郝琴琴，任 靜，成俊麗，朱芷葳，許冬梅，賈雪純，李鵬飛

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

西門塔爾牛是目前我國廣泛的大型乳肉兼用品種，具有產(chǎn)奶量高、適應(yīng)性強(qiáng)和繁殖率高等優(yōu)點(diǎn)[1]。自引進(jìn)以來，西門塔爾牛對(duì)本地黃牛改良效果顯著，目前已形成我國西門塔爾牛各品系。在集約化養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，有角西門塔爾牛易對(duì)飼養(yǎng)人員造成傷害，同時(shí)牛角也降低牛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用程度[2-3]。因此，培育西門塔爾牛無角品系具有一定的實(shí)際意義。

GEORGES等[4]利用微衛(wèi)星標(biāo)記首次將牛無角基 因 定 位 于 BTA1（Bovine chromosome 1）上 。DR?GEMüLLER等[5]進(jìn)一步將控制該性狀的基因（突變位點(diǎn)）定位到BTA1上1 Mb區(qū)域內(nèi)。MEDUGORAC等[6]利用高密度基因芯片對(duì)夏洛萊、西門塔爾、荷斯坦等多個(gè)品種的無角性狀進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該性狀由6個(gè)位點(diǎn)控制，其中，荷斯坦牛的無角性狀是由PF基因內(nèi)P5ID、PG1654405A、PC1655463T、PC1768587A、P80kbⅡ等 5 個(gè)緊密連鎖的 SNP 位點(diǎn)所控制；西門塔爾等其他品種的無角性狀大多由P202ID位點(diǎn)控制，該位點(diǎn)是由BTA1上與PC基因緊密連鎖的IFNAR2和OLIG1間一個(gè)202 bp的插入缺失突變所導(dǎo)致。ASAI等[7]研究表明，一些控制牛無角性狀的基因座還存在于BTA19，但目前只在夏洛萊牛中可檢測(cè)到，其精細(xì)定位情況和遺傳機(jī)制尚不清楚。近年來，研究人員通過對(duì)不同品種無角性狀突變位點(diǎn)的檢測(cè)和成因進(jìn)行分析，并已培育出一些無角新品系。尚嵩洋等[8]檢測(cè)了182頭無角遼育白牛和4頭夏洛萊牛P202ID和P219ID突變位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，93.96%的無角個(gè)體攜帶有P202ID位點(diǎn)，所有樣本中均未檢測(cè)出攜帶2種突變的個(gè)體，但無角夏洛萊牛則全部攜帶P202ID位點(diǎn)。谷明娟等[9]鑒定了48頭無角蒙古牛P219ID突變位點(diǎn)。CHEN等[10]對(duì)48頭無角和16頭有角的四川牛進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該群體中存在P202ID、P219ID和P80kbID等3個(gè)突變位點(diǎn)。對(duì)于引入我國的西門塔爾牛各品系，目前尚無控制其角性狀基因和突變位點(diǎn)的報(bào)道。

本研究采用PCR-測(cè)序技術(shù)對(duì)30頭西門塔爾種公牛和78頭種母牛的P202ID位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，并通過卡方檢驗(yàn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在對(duì)西門塔爾牛角性狀的遺傳規(guī)律進(jìn)行闡釋、探討西門塔爾牛角性狀的分子機(jī)制，為西門塔爾牛無角品系的培育提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

采集西門塔爾牛頸靜脈血（EDTA抗凝）108份（其中，鼎寶牧業(yè)有限公司24份，廣利養(yǎng)殖29份，全澤農(nóng)林牧專業(yè)合作社25份，天河牧業(yè)30份），無角安格斯牛頸靜脈血（EDTA抗凝）5份（天河牧業(yè)），置于-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取西門塔爾牛和安格斯牛全血DNA，采用核酸定量?jī)x（賽默飛世爾（中國）有限公司）檢測(cè)DNA樣品的濃度和純度。

1.2.2 PCR-測(cè)序 P202ID引物序列引用文獻(xiàn)[6]，具體序列如表1所示。PCR擴(kuò)增體系為12.5 μL：模板 DNA 1.0 μL，2×Reaction Mix 6.25 μL，上下游引物各 0.2 μL，ddH2O 4.85 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 40 s，59 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸 30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸 10 min。PCR產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 P202ID引物序列Tab.1 The primer sequence of P202ID

選取不同基因型樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠后回收，回收產(chǎn)物純化后連接至pGM-T載體（連接反應(yīng)體系為 10×T4 DNA Ligase Buffer 1.0 μL，T4 DNA Ligase 1.0 μL，pGM-T 載體 1.0 μL，連接反應(yīng) DNA 片段 3.0 μL，ddH2O 4.0 μL，16 ℃過夜連接），并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Top10（天根生化科技有限公司），將感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于含氨芐青霉素（Amp）的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取每種基因型3個(gè)白色陽性菌落進(jìn)行菌體PCR并測(cè)序（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所有檢測(cè)個(gè)體角性狀與P202ID突變位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，計(jì)算其PC基因和prs基因的基因頻率和基因型頻率；采用交叉表進(jìn)行卡方（χ2）獨(dú)立性檢驗(yàn)和顯著性分析。菌液測(cè)序結(jié)果采用MEGA 7.0和Chromas軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-測(cè)序結(jié)果

有角和無角個(gè)體的測(cè)序結(jié)果如圖1所示。

圖1 有角和無角個(gè)體的測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequencing results of horned and hornless individuals

提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)不同基因型個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠測(cè)序，結(jié)果顯示，野生型（有角）在369 bp處有一條擴(kuò)增帶，突變型（無角）在571 bp處有一條擴(kuò)增帶，雜合子（有角）則在571、369 bp處有2條擴(kuò)增帶。采用MEGA 7.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果表明，相比野生型，突變型PC基因內(nèi)可檢測(cè)出大小為202 bp的插入序列（圖1）。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2為103頭無角西門塔爾牛、5頭有角西門塔爾牛和5頭無角安格斯牛PC基因的擴(kuò)增結(jié)果，在103頭無角西門塔爾牛中可檢測(cè)到基因型為PC/PC的無角純合子以及基因型為PC/prs的有角雜合子。

如圖2所示，4頭無角西門塔爾牛為純合子（其中，公牛3頭、母牛1頭），82頭無角西門塔爾牛為雜合子（其中，公牛22頭、母牛60頭），17頭表型無角西門塔爾牛與5頭有角西門塔爾?；蛐鸵恢?，均為prs/prs，結(jié)合其培育歷史，推測(cè)這些樣本為去角牛。所檢測(cè)的108頭西門塔爾?；蛐团c其角性狀完全一致。

圖2 西門塔爾牛與安格斯牛PC基因P202ID位點(diǎn)的分子檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Molecular detection results of P202ID site of PC gene in Simmental cattle and Angus cattle

2.3 P202ID位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率

對(duì)西門塔爾牛PC基因中P202ID突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表2所示，無角基因（PC）頻率為0.416 6，有角基因（prs）頻率為0.583 4；純合無角牛PC/PC基因型頻率為0.037 0，雜合無角牛PC/prs基因型頻率為0.759 3，純合有角牛prs/prs基因型頻率為0.203 7。所檢測(cè)樣本中，共有79.63%的個(gè)體為無角牛，20.37%的個(gè)體為有角牛，結(jié)合基因型判斷，鑒定成功率為100%。對(duì)基因型與角性狀進(jìn)行卡方檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，P202ID位點(diǎn)的基因型與西門塔爾牛角性狀具有顯著關(guān)聯(lián)關(guān)系（χ2=20.49，P＜0.001）。因此，可利用P202ID位點(diǎn)鑒定西門塔爾牛有角與無角性狀。

表2 西門塔爾牛P202ID位點(diǎn)的PCR結(jié)果Tab.2 PCR results of P202ID site in Simmental cattle

3 結(jié)論與討論

角是牛的重要物種特征，也是其在自然界生存斗爭(zhēng)的主要工具[11-13]。在集約化飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，牛去角后攻擊性減弱且增質(zhì)量快，易于管理，但人工去角（如灼燒、腐蝕、切割等）會(huì)嚴(yán)重影響犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育并增加細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)[14]，而培育無角品系可避免上述危害。目前，多采用基因編輯技術(shù)獲得無角個(gè)體[15]，如大通無角牦牛[16]。CARLSON等[17]和TAN等[18]利用轉(zhuǎn)錄激活因子類效應(yīng)核酸酶（TALENs）技術(shù)將無角基因PC插入到有角荷斯坦牛胚胎成纖維細(xì)胞中，獲得無角荷斯坦牛。谷明娟等[19]采用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得穩(wěn)定整合P202ID位點(diǎn)的有角蒙古牛細(xì)胞系，為無角蒙古牛的培育提供材料。王歡[20]利用Tild-CRISPR/Cas9技術(shù)獲得PC/PC純合無角荷斯坦種公牛細(xì)胞系及其胚胎，為采用體細(xì)胞克隆技術(shù)培育無角荷斯坦種公牛奠定基礎(chǔ)。

本研究所檢測(cè)的108頭西門塔爾牛P202ID基因型與角性狀完全一致，鑒定成功率100%，此結(jié)果與WIEDEMAR等[21]報(bào)道一致?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，P202ID位點(diǎn)基因型與西門塔爾牛角性狀極顯著相關(guān)，證實(shí)了西門塔爾牛無角性狀是由PC基因的P202ID位點(diǎn)突變所致。P202ID基因首次發(fā)現(xiàn)于凱爾特牛[22]，除在無角西門塔爾牛中檢測(cè)到P202ID位點(diǎn)外，在蜀宣花牛、夏南牛、云嶺牛中均檢測(cè)到該位點(diǎn)。劉林海[23]對(duì)48頭蜀宣花牛的無角突變位點(diǎn)進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，39頭蜀宣花牛的無角表型與P202ID突變位點(diǎn)相關(guān)，結(jié)合其培育歷史，推測(cè)P202ID突變位點(diǎn)可能來源于引進(jìn)品種西門塔爾牛。在對(duì)113頭夏南牛[24]和269頭云嶺牛[25]無角性狀的研究中顯示，2個(gè)品種的P202ID突變位點(diǎn)均來源于夏洛萊牛，P202ID位點(diǎn)可用于我國西門塔爾牛及本地黃牛品種角性狀的鑒定。

目前，控制牛角性狀的POLLED位點(diǎn)已被廣泛研究，且通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，影響牛角發(fā)育的基 因 OLIG1、OLIG2、FOXL2、C1H21orf62 和RXFP2在有角和無角個(gè)體中表達(dá)量顯著不同[21]，但相關(guān)候選基因和信號(hào)通路仍未被完全闡明。相比微流控芯片、競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）、毛細(xì)管電泳等技術(shù)，PCR-測(cè)序技術(shù)具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏、成本低和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[26]。顏澤等[27]通過KASP和微流控芯片檢測(cè)出2頭德國西門塔爾牛中存在P202ID、PC1768587A和P80kbID等3個(gè)無角突變位點(diǎn)，并采用PCR-測(cè)序技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。WIEDEMAR等[21]在對(duì)歐洲西門塔爾牛進(jìn)行全基因組測(cè)序后，采用PCR-毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)該品種進(jìn)行角性狀鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)西門塔爾牛無角性狀由P202ID位點(diǎn)控制。

本研究采用PCR-測(cè)序技術(shù)對(duì)無角西門塔爾牛中P202ID位點(diǎn)進(jìn)行基因型鑒定，可為在西門塔爾群體中鑒定無角個(gè)體提供試驗(yàn)方法和依據(jù)，并為生產(chǎn)中培育無角西門塔爾牛品系奠定基礎(chǔ)。