袁宇涵，王巖，金澤林，張亮，王亮，劉云國(guó)*

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2.臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000；3.臨沂小魯生物科技有限公司，山東 臨沂 276000)

臭咸雞蛋作為一種傳統(tǒng)的發(fā)酵蛋制品，產(chǎn)地主要集中在我國(guó)北京、山東等地。由于其獨(dú)特的風(fēng)味以及易于攜帶、食用方便的特點(diǎn)，臭咸雞蛋深受老百姓的喜愛。臭咸雞蛋與臭豆腐、臭鱖魚等特色小吃有異曲同工之妙，都是通過自然發(fā)酵與時(shí)間相結(jié)合而產(chǎn)生的美味，吃后讓人流連忘返、回味無窮[1]。臭咸雞蛋主要是通過鹽、堿等不同輔料加工腌制處理而成，然而其生產(chǎn)方式目前只有通過家庭式小作坊來進(jìn)行自然腌制，市場(chǎng)上還沒有形成生產(chǎn)臭咸雞蛋的產(chǎn)業(yè)鏈。隨著人們生活水平的日益提高，特色小吃逐漸引起人們的注意，為實(shí)現(xiàn)臭咸雞蛋的產(chǎn)業(yè)化，確定其發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種，從而闡述優(yōu)勢(shì)微生物與風(fēng)味之間的發(fā)展關(guān)系變得至關(guān)重要。

發(fā)酵食品通常是由原料本身及環(huán)境微生物的共同作用來賦予其獨(dú)特的風(fēng)味[2]，風(fēng)味是發(fā)酵食品的一個(gè)非常重要的質(zhì)量屬性，它關(guān)系到消費(fèi)者的接受程度，微生物群落在發(fā)酵過程中對(duì)形成風(fēng)味物質(zhì)起著至關(guān)重要的作用[3-4]。研究表明，在發(fā)酵過程中，許多微生物(乳桿菌、芽孢桿菌、葡萄球菌、魏斯氏菌)會(huì)在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的風(fēng)味成分[5-8]。高通量測(cè)序是一種不依賴培養(yǎng)的新型方法，已成為表征微生物群落的α和β多樣性的主要方法[9]，該方法結(jié)合基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，能夠同時(shí)檢測(cè)優(yōu)勢(shì)種屬、稀有種屬和部分未知種屬，揭示微生物群落構(gòu)成，并對(duì)優(yōu)勢(shì)物種進(jìn)行差異分析[10]。因此，本研究采用高通量測(cè)序來揭示發(fā)酵臭咸雞蛋與發(fā)酵液中的微生物群落，分析了原料微生物與環(huán)境微生物的相關(guān)性，這些發(fā)現(xiàn)可能為改善臭咸雞蛋的風(fēng)味和整體質(zhì)量提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵臭咸雞蛋由中國(guó)山東濰坊地區(qū)農(nóng)戶家庭自行腌制，并運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室。在無菌條件下，取臭咸雞蛋樣品與發(fā)酵液樣品，分別編號(hào)為egg-1、egg-2、souse-1，并放置于-20 ℃冰箱中保藏備用。

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit：Omega公司；Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒:Life公司；2×Hieff?Robust PCR Master Mix、Hieff NGS?DNA Selection Beads:Yeasen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21臺(tái)式離心機(jī) Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器 深圳拓能達(dá)科技有限公司；電泳儀 北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司；Q32866 Qubit 3.0熒光計(jì) Invitrogen公司；ETC811 PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；Research Plus 0.5～10 μL移液器 Eppendorf公司。

1.3 DNA的提取

采用Omega E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒提取基因組 DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，利用Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)DNA樣本濃度。

1.4 擴(kuò)增及測(cè)序

以稀釋后的基因組DNA為模板，采用特異性引物341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACT-ACHVGGGTATCTAATCC)擴(kuò)增16S基因的V3～V4區(qū)序列，采用引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGG-AAGTAA)和ITS2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)擴(kuò)增ITS1和ITS2序列。經(jīng)過兩輪擴(kuò)增后用1×TAE濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)文庫(kù)大小，文庫(kù)濃度測(cè)定在Qubit 3.0熒光定量?jī)x上進(jìn)行，最后由生工生物工程(上海)股份有限公司在Illumina MiSeq平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種豐富度和多樣性

2.1.1 細(xì)菌豐富度與多樣性

從3個(gè)樣品中共獲得了153 911條原始序列，見表1。經(jīng)過濾后，共獲得123 713條高質(zhì)量有效序列。所有樣本的覆蓋率至少為99.9%，表明測(cè)序樣本中幾乎所有的細(xì)菌都可以被檢測(cè)到。在3個(gè)樣本中，觀察到的OTUs數(shù)量為65～94個(gè)，在發(fā)酵液中樣品達(dá)到最高水平。采用Chao1指數(shù)測(cè)定各樣品的細(xì)菌群落豐度， Shannon指數(shù)估算各樣品的細(xì)菌群落多樣性。顯然，兩個(gè)雞蛋的Chao1、Ace和Shannon指數(shù)均低于發(fā)酵液。由表1可知，雞蛋的Chao1值在72.5～90之間，發(fā)酵液的Chao1值為95.2。雞蛋的Shannon指數(shù)在1.473 721～1.433 256之間，發(fā)酵液的Shannon指數(shù)為2.084 914。3個(gè)指標(biāo)的變化表明，在發(fā)酵完全后，發(fā)酵液中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性明顯高于egg-1、egg-2，表1顯示了每個(gè)樣品的分析讀數(shù)。稀釋曲線趨于平坦，反映了測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性，見圖1中a。

表1 16S rDNA測(cè)序α多樣性分析Table 1 α diversity analysis for 16S rDNA sequencing

2.1.2 真菌豐富度與多樣性

從3個(gè)樣品中共獲得了215 834條原始序列，經(jīng)過濾后，共獲得155 133條高質(zhì)量有效序列，見表2。所有樣本的覆蓋率均在99.9%以上，說明測(cè)序結(jié)果可靠，樣品中的序列幾乎全部被檢測(cè)出。值得注意的是，發(fā)酵液真菌的Ace、Chao1、Shannon指數(shù)均明顯高于細(xì)菌，說明發(fā)酵液中真菌群落的豐富度和多樣性明顯高于細(xì)菌群落。隨著測(cè)序條數(shù)的增加，曲線逐漸趨于平緩，說明測(cè)序數(shù)據(jù)合理，可真實(shí)反映真菌群落的多樣性，見圖1中b。

表2 ITS測(cè)序α多樣性分析Table 2 α diversity analysis for ITS sequencing

圖1 稀釋曲線

2.2 微生物群落組成

采用擴(kuò)增子測(cè)序方法進(jìn)行分析。由圖2可知，在3個(gè)樣品中共鑒定出7個(gè)細(xì)菌門，其中相對(duì)豐度>0.1%的有放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)。其中egg-1、egg-2中厚壁菌門相對(duì)豐度高達(dá)91.44%和94.83%，變形菌門相對(duì)豐度為7.72%和4.24%，其余細(xì)菌門相對(duì)豐度總值不及1%。但在發(fā)酵液中，變形菌門為優(yōu)勢(shì)類群，相對(duì)豐度為63.71%，厚壁菌門則占30.06%。厚壁菌門和變形菌門是雞蛋及其發(fā)酵液中的兩個(gè)主要微生物菌群，其相對(duì)豐度在93%以上。

圖2 門水平上各樣品中細(xì)菌群落的相對(duì)豐度和組成Fig.2 Relative abundance and composition of bacterial community in various samples at the level of phylum

圖3 屬水平上各樣品中細(xì)菌群落的相對(duì)豐度和組成Fig.3 Relative abundance and composition of bacterial community in various samples at the level of genus

圖4 門水平上各樣品中真菌群落的相對(duì)豐度和組成Fig.4 Relative abundance and composition of fungal community in various samples at the level of phylum

圖5 屬水平上各樣品中真菌群落的相對(duì)豐度和組成Fig.5 Relative abundance and composition of fungal community in various samples at the level of genus

在屬水平上，雞蛋與發(fā)酵液菌群種類與豐度差異較大，在不同樣品中共鑒定出79個(gè)屬。由圖3可知，雞蛋中主要優(yōu)勢(shì)屬為鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)，在egg-1和egg-2中相對(duì)豐度分別達(dá)到69.51%和54.24%，而在發(fā)酵液中則為14.97%。與雞蛋相比，發(fā)酵液中鹽厭氧菌屬的含量明顯降低。鹽厭氧菌屬是一類嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌[11]，在發(fā)酵后期，雞蛋內(nèi)環(huán)境屬于厭氧發(fā)酵狀態(tài)，有利于鹽厭氧菌屬的大量繁殖，而發(fā)酵液環(huán)境復(fù)雜，可能對(duì)其產(chǎn)生了限制。已有文獻(xiàn)證明鹽厭氧菌屬在傳統(tǒng)腐乳、蝦醬、魚露的發(fā)酵過程中起著巨大的作用[12-14]。雞蛋中第二大優(yōu)勢(shì)菌群為海藻乳酸菌(Marinilactibacillus)，相對(duì)豐度分別為17.8%和37.04%，作為嗜鹽嗜堿乳酸菌，海藻乳酸菌廣泛分布在環(huán)境、腌制肉制品與乳制品中[15-17]，值得注意的是，在發(fā)酵液中海藻乳酸菌相對(duì)豐度僅有0.06%。腸桿菌屬是常見的致病菌屬[18]，在本次研究中，egg-1和egg-2中均檢測(cè)到腸桿菌屬(Enterobacter)，而在發(fā)酵液中幾乎沒有檢測(cè)到。相對(duì)于發(fā)酵液來說，雞蛋中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，腸桿菌屬細(xì)菌更易通過氧化多種簡(jiǎn)單有機(jī)化合物或發(fā)酵糖、有機(jī)酸或多元醇來獲取能量，因此，在發(fā)酵過程中對(duì)于時(shí)間的把控要格外注意，不僅追求質(zhì)量的提升，更要注意健康和安全。在發(fā)酵液中鹽單胞菌屬(Halomonas)為優(yōu)勢(shì)屬，相對(duì)豐度為47.17%，據(jù)報(bào)道，鹽單胞菌屬?gòu)V泛存在于水體環(huán)境中，這與我們的研究結(jié)果一致[19-20]。海桿菌屬(Marinobacter)在雞蛋中相對(duì)豐度極低，而在發(fā)酵液中作為第三大優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度為14.27%。泰式菌屬(Tissierella)主要存在于人體胃腸道與動(dòng)物糞便中[21]，在egg-1、egg-2中均沒有檢測(cè)出，是發(fā)酵液中特有的細(xì)菌群落，約占9.11%。

由圖4可知，ITS 測(cè)序分析表明，在真菌門水平上，共鑒定出8個(gè)真菌門，值得注意的是，3個(gè)樣品中子囊菌門(Ascomycota)均具有極高的相對(duì)豐度，其中egg-1中相對(duì)豐度最高，占97.37%。擔(dān)子菌門(Basidiomycota)雖然作為第二大真菌群落，但在3個(gè)樣品中最高也僅有5.47%，發(fā)酵液中擔(dān)子菌門相對(duì)豐度略高于egg-1、egg-2。

在屬水平上，共鑒定出118個(gè)屬，由圖5可知，發(fā)酵液真菌群落的豐富度和均勻度明顯高于egg-1、egg-2。3組樣品中占優(yōu)勢(shì)的主要是帚枝霉屬(Sarocladium)，但相對(duì)豐度有所差異，在41.15%～70.89%之間，帚枝霉屬是一種常見的內(nèi)生菌，直到最近才被認(rèn)為與部分腐敗疾病的引起是低相關(guān)性的[22]，并且具有一定的生物防治潛力，可以作為一種有效的抗致病菌生物防治劑[23]。邁耶氏酵母屬(Meyerozyma)在3個(gè)樣品中均存在，但egg-1略高于egg-2和發(fā)酵液。發(fā)酵液中有孢圓酵母屬(Torulaspora)相對(duì)豐度為9.61%，而在egg-1中僅有0.27%，研究表明，酵母可以直接利用葡萄糖、果糖發(fā)酵，經(jīng)歷一系列復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，這也是產(chǎn)生臭咸雞蛋特有氣味的原因之一。節(jié)菱孢屬(Arthrinium)和耐干霉菌屬(Xeromyces)是發(fā)酵液中獨(dú)特的微生物群落，在其余兩個(gè)樣品中均未檢測(cè)到。

圖6 微生物群落熱圖Fig.6 Heat map of microbial community

由圖6可知，熱圖顯示了3個(gè)樣品微生物群落組成和動(dòng)態(tài)的差異，相對(duì)豐度用從淺色(最低相對(duì)豐度)到深色(最高相對(duì)豐度)的顏色強(qiáng)度來表示。綜上所述，主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌鹽厭氧菌屬在3個(gè)樣品中均大量存在。發(fā)酵液中鹽單胞菌屬、海桿菌屬、泰式菌屬相對(duì)豐度顯著高于雞蛋。對(duì)于真菌來說，帚枝霉屬、有孢圓酵母屬、邁耶氏酵母屬在3個(gè)樣品中均具有較高的相對(duì)豐度。而畢赤酵母屬、威克漢姆酵母屬、被孢霉屬、節(jié)菱孢屬、耐干霉菌屬和枝孢屬在發(fā)酵液中表現(xiàn)出比egg-1、egg-2高的相對(duì)豐度。

3 結(jié)論

本研究評(píng)價(jià)了發(fā)酵臭咸雞蛋與發(fā)酵液中微生物群落動(dòng)態(tài)變化。高通量測(cè)序分析結(jié)果顯示，在egg-1、egg-2中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有鹽厭氧菌屬、海藻乳酸菌，其中鹽厭氧菌屬占有極高的相對(duì)豐度，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬。優(yōu)勢(shì)真菌屬有帚枝霉屬、邁耶氏酵母屬和有孢圓酵母屬。在發(fā)酵液中鹽單胞菌屬為最優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，海桿菌屬、泰式菌屬為其特有細(xì)菌屬。邁耶氏酵母屬、有孢圓酵母屬、畢赤酵母屬、被孢霉屬、節(jié)菱孢屬、耐干霉菌屬在發(fā)酵液中均具有一定的相對(duì)豐度，說明發(fā)酵液中微生物分布較均勻。這些結(jié)果為后續(xù)發(fā)酵臭咸雞蛋標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的工業(yè)生產(chǎn)鏈及發(fā)酵用菌的篩選提供了數(shù)據(jù)支持，并有必要進(jìn)一步將基因組學(xué)和代謝組學(xué)結(jié)合起來，分析發(fā)酵特征與代謝途徑之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討發(fā)酵機(jī)制。