張 君，李阿潔

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710038;2.銅川市人民醫(yī)院耳鼻喉科,陜西 銅川 727000)

鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤(Sinus nasal inverted papilloma，SNIP)是臨床比較常見的一種鼻腔腫瘤，這種腫瘤會(huì)對(duì)周圍結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞、易侵襲、易復(fù)發(fā)，而且癌變發(fā)生率較高[1]。流行病學(xué)研究[2]發(fā)現(xiàn)，SNIP發(fā)病多為男性，且多為良性腫瘤，其發(fā)生率約為原發(fā)性鼻腔腫瘤的0.5%～4.0%。國際上將乳頭狀瘤分為蕈狀、柱狀和內(nèi)翻性三種組織類型，且發(fā)生多與人乳頭狀瘤病毒相關(guān)，患者臨床多表現(xiàn)為涕中帶血、流涕、嗅覺減退、頭痛以及鼻塞等。隨著患者腫瘤進(jìn)一步擴(kuò)大，臨床分期進(jìn)展，可累及的部位也逐漸增加，出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的體征和癥狀，降低患者生活質(zhì)量。研究[3]發(fā)現(xiàn)，對(duì)SNIP早診斷并確定其發(fā)展情況對(duì)于疾病的治療效果及預(yù)后具有重要影響。當(dāng)前對(duì)于SNIP分期多采取Krouse的分期理念進(jìn)行[4]，但此種評(píng)價(jià)方式需要對(duì)患者進(jìn)行影像學(xué)、病理學(xué)和生化指標(biāo)等多項(xiàng)診斷，辨別較為繁瑣。所以，如何找到更準(zhǔn)確、便捷的疾病嚴(yán)重程度判斷方式，及時(shí)明確SNIP診斷和預(yù)后判斷成為研究熱點(diǎn)內(nèi)容。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(Metastasis related gene 1 of colon cancer，MACC1)表達(dá)可通過提升細(xì)胞轉(zhuǎn)移和遷移能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散與浸潤。磷酸化需肌醇酶1蛋白(phosphorylated inositol-requiring enzyme 1 protein,p-IRE1)的表達(dá)可通過對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所產(chǎn)生的損傷，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊障礙，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞病變過程。因此，為了提升SNIP的診斷分析效能，本研究探討MACC1和p-IRE1在鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤組織中的表達(dá)及其與臨床分期的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 篩選我院80例鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤患者，納入時(shí)間為2018年1月至2020年1月，均行外科手術(shù)治療，在手術(shù)過程中取患者瘤組織進(jìn)行病理診斷，依照不同分期將所有患者分為四組，即T1組(n=18)、T2組(n=23)、T3組(n=25)和T4組(n=14)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均采取鼻內(nèi)鏡下鼻腔鼻竇腫瘤切除術(shù)進(jìn)行治療，且術(shù)后病理診斷確診為鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤；Krouse分期為T1～T4期[病灶沒有侵襲鼻竇和鼻腔以外的部分，且無惡變?yōu)門1期；腫瘤發(fā)展到篩竇和竇口竇道鼻道復(fù)合體，可能累及鼻腔和上頜竇內(nèi)側(cè)部分，且無惡變?yōu)門2期；腫瘤主要在上頜竇，蝶竇和(或)額竇，同時(shí)可能累積鼻腔或篩竇，無惡變?yōu)門3期；腫瘤累及超出鼻竇或鼻腔范圍，例如翼腭窩、顱內(nèi)或眼眶等，出現(xiàn)惡變?yōu)門4期]；手術(shù)前后所有患者均未接受過非甾體抗炎藥物治療和放化療；病例資料完整；對(duì)本研究知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并鼻咽癌或其他癌癥者；合并嚴(yán)重重要器官功能障礙者；不同意進(jìn)行組織檢查者；年齡>80歲；合并缺氧性疾病者；中途退出或不配合隨訪者。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。80例鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤患者中男46例，女34例；年齡34～76歲，平均(56.36±6.32)歲。另選取20例同期來我院體檢的健康志愿者鼻腔黏膜組織作為對(duì)照組，其中男11例，女9例；年齡35～73歲，平均(55.63±5.27)歲。

1.2 研究方法 取80例患者的鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤組織和對(duì)照組志愿者的鼻腔黏膜組織進(jìn)行切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)組織的MACC1和p-IRE1表達(dá)水平，具體方法為：組織切片應(yīng)用梯度乙醇脫水和二甲苯脫蠟之后，應(yīng)用枸櫞酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原熱修復(fù)，并放置在體積分?jǐn)?shù)為3%的雙氧水10 min，溫度為37 ℃，將內(nèi)源性過氧化物酶滅活，并應(yīng)用PBS進(jìn)行漂洗3次，每次5 min；應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)為20%的正常羊血清進(jìn)行室溫孵育，時(shí)間為15 min，封閉非特異性抗原，隨后用濾紙將多余封閉液吸取，滴入由博士德生物工程有限公司提供的MACC1和p-IRE1抗體，放置在4 ℃的冰箱內(nèi)，孵育過夜。將切片放置在PBS中震蕩漂洗3次，每次15 min，注意動(dòng)作要輕柔。隨后將組織周圍的液體擦干后滴入生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫孵育30 min后進(jìn)行漂洗，再應(yīng)用鏈霉素卵白素工作液孵育15 min，再次漂洗，應(yīng)用H2O2或DAB進(jìn)行染色，4～10 min后，進(jìn)行漂洗，隨后封片保存。并在光鏡下進(jìn)行觀察，光鏡倍數(shù)為400倍，其中陽性細(xì)胞為棕黃色顆粒，分別計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)與陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MACC1和p-IRE1陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)率平均值。

對(duì)80例鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤患者在治療3年后進(jìn)行門診復(fù)查隨訪，其中包括血液生化檢查、骨掃描，腹部B超、胸部CT、頸部+鼻腔鼻竇MRI、體格檢查來綜合判定患者預(yù)后情況，將出現(xiàn)鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤復(fù)發(fā)或癌變者分為預(yù)后不良組，將其他患者分為預(yù)后良好組。收集所有患者一般資料，包括性別、年齡、臨床分期、是否初發(fā)、組織分化程度等。并搜集所有患者鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤組織MACC1和p-IRE1表達(dá)水平，具體免疫組化法同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，行χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)；采用Logistic回歸分析單因素指標(biāo)與預(yù)后的關(guān)系；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料及MACC1和p-IRE1表達(dá)情況對(duì)比 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組患者性別、年齡、是否初發(fā)情況對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，兩組患者臨床分期、組織分化程度、MACC1和p-IRE1陽性情況對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般資料與臨床指標(biāo)對(duì)比[例(%)]

2.2 不同臨床分期患者M(jìn)ACC1和p-IRE1表達(dá)情況對(duì)比 不同臨床分期患者M(jìn)ACC1和p-IRE1組織表達(dá)情況對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，T4組明顯高于T3組、T2組、T1組和對(duì)照組(均P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床分期患者M(jìn)ACC1和p-IRE1表達(dá)情況對(duì)比(例)

2.3 MACC1和p-IRE1表達(dá)情況與臨床分期的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示MACC1和p-IRE1與鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤臨床分期呈正相關(guān)(r=0.423、0.539，均P<0.05)，見表3。

表3 MACC1和p-IRE1表達(dá)情況與臨床分期的相關(guān)性

2.4 鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤組織MACC1和p-IRE1表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)：MACC1和p-IRE1為鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤的預(yù)后獨(dú)立因素(均P<0.05)，見表4。

表4 鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤組織MACC1和p-IRE1表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

SNIP的主要特點(diǎn)為局部侵襲強(qiáng)、術(shù)后復(fù)發(fā)率高，因此很容易發(fā)展為鱗狀細(xì)胞癌，危險(xiǎn)性較高，臨床診斷較為復(fù)雜。SNIP雖然屬于良性上皮源性腫瘤，但它特有的生物學(xué)行為特征使多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其屬于交界性腫瘤的一種，臨床治療原則為徹底切除腫瘤，所以多以手術(shù)治療為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，因此早期診斷與預(yù)測(cè)SNIP的預(yù)后成為臨床研究熱點(diǎn)[7-9]。隨著SNIP組織內(nèi)蛋白檢測(cè)發(fā)展，越來越多學(xué)者認(rèn)為，通過SNIP組織內(nèi)相關(guān)基因和蛋白的檢測(cè)對(duì)于SNIP診斷與預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要價(jià)值。其中MACC1位于人7號(hào)染色體上，由2個(gè)羥基、SH3及ZU5結(jié)構(gòu)組成，其中MACC1總的2個(gè)羥基結(jié)構(gòu)內(nèi)的酪氨酸殘基會(huì)出現(xiàn)DNA損失，隨后導(dǎo)致殘基出現(xiàn)磷酸化，促使信號(hào)傳導(dǎo)通路呈現(xiàn)級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)，造成細(xì)胞無限制分裂，最終腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。研究[10-12]發(fā)現(xiàn)，正常組織中MACC1蛋白多為低表達(dá)或不表達(dá)，而在肺癌、胃癌、肝癌等多種惡性實(shí)體腫瘤呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，且腫瘤遷移發(fā)生率較高。IRE1是一種蘇氨酸或絲氨酸蛋白酶，可感受未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管蓄積情況，進(jìn)而改變相應(yīng)激酶結(jié)構(gòu)，隨后磷酸化導(dǎo)致p-IRE1的增加，發(fā)生下游生物學(xué)效應(yīng)。研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，IRE1在乳腺癌、宮頸癌等組織表達(dá)過高，且與臨床分期存在一定相關(guān)性。因此，本研究主要分析MACC1和p-IRE1在SNIP組織中的表達(dá)及其與臨床分期的關(guān)系，希望能夠?yàn)镾NIP的診斷與治療提供參考。

本研究結(jié)果表明，不同臨床分期患者M(jìn)ACC1和p-IRE1組織表達(dá)水平對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，T4組明顯高于T3組、T2組、T1組和對(duì)照組，由此證明，SNIP臨床分期越高，疾病越嚴(yán)重，則MACC1和p-IRE1陽性表達(dá)率越高，與張貴等[15]研究相似。張貴等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MACC1和p-IRE1水平與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)系。這主要是因?yàn)?，MACC1可通過對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征所產(chǎn)生的影響來提升腫瘤細(xì)胞變形能力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)于鄰近的鼻黏膜組織產(chǎn)生浸潤。另外，MACC1上升還能夠?qū)е录?xì)胞間質(zhì)成分分解，從而為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供有利條件。p-IRE1屬于磷酸化需醇激酶的一種，可通過對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊錯(cuò)誤產(chǎn)生影響的同時(shí)，導(dǎo)致機(jī)體腫瘤細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄基因NF-κB激活，促使腫瘤細(xì)胞DNA出現(xiàn)持續(xù)性增殖的過程[16]。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示MACC1和p-IRE1與SNIP臨床分期呈正相關(guān)。提示MACC1和p-IRE1組織表達(dá)水平越高，SNIP臨床分期越高。Lin等[17]研究發(fā)現(xiàn)，MACC1基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌的臨床分期呈正相關(guān)。Kobelt等[18]研究發(fā)現(xiàn)，新確定的MEK-1酪氨酸磷酸化靶點(diǎn)MACC1可通過批準(zhǔn)的MEK-1抑制劑進(jìn)行藥物治療，以限制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移，與本研究結(jié)果相符。另外，童晶濤等[19]也研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌癌組織中需肌醇酶1蛋白表達(dá)水平與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展呈明顯相關(guān)性。本研究預(yù)后良好組與預(yù)后不良組患者性別、年齡、是否初發(fā)情況對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組患者臨床分期、組織分化程度、MACC1和p-IRE1陽性情況對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)：MACC1和p-IRE1為SNIP的預(yù)后獨(dú)立因素。因此，臨床可考慮應(yīng)用MACC1和p-IRE1表達(dá)水平來對(duì)SNIP的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。這主要是因?yàn)?，MACC1表達(dá)上升能夠提升腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，而p-IRE1上升會(huì)提升NF-κB激活程度，促進(jìn)下游核轉(zhuǎn)錄因子激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[20]。

綜上所述，SNIP組織中MACC1和p-IRE1陽性表達(dá)率明顯高于健康鼻腔黏膜組織，且MACC1和p-IRE1表達(dá)水平與SNIP的臨床分期呈正相關(guān)。另外，可通過MACC1和p-IRE1陽性表達(dá)來預(yù)測(cè)SNIP患者的預(yù)后情況，且MACC1和p-IRE1為SNIP的預(yù)后獨(dú)立因素。