1H NMR analysis of three kinds of starches before and after modification
改性前、 后3 種淀粉的原始紅外光譜如圖3所示。與對照組相比,經(jīng)復(fù)合酶改性后的3 種淀粉的氫鍵吸收峰出現(xiàn)紅移,這是由于分支密度增加,酶處理后氫鍵的強(qiáng)度下降。 超聲輔助改性后的各組淀粉的氫鍵吸收峰出現(xiàn)藍(lán)移,這是由于一定的超聲作用能使淀粉分子鏈斷裂成相似的片段,有利于淀粉鏈間相互靠近形成氫鍵,并提高分子的有序狀態(tài)[27]。
圖3 改性前、后3 種晶型淀粉紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of three crystalline starches before and after modification
為了進(jìn)一步分析紅外光譜,本研究對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積處理。1 045 cm-1 和1 014 cm-1處的峰分別與淀粉中的有序結(jié)構(gòu)和無定形結(jié)構(gòu)相關(guān),因此1 045 cm-1和1 014 cm-吸收峰強(qiáng)度比值(R1045/1014)表示短程范圍內(nèi)結(jié)晶度和晶體有序性,R值越大有序度越高,反之有序度越低[28]。 由圖4 所示,改性前、后3 種淀粉的去卷積紅外光譜圖可以計(jì)算出樣品的R1045/1014值,結(jié)果如表1 所示。3 種淀粉的R 值從小至大依次為:CS
表1 改性前、后3 種晶型淀粉短程有序結(jié)構(gòu)分析Table 1 Analysis of short-range ordered structure of three crystalline starches before and after modification
圖4 改性前、后3 種晶型淀粉去卷積紅外光譜圖Fig.4 Infrared deconvolution spectra of three kinds of starches before and after modification
圖5 為3 種晶型淀粉改性前、 后的XRD 圖譜,利用Jade 6.5 軟件計(jì)算得到相對結(jié)晶度(圖5)。 CS 在衍射角為15.3°,18.1°,20.3°,23°處有特征峰,PS 在衍射角為5.6°,17°,22.4°,24°處有特征峰,PEA/S 在衍射角為15.2°,17.3°,19.7°,23.1°處有特征峰,它們的晶型分別呈A 型、B 型、C 型[29]。復(fù)合酶改性后CS、PS 及PEA/S 的原始峰強(qiáng)度變?nèi)?,相對結(jié)晶度下降。這是由于復(fù)合酶處理改變了淀粉分子內(nèi)部的微晶型取向,淀粉晶體被破壞,長程有序結(jié)構(gòu)減少,從而導(dǎo)致相對結(jié)晶度降低[30]。 然而,隨著超聲的引入CS 和PS 在13.2°和19.7°處出現(xiàn)2 個(gè)強(qiáng)衍射峰,在5.6°和17.3°處顯示出2 個(gè)弱衍射峰,并且PEA 還在23°處出現(xiàn)特征峰,3 種淀粉相對結(jié)晶度顯著升高。 這說明超聲使得破壞的晶體重排成弱C 型晶體結(jié)構(gòu),又由于13.2°及19.7°處的峰是V 型結(jié)構(gòu)的特征峰[31],因此超聲輔助酶修飾的淀粉呈C+V 型的晶型結(jié)構(gòu),且V 型為主要晶型。 上述結(jié)果是由于超聲的“空穴效應(yīng)”產(chǎn)生的剪切力切斷淀粉長鏈,產(chǎn)生大量短鏈,為復(fù)合酶改性提供了更多的底物,并且這些短鏈與無水乙醇形成的復(fù)合物,也有利于形成V 型結(jié)構(gòu),而V型結(jié)構(gòu)是具有慢消化特性的結(jié)構(gòu)[14]。
圖5 改性前、后3 種晶型淀粉晶型結(jié)構(gòu)Fig.5 Crystal structure analysis of three kinds of starches before and after modification
由表2 可知,經(jīng)改性后,各組α-1,6 糖苷鍵的含量均有不同程度的增加。 Ocieczek 等[32]指出α-1,6 糖苷鍵的含量增加有助于消化率的降低。 因此,在含有胰酶和葡萄糖苷酶的體外消化系統(tǒng)中,對CS 組、PS 組及PEA/S 組進(jìn)行消化率的測定,結(jié)果如表2 所示。利用復(fù)合酶和超聲-復(fù)合酶兩種策略均可高效調(diào)控淀粉結(jié)構(gòu),來達(dá)到優(yōu)化其消化性能的目的。經(jīng)復(fù)合酶改性后,3 組淀粉中的RDS 含量均降低,SDS 和RS 含量均顯著提高。 其中CS組經(jīng)復(fù)合酶處理后,SDS 和RS 相比對照組分別增加了7%和5%,引入超聲后SDS 含量進(jìn)一步增加至25.9%; 樣品PS1 中SDS 和RS 相比對照組分別增加了16.8%和4.2%,引入超聲后SDS 含量進(jìn)一步增加至35.6%;PEA/S 組,樣品PEA/S1 中SDS 和RS 相比對照組分別增加了4.4%和12.4%,引入超聲后SDS 含量進(jìn)一步增加至33.2%。 綜合比較,與單一復(fù)合酶改性相比,超聲-復(fù)合酶改性是更為高效的改性手段,其中PEA/S 對復(fù)合酶更為敏感。
表2 改性前、后3 種晶型淀粉消化性能分析Table 2 Analysis of digestibility of three crystalline starches before and after modifacation
各組淀粉改性前、 后體外水解曲線如圖6 所示。3 種晶型淀粉在120 min 之內(nèi)水解率先快速升高,然后緩慢升高并逐漸達(dá)到平衡。水解平衡濃度從大到小依次為:PEA/S>PS>CS。
圖6 改性前、后3 種晶型淀粉水解曲線Fig.6 Hydrolysis curves of three starches before and after modification
基于Yu 等[24]的體外消化動(dòng)力學(xué)方法,采用Origin 2018 軟件對圖6 中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到水解動(dòng)力學(xué)模型結(jié)果(表3)。經(jīng)復(fù)合酶改性后,CS 和PS 的水解平衡濃度均有顯著降低(P<0.05),而經(jīng)過超聲輔助后,各組水解平衡濃度均顯著降低。另外,3 種晶型淀粉經(jīng)兩種策略改性后水解指數(shù)(HI)和血糖指數(shù)(GI)均顯著降低(P<0.05),說明兩種改性策略均能有效降低餐后血糖的釋放速率,并且超聲輔助酶改性法的效率更高。
表3 改性前、后3 種晶型淀粉體外模擬消化動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)Table 3 In vitro simulated digestion kinetics parameters of the three starches before and after modification
研究結(jié)果表明,經(jīng)復(fù)合酶處理后,3 種晶型淀粉的直鏈淀粉含量均降低,α-1,6 糖苷鍵比例有不同程度的增加,分子有序程度降低,相對結(jié)晶度降低,其中豌豆淀粉變化幅度最大,說明3 種典型晶型中豌豆淀粉對復(fù)合酶最為敏感; 相比于復(fù)合酶改性,經(jīng)超聲-復(fù)合酶改性后各組淀粉的直鏈淀粉含量均進(jìn)一步降低,分支密度顯著提高,相對結(jié)晶度升高,3 種晶型淀粉均轉(zhuǎn)化為以V 型結(jié)構(gòu)為主要晶型的C+V 型結(jié)構(gòu),說明改性后分子排列更加有序,結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定;3 組淀粉經(jīng)改性后,RDS均顯著降低,SDS 顯著提高,HI 和GI 顯著降低。以上結(jié)果說明兩種策略均能夠通過改變淀粉結(jié)構(gòu)來改善其消化性能,而超聲處理能夠有效提高復(fù)合酶的改性效率,因此超聲輔助酶法是調(diào)節(jié)淀粉餐后血糖釋放速率的有效改性策略,為開發(fā)低GI功能性食品的加工技術(shù)優(yōu)化提供了新思路。