李澤林，沈晉如，方敏瑞，趙春燕，范江平，沈曉靜,2，3*，鄭婷婷

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.昆明醫(yī)科大學(xué) 云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，昆明 650201；4.普洱茶研究院，云南 普洱 665099)

山荊子(Malusbaccata(L.) Borkh.)又叫山丁子、林荊子、山定子和海棠果，是薔薇科蘋(píng)果屬多年生木本植物，主要分布于朝鮮、俄羅斯及我國(guó)東北、華北、西南等地區(qū)[1-2]。山荊子果實(shí)含有表兒茶素、花青素等活性成分，可用于緩解兒童排尿困難、關(guān)節(jié)疼痛和炎癥等癥狀[3]。成熟的山荊子鮮果具有酸甜適中的獨(dú)特風(fēng)味以及含有大量的果膠多糖類(lèi)物質(zhì)[4]，其常被用來(lái)制作糕點(diǎn)、飲料、果酒等食品。周慧等[5]聯(lián)用均勻設(shè)計(jì)和模糊數(shù)學(xué)方法，優(yōu)化了茯苓山荊子果糕的加工工藝。童觀珍等[6]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了山荊子果汁飲料配方。高志霞等[7]采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了山荊子葡萄復(fù)合果酒工藝。這些對(duì)山荊子食品的開(kāi)發(fā)研究促進(jìn)了山荊子的綜合利用。但對(duì)山荊子果膠的提取研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

果膠是一類(lèi)以D-半乳糖醛酸為主要組成成分的酸性雜多糖。因果膠具有綠色天然、無(wú)毒環(huán)保的特點(diǎn)被廣泛用于食品生產(chǎn)加工[8]。另外，果膠溶液黏度比低、流動(dòng)性好，1%果膠溶液具有假塑性流體的部分特性以及良好的膠凝度，也常被作為功能性食品添加劑用于改善加工食品和調(diào)味制品的外觀、組織、口感以及生物利用度[9-10]。目前，果膠被廣泛應(yīng)用于果醬、醬料、面包、飲品、果凍、軟糖等產(chǎn)品中[11]。

超聲輔助酶法提取技術(shù)具有提取時(shí)間短、提取率高、成本低、低溫保護(hù)熱敏性成分等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物基果膠的提取[12]。本實(shí)驗(yàn)擬采用響應(yīng)面法優(yōu)化山荊子果膠的超聲輔助纖維素酶提取工藝，并檢測(cè)其總糖含量、酯化度、乙酰化度等指標(biāo)，再采用傅里葉紅外光譜表征其組成，旨在為麗江山荊子果膠的綜合開(kāi)發(fā)利用以及結(jié)構(gòu)初探提供一定的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麗江山荊子鮮果：云南省麗江市；纖維素酶(10 000 U/g)：瑪雅試劑有限公司；透析袋MD34(7 000 D)：上海源葉生物科技有限公司；AB-8大孔樹(shù)脂：河北美凱化工有限公司；三氯甲烷(AR)：重慶川東化工有限公司；正丁醇(AR)：廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

SCIENTZ-48高通量組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；H3-18K臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SCQ-9201B超聲波提取儀 上海聲彥超聲波儀器有限公司。

1.3 果膠提取方法

將采自云南麗江的山荊子鮮果去除果葉、果柄和果核后清洗干凈，于55 ℃烘箱中烘干至含水率低于5%，粉碎，過(guò)80目篩，備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取20 g果粉和果粉質(zhì)量3%的纖維素酶，用500 mL純水充分溶解并調(diào)節(jié)pH至4.5后于55 ℃酶解90 min，沸水滅酶5 min，超聲25 min，過(guò)濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/3，得到果膠提取液。加入等體積的乙醇，混勻，于4 ℃冰箱中過(guò)夜后離心(5 000 r/min)去上清液，將剩余固體真空冷凍干燥后得到粗果膠，并按照下式計(jì)算果膠提取率：

式中：m為干燥后粗果膠質(zhì)量；m0為山荊子果粉質(zhì)量。

1.4 果膠提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 超聲時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響

考察超聲時(shí)間對(duì)山荊子果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量1.15%、pH 4.5、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間2 h、超聲溫度55 ℃和料液比1∶18，設(shè)置超聲時(shí)間分別為10，15，20，25，30 min，對(duì)山荊子果膠進(jìn)行提取，計(jì)算果膠提取率。

1.4.2 酶解時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響

考察酶解時(shí)間對(duì)山荊子果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量1.15%、pH 4.5、酶解溫度55 ℃、超聲溫度55 ℃、超聲時(shí)間25 min和料液比1∶18，設(shè)置酶解時(shí)間分別為1，1.5，2，2.5，3 h，對(duì)山荊子果膠進(jìn)行提取，計(jì)算果膠提取率。

1.4.3 酶添加量對(duì)果膠提取率的影響

考察酶添加量對(duì)山荊子果膠提取率的影響：固定pH 4.5、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間1.5 h、超聲溫度55 ℃、超聲時(shí)間25 min和料液比1∶18，設(shè)置酶添加量分別為果粉的1%、1.5%、2%、2.5%、3%，對(duì)山荊子果膠進(jìn)行提取，計(jì)算果膠提取率。

1.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，并以果膠提取率為響應(yīng)指標(biāo)(%)，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.6 理化指標(biāo)檢測(cè)

參考李曉娟等[13]的苯酚-硫酸法測(cè)定果膠的總糖含量；參考Kaya等[14]的福林酚比色法測(cè)定果膠的多酚含量；參考Patience等[15]的考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定果膠的蛋白質(zhì)含量；參照國(guó)標(biāo)GB 5009.3—2016中的直接干燥法測(cè)定純化果膠的水分含量；參考Chen等[16]的皂化滴定度法測(cè)定果膠的酯化度；參考Shivamathi等[17]的化學(xué)滴定法測(cè)定果膠的乙酰化度。

1.7 紅外光譜檢測(cè)

準(zhǔn)確稱(chēng)取果膠樣品1 mg，采用KBr壓片法進(jìn)行檢測(cè)，在500～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析；每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果求平均值并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 不同超聲時(shí)間對(duì)山荊子果膠提取率的影響

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of single factor experiments

超聲時(shí)間對(duì)山荊子果膠提取率的影響見(jiàn)圖1中a。在不同超聲時(shí)間的影響下，果膠提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí)，果膠提取率最高，為(5.93±0.13)%。當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)25 min時(shí)，果膠提取率呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槌暡ň哂袕?qiáng)力的機(jī)械切割作用，長(zhǎng)時(shí)間的作用可能使果膠被破壞，從而減少提取率。所以，選擇超聲時(shí)間25 min為最優(yōu)值。

2.1.2 不同酶解時(shí)間對(duì)山荊子果膠提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)山荊子果膠提取率的影響見(jiàn)圖1中b。在不同酶解時(shí)間的影響下，在1.0～1.5 h內(nèi)隨著時(shí)間的增加果膠提取率逐漸增大，當(dāng)酶解時(shí)間為1.5 h時(shí)，果膠提取率最高，為(8.85±0.26)%。當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)1.5 h時(shí)，纖維素酶已經(jīng)充分作用，果膠溶出量不再增加，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，部分水溶性果膠水解以及超聲的空化作用破壞了果膠結(jié)構(gòu),導(dǎo)致提取率降低。所以，選擇酶解時(shí)間1.5 h為最優(yōu)值。

2.1.3 不同酶添加量對(duì)山荊子果膠提取率的影響

酶解液中纖維素酶添加量對(duì)果膠提取率的影響見(jiàn)圖1中c。在纖維素酶添加量為1.0%～2.5%時(shí)，果膠提取率隨著纖維素酶添加量的增加而上升，提取率達(dá)到最大值(13.60±0.16)%時(shí)所需酶添加量為2.5%；當(dāng)纖維素酶添加量為2.5%～3.0%時(shí)，隨著纖維素酶添加量的增加，果膠提取率反而下降。原因可能是當(dāng)纖維素添加量過(guò)多時(shí)，酶解液濃度過(guò)高，這些酶出現(xiàn)過(guò)飽和而相互附著的“抱團(tuán)”現(xiàn)象，降低了整體的活性，影響了果膠的提取。所以，選擇酶添加量2.5%為最優(yōu)值。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

果膠提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 3 Regression statistical analysis results

續(xù) 表

由表3回歸分析和方差分析可知，該回歸模型是顯著的(P<0.05)。在各響應(yīng)因素中，一次項(xiàng)C(酶添加量)的P<0.01，表明該因素對(duì)果膠得率有極顯著影響。二次項(xiàng)A2的P<0.05，表明超聲時(shí)間對(duì)果膠提取率有顯著影響。

模型的失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說(shuō)明實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間無(wú)失擬存在，方程擬合性好，實(shí)驗(yàn)誤差小。根據(jù)各因素顯著水平，結(jié)合F值大小可以判斷，各單因素對(duì)果膠提取率影響程度的主次順序?yàn)镃(酶添加量)>B(酶解時(shí)間)>A(超聲時(shí)間)。以超聲時(shí)間(A)、酶解時(shí)間(B)、酶添加量(C)為自變量，以山荊子果膠得率為因變量，對(duì)各組合處理得到的果膠得率進(jìn)行二次回歸分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：果膠提取率=13.22-0.33A+1.49B+3.86C-0.28AB-0.77AC-2.71BC-3.14A2-1.28B2+0.31C2。

2.2.2 交互作用分析

圖2 各因素交互作用對(duì)果膠提取率影響的三維曲面和等高線(xiàn)Fig.2 Three-dimensional surface diagrams and contour lines of the effects of interaction of various factors on the extraction yield of pectin

響應(yīng)面圖的弧度與等高線(xiàn)的密集程度反映了各因素作用的大小。各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響可通過(guò)等高線(xiàn)直觀地反映出來(lái)，等高線(xiàn)的形狀可以反映出各因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，等高線(xiàn)為橢圓形表明兩因素的交互作用對(duì)果膠提取率的影響作用顯著，當(dāng)?shù)雀呔€(xiàn)呈圓形時(shí)，則表明兩因素的交互作用不顯著[18-19]。由圖2中a可知，超聲時(shí)間A和酶解時(shí)間B的交互作用響應(yīng)面圖呈現(xiàn)了果膠提取率先增大后減小的趨勢(shì)，說(shuō)明兩者對(duì)果膠提取率有影響，但是等高線(xiàn)呈圓形，說(shuō)明兩者的交互作用無(wú)顯著差異。由圖2中b和c可知，響應(yīng)曲面圖較陡峭，由圖形弧度及等高線(xiàn)密度可知纖維素酶添加量對(duì)果膠提取率的影響比酶解時(shí)間和超聲時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響大，但是沒(méi)有顯著差異。交互作用分析結(jié)果與方差分析表中的結(jié)果相一致。

2.2.3 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)與模型驗(yàn)證

根據(jù)以上模型得到最佳提取工藝條件：超聲時(shí)間24.23 min，酶解時(shí)間1.27 h，纖維素酶添加量3%，理論上得到山荊子果膠提取率為17.75%。在此條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到實(shí)際的山荊子粗果膠提取率為(17.70±0.28)%，與模型理論值相接近且無(wú)顯著差異，證明該數(shù)學(xué)模型優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)具有可行性和重現(xiàn)性。

2.3 山荊子果膠理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

進(jìn)一步對(duì)山荊子果膠的理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。使用超聲輔助酶法提取的山荊子果膠總糖和多酚含量較高，分別達(dá)到了(78.59±3.76)%和(26.10±0.11)%；但是，其蛋白質(zhì)含量和含水量較低，僅為(0.20±0.07)%和(3.71±0.07)%。此外，從山荊子果膠中檢測(cè)到酯化度和乙?；确謩e為(65.00±0.04)%和(15.83±0.13)%。這些結(jié)果說(shuō)明該方法提取的果膠是高酯果膠并且具有一定的純度，但是還可以進(jìn)一步純化。

表4 山荊子精果膠理化指標(biāo)Table 4 Physicochemica lindexes of pectin from Malus baccata (L.) Borkh.

2.4 紅外光譜結(jié)果分析

圖3 山荊子果膠的FT-IR

3 結(jié)論

本研究采用超聲輔助酶法提取山荊子果膠工藝，最佳提取條件為超聲時(shí)間24.23 min，纖維酶添加量3%，酶解時(shí)間1.27 h，山荊子果膠實(shí)際提取率為(17.70±0.28)%；使用超聲輔助酶法提取的山荊子果膠總糖和多酚含量較高，分別達(dá)到了(78.59±3.76)%和(26.10±0.11)%，蛋白質(zhì)含量較低，為(0.20±0.07)%；此外，紅外光譜顯示山荊子果膠是一類(lèi)含有典型多糖結(jié)構(gòu)的高酯果膠。本研究可為云南麗江山荊子的綜合利用和其果膠結(jié)構(gòu)特性研究提供前期基礎(chǔ)和理論依據(jù)。