馬曉燕，郭翔宇，賈凱琪，成 穎，呂麗華

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

在哺乳動(dòng)物生殖過(guò)程中，顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡在卵子發(fā)生、卵泡發(fā)育和閉鎖中起到至關(guān)重要的作用。卵泡發(fā)育是一個(gè)有序復(fù)雜的過(guò)程，受到下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，并呈現(xiàn)周期性變化[1-2]。生長(zhǎng)卵泡發(fā)育至有腔卵泡之前不依賴促性腺激素，有腔卵泡的發(fā)育則依賴促性腺激素的作用，同時(shí)受到卵母細(xì)胞—顆粒細(xì)胞—膜細(xì)胞三者的協(xié)同調(diào)控[3]。卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中卵母細(xì)胞以自分泌和旁分泌的方式與卵泡生態(tài)體系中的體細(xì)胞共同發(fā)揮作用，影響卵泡發(fā)育進(jìn)程，并決定其最終命運(yùn)。顆粒細(xì)胞是卵泡體系中數(shù)量最多的體細(xì)胞，在卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[4]。雌性哺乳動(dòng)物從早期胚胎性腺發(fā)育到性成熟過(guò)程中，大量卵泡閉鎖，調(diào)控卵泡閉鎖的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，調(diào)控過(guò)程中的些許偏差都會(huì)導(dǎo)致卵泡發(fā)育阻滯和閉鎖。雌性哺乳動(dòng)物在生命早期形成的卵巢儲(chǔ)備是相對(duì)固定的，卵子儲(chǔ)備量隨著動(dòng)物排卵而不斷減少。隨著生存環(huán)境的改變，越來(lái)越多的哺乳動(dòng)物包括人類都面臨著由于卵泡生長(zhǎng)調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致的卵巢早衰致使生育年限縮短，因此，研究卵泡閉鎖的發(fā)生機(jī)制將進(jìn)一步解開(kāi)卵泡閉鎖的未解之謎。

目前，研究尚未揭開(kāi)胚胎期卵泡閉鎖的發(fā)生機(jī)制，而生長(zhǎng)期卵泡閉鎖的主要原因可歸結(jié)為顆粒細(xì)胞過(guò)度凋亡[5-6]。miRNA是一種內(nèi)源的非編碼小RNA，目前，在人類中已鑒定出數(shù)百種 miRNAs[7-8]。由于這些miRNAs序列在不同哺乳動(dòng)物間高度保守，因此，可推測(cè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)絕大多數(shù)與發(fā)育和疾病相關(guān)的事件均與miRNAs的調(diào)控有關(guān)[9]。成熟的miRNA可與其靶基因的3′UTR結(jié)合并發(fā)揮調(diào)控作用[9]，此外，miRNA可直接與蛋白質(zhì)相互作用調(diào)控基因翻譯過(guò)程[10]并影響表觀遺傳機(jī)制[11]，也可通過(guò)抑制DNA轉(zhuǎn)錄或破壞mRNA分子的穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控[12]。哺乳動(dòng)物中，30%以上的蛋白質(zhì)編碼基因受到miRNAs的調(diào)控[13]。目前，在雌性哺乳動(dòng)物生殖領(lǐng)域?qū)iRNA的研究主要與卵泡發(fā)育有關(guān)，如顆粒細(xì)胞增殖、凋亡和類固醇激素分泌等方面。

TU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞和卵泡液中廣泛表達(dá)。從原始卵泡形成，卵巢儲(chǔ)備建立到初情期卵泡在促性腺激素作用下開(kāi)始發(fā)育再到最終排卵，大量的miRNAs參與了上述過(guò)程[14-15]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs參與了顆粒細(xì)胞調(diào)控。ZHANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p可通過(guò)靶向調(diào)控E2F轉(zhuǎn)錄因子1（Transcriptional factor，E2F1）可影響豬卵泡顆粒細(xì)胞的功能，在豬卵泡顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-17-5p顯著降低了轉(zhuǎn)錄因子E2F1的活性，促進(jìn)了顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)和激素合成過(guò)程。蔣秀敏等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-483-5p可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）的表達(dá)調(diào)控人卵泡顆粒細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程以及絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）在各種細(xì)胞反應(yīng)中的作用[18]。

本研究基于前期在牛卵泡顆粒細(xì)胞中開(kāi)展的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，選擇bta-miR-1343-3p為研究對(duì)象，進(jìn)一步研究其在顆粒細(xì)胞增殖和凋亡中的調(diào)控作用，旨在初步揭示哺乳動(dòng)物卵泡閉鎖的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的牛卵巢均來(lái)自山西省呂梁市文水縣屠宰場(chǎng)，采集后采用75%酒精消毒并保存于4 ℃ DPBS中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)），胎牛血清（FBS）（賽澳美細(xì)胞（技術(shù)）有限公司，北京），無(wú)菌PBS緩沖液（博士德生物，武漢），MTT試劑盒（博士德生物，武漢），Lipofectamine 3000（Invitrogen公司，美國(guó)），E.Z.N.A.?Plasmid mini Kit I（Omega BioTek，美國(guó)），Mut Express II Fast Mutagenesis Kit（南京諾唯贊生物科技有限公司，武漢），Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega Co. Ltd，美國(guó)），ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit（南京諾唯贊生物科技有限公司，武漢），bta-miRNA-1343-3p模擬物與抑制物（漢恒生物科技有限公司，上海），2×Es Taq Master Mix（Dye）（康為世紀(jì)生物科技有限公司，江蘇）。

1.3 卵泡顆粒細(xì)胞的收集與培養(yǎng)

采用眼科剪分離卵巢皮質(zhì)中的有腔卵泡。將卵泡用眼科剪剪開(kāi)，用細(xì)胞刮刀輕輕刮取卵泡內(nèi)壁獲取顆粒細(xì)胞并收集卵泡液，1 000 r/min下離心5 min，棄上清。得到的細(xì)胞沉淀用新鮮無(wú)菌PBS重懸，1 000 r/min下再離心3次，每次5 min，清洗沉淀中的血細(xì)胞等雜質(zhì)。清洗后的細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基（含10%的FBS和雙抗）重懸，置于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)和密度，更換新的完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.4 靶基因預(yù)測(cè)

對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行靶基因篩選分析，結(jié)合測(cè)序結(jié)果，進(jìn)一步使用TargetScan（TargetscanHuman 7.1：predicted miRNA targets of miR-1343-3p）和miRanda（miRDB-miRNA Target Prediction Database）篩選bta-miR-1343-3p的靶基因。最終選擇與卵泡顆粒細(xì)胞存活相關(guān)的基因NEDD8，使用RNA Hybird分析bta-miR-1343-3p與NEDD8基因UTR的結(jié)合位點(diǎn)。

1.5 NEDD8基因3” UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的牛NEDD8基因mRNA序列，尋找NEDD83” UTR的靶點(diǎn)位置。采用Primer 5.0設(shè)計(jì)NEDD83” UTR擴(kuò)增引物，并在引物上下游加入酶切位點(diǎn)與雙熒光素酶報(bào)告載體的同源序列。進(jìn)一步使用CE Design軟件（南京諾唯贊生物科技有限公司）設(shè)計(jì)同源重組及突變引物序列，如表1所示。顆粒細(xì)胞收集，RNA提取與反轉(zhuǎn)錄程序參考之前的研究[19]。以牛卵泡顆粒細(xì)胞cDNA為模 板 ，使 用 2×Es Taq Master Mix（Dye）擴(kuò) 增NEDD8基因3” UTR，具體步驟參考之前的研究[20]，PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的片段回收純化后測(cè)序鑒定序列準(zhǔn)確性。

表1 bta-miR-1343-3p熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR of bta-miR-1343-3p

將目的片段與線性化的pmir-GLO載體用同源重組酶連接，具體步驟按照ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit說(shuō)明書(shū)（南京諾唯贊生物科技有限公司，武漢）進(jìn)行，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞短暫離心后涂布到LB固體培養(yǎng)基上（含氨芐青霉素），37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落搖菌測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確菌液進(jìn)一步培養(yǎng)，使用E.Z.N.A.?Plasmid Mini Kit I提取質(zhì)粒DNA，獲得野生型重組質(zhì)粒。

突變型雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建采用Mut Express II Fast Mutagenesis Kit（南京諾唯贊生物科技有限公司，武漢）進(jìn)行3” UTR miRNA預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的突變，以連接成功的野生型載體為模板，使用點(diǎn)突變引物引入報(bào)告載體序列突變。突變質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增，重組酶重組后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆菌株培養(yǎng)后測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證正確的菌液進(jìn)一步培養(yǎng)質(zhì)粒DNA，獲得突變型質(zhì)粒。

1.6 雙熒光素酶活性檢測(cè)

將293T細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6～12 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%后轉(zhuǎn)染。試驗(yàn)組分為3組：（I）wt載體+mimics NC，wt載體+mimics；（II）mut載體+mimics NC，mut載體+mimics；（III）空載體+mimics NC，空載體+mimics。將上述載體質(zhì)粒 800 ng和 50 μm mimics使用 Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，反應(yīng)6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測(cè)293T細(xì)胞的雙熒光素酶活性。轉(zhuǎn)染48 h的293T細(xì)胞用無(wú)菌PBS清洗后加入100 μL 1×PLB，室溫下裂解 15 min，吸取 20 μL 裂解液至96孔酶標(biāo)板，加入100 μL LARⅡ后迅速在酶標(biāo)儀中檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，檢測(cè)完畢后立即加入100 μL終止液，檢測(cè)海腎熒光素酶的活性。

1.7 卵泡顆粒細(xì)胞中bta-miR-1343-3p mimics和inhibitors的轉(zhuǎn)染

將卵泡顆粒細(xì)胞均勻接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6～12 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%時(shí)采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染bta-miR-1343-3p mimics和inhibitors，6 h后更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。試驗(yàn)組與對(duì)照組詳細(xì)引物序列如表2所示。

表2 bta-miR-1343-3p 模擬物與抑制物序列Tab.2 Sequences for bta-miR-1343-3p mimics and inhibitors

1.8 MTT法檢測(cè)顆粒細(xì)胞增殖率

將卵泡顆粒細(xì)胞均勻接種至96孔板，培養(yǎng)6～12 h。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)60%時(shí)采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染 bta-miR-1343-3p mimics和 inhibitors，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后移除培養(yǎng)液。每孔加90.0 μL的新培養(yǎng)基和10 μL MTT，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再次移除培養(yǎng)液，加入110.0 μL的Formazan溶解液，避光孵育15 min，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

1.9 qRT-PCR

使用Primer 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物。其中，miRNA下游引物為M5 miRNA qPCR Assay Kit中自帶引物，序列如表3所示。mRNA實(shí)時(shí)熒光定量流程按照TB GreenTMPremix Ex Taq TMⅡ試劑盒詳細(xì)步驟進(jìn)行。miRNA熒光定量使用M5 miRNA qPCR Assay Kit進(jìn)行，反應(yīng)體系為：cDNA 1.0 μL，M5 miRNA qPCR Mixture（2×）10.0 μL，bta-miR-1343-3p Primer（10 μmol/L）0.4 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，加 ddH2O 20.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60.5 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s。

表3 熒光定量PCR引物序列Tab.3 Primer sequences of qRT-PCR

1.10 數(shù)據(jù)分析

miRNA實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)的處理以U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量；靶基因表達(dá)量檢測(cè)采用RPLP0作為內(nèi)參基因，MTT 結(jié)果采用式（1）計(jì)算。

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)數(shù)據(jù)以螢火蟲(chóng)熒光素酶的熒光強(qiáng)度與海腎熒光素酶的熒光強(qiáng)度比值作為熒光值。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，經(jīng)SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 bta-miR-1343-3p靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

采用miRanda軟件預(yù)測(cè)bta-miR-1343-3p的靶mRNA，為進(jìn)一步證實(shí)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用TargetScan、miRDB軟件對(duì)miRanda預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)合2個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NEDD8基因的3” UTR存在bta-miR-1343-3p的種子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)（圖1），RNA hybrid結(jié)果如圖2所示。

圖1 bta-miR-1343-3p與NEDD8 mRNA 3＇UTR 結(jié)合位點(diǎn)Fig.1 Binding sites between bta-miR-1343-3p and NEDD8 mRNA 3＇UTR

圖2 bta-miR-1343-3p與NEDD8 mRNA 3＇UTR的雜交位點(diǎn)Fig.2 Hybridization site of bta-miR-1343-3p and 3＇UTR of NEDD8 mRNA

2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果

雙熒光素報(bào)告檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

圖3 雙熒光素報(bào)告檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of dual luciferase reporter assay

共轉(zhuǎn)染雙熒光素酶報(bào)告基因載體與和bta-miR-1343-3p mimics后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，結(jié)果表明（圖3），在野生型報(bào)告載體+mimics組中，與對(duì)照組相比，bta-miR-1343-3p mimics組的熒光素酶活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而其他組中熒光素酶活性無(wú)顯著差異。

2.3 bta-miR-1343-3p對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響

在卵泡顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染bta-miR-1343-3p mimics以及抑制物（inhibitors）并采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mimics后24、48、72、96 h后細(xì)胞增殖率顯著下降（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染inhibitor后，細(xì)胞增殖率相比對(duì)照組顯著上升（P＜0.05）。

圖4 bta-miR-1343-3p對(duì)牛卵泡顆粒細(xì)胞增殖率的影響Fig.4 Influences of bta-miR-1343-3p on proliferation rate of bovine follicular GCs

2.4 bta-miR-1343-3p對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)基因的影響

在牛卵泡顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染bta-miR-1343-3p mimics和inhibitors后bta-miR-1343-3p結(jié)果如圖5所示。

圖5 轉(zhuǎn)染mimics與inhibitors之后bta-miR-1343-3p相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression level of bta-miR-1343-3p after mimics and inhibitors transfection

由圖5可知，與NC相比，mimics組中bta-miR-1343-3p的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.001）；轉(zhuǎn)染 inhibitors后，相比對(duì)照組，試驗(yàn)組中bta-miR-1343-3p表達(dá)量極顯著下降（P＜0.001）。

采用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染bta-miR-1343-3p mimics和inhibitors后，卵泡顆粒細(xì)胞中NEDD8基因的表達(dá)情況如圖6所示。

圖6 轉(zhuǎn)染mimics與inhibitors之后NEDD8相對(duì)表達(dá)情況Fig.6 Relative expression level of NEDD8 after mimics and inhibitors transfection

由圖6可知，相比對(duì)照組，轉(zhuǎn)染mimics的細(xì)胞中NEDD8基因的表達(dá)量極顯著下降（P＜0.01），而轉(zhuǎn)染inhibitors細(xì)胞的NEDD8基因的表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）。

按照上述方法對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)量的驗(yàn)證，結(jié)果如圖7所示，轉(zhuǎn)染bta-miR-1343-3p mimics和inhibitors后，細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK1與CDK4在過(guò)表達(dá)bta-miR-1343-3p后表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；相反，抑制bta-miR-1343-3p表達(dá)后，CDK1與CDK4基因的表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）。檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax與Fas后發(fā)現(xiàn)（圖8），過(guò)表達(dá)bta-miR-1343-3p后Bax表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），F(xiàn)as表達(dá)量升高但差異不顯著，但在抑制bta-miR-1343-3p表達(dá)后，試驗(yàn)組中Bax與Fas表達(dá)量均極顯著下降（P＜0.01）。

圖7 轉(zhuǎn)染mimics與inhibitors后細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK1和CDK4的相對(duì)表達(dá)情況Fig.7 Relative expression level of cell cycle-related genes CDK1 and CDK4 after mimics and inhibitors transfection

圖8 轉(zhuǎn)染mimics與inhibitors后凋亡相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)情況Fig.8 Relative expression level of apoptosis-related genes after mimics and inhibitors transfection

3 結(jié)論與討論

腔前卵泡的生長(zhǎng)不依賴促性腺激素，而有腔卵泡的生長(zhǎng)依賴FSH和LH[21-23]。卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中健康的卵母細(xì)胞以自分泌和旁分泌方式與卵泡生態(tài)體系中的顆粒細(xì)胞共同發(fā)揮作用，影響卵泡發(fā)育進(jìn)程，并影響卵泡的最終命運(yùn)。因此，本研究主要圍繞有腔卵泡中bta-miR-1343-3p對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞的影響開(kāi)展，分離卵巢皮質(zhì)中大小為4～8 mm的生長(zhǎng)期有腔卵泡并進(jìn)行體外培養(yǎng)。

采用miRanda軟件對(duì)bta-miR-1343-3p的靶位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其與NEDD8基因mRNA的3” UTR存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，bta-miR-1343-3p成熟序列在人和小鼠中完全保守。進(jìn)一步采用TargetScan和miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)bta-miR-1343-3p的靶基因并得到相同的結(jié)果，因此，認(rèn)為預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。成熟的miRNA可與Argonaute蛋白組裝成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（miRISC），并通過(guò)miRNA種子區(qū)域（2～8位核酸互補(bǔ)配對(duì)）和mRNA 3” UTR內(nèi)的互補(bǔ)位點(diǎn)之間的配對(duì)與靶標(biāo)mRNA結(jié)合[24]，NEDD8mRNA與bta-miR-1343-3p RNA的分子雜交圖顯示，二者間存在靶向關(guān)系。通過(guò)構(gòu)建NEDD8mRNA 3” UTR的雙熒光素酶野生型載體以及種子區(qū)突變型載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后證實(shí)了bta-miR-1343-3p與NEDD8基因之間存在靶向關(guān)系。將bta-miR-1343-3p mimics與inhibitors轉(zhuǎn)染至牛卵泡顆粒細(xì)胞中后，發(fā)現(xiàn)btamiR-1343-3p表達(dá)量極顯著上升，而轉(zhuǎn)染抑制物后bta-miR-1343-3p表達(dá)量極顯著下降，證明可將bta-miR-1343-3p在卵泡顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)與沉默同時(shí)發(fā)現(xiàn)bta-miR-1343-3p在顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后，NEDD8表達(dá)量顯著降低。表明bta-miR-1343-3p與NEDD8基因之間存在負(fù)調(diào)控作用，btamiR-1343-3p在顆粒細(xì)胞中可通過(guò)調(diào)節(jié)NEDD8基因的表達(dá)影響卵泡顆粒細(xì)胞的功能。

作為一種新的泛素樣蛋白，NEDD8蛋白在細(xì)胞中對(duì)蛋白質(zhì)的分解與調(diào)控作用起著非常重要的作用[25]。NEDD8蛋白調(diào)控細(xì)胞中多種代謝途徑的方式為Neddylation，與底物結(jié)合后可進(jìn)行復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[26]。Neddylation激活Cullins的泛素E3連接酶活性后，NEDD化的Cullins蛋白構(gòu)象發(fā)生變化并誘導(dǎo)底物發(fā)生泛素化，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)多種生命活動(dòng)[27]。此外，Neddylation還可與泛素化過(guò)程競(jìng)爭(zhēng)，p53和表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal growth factor receptor，簡(jiǎn)稱為EGFR）上的某些賴氨酸殘基既可以與NEDD8結(jié)合又可與泛素結(jié)合，抑制或降解底物。研究發(fā)現(xiàn)，Neddylation可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、衰老和自噬抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[28-29]。卵泡閉鎖過(guò)程不僅與卵泡內(nèi)激素水平有關(guān)，也與卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡高度相關(guān)。卵泡閉鎖存在于卵泡發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，由于閉鎖卵泡發(fā)育階段的不同導(dǎo)致其閉鎖的具體過(guò)程存在差異，閉鎖早期均出現(xiàn)卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡[30]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常卵泡相比，閉鎖卵泡中凋亡相關(guān)基因p53表達(dá)量顯著上升[31-32]。p53蛋白在細(xì)胞生存與凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用依賴于泛素化、磷酸化、乙?；刃揎椷^(guò)程[31,33]。此外，p53蛋白的活性由cullin-RING 泛素連接酶MDM2抑制，而MDM2可通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解p53。也有報(bào)道表明，MDM2可作為p53的NEDD8-E3連接酶[34]，p53蛋白超家族中成員p73也能被NEDD化所抑制活性[35]。

在卵泡顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)與沉默bta-miR-1343-3p后檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，MTT結(jié)果表明，bta-miR-1343-3p的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制顆粒細(xì)胞的增殖，而bta-miR-1343-3p沉默會(huì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。這一結(jié)果表明，在卵泡顆粒細(xì)胞中bta-miR-1343-3p可通過(guò)抑制NEDD8的表達(dá)促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡。這與其他研究中報(bào)道的NEDD8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的結(jié)果一致[36-37]。進(jìn)一步在bta-miR-1343-3p過(guò)表達(dá)和抑制的細(xì)胞中檢測(cè)CDK1與CDK4基因的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)bta-miR-1343-3p時(shí)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)量顯著下降，抑制bta-miR-1343-3p時(shí)表達(dá)量顯著上升。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax則在過(guò)表達(dá)bta-miR-1343-3p后表達(dá)量顯著升高，F(xiàn)as基因表達(dá)量有所升高但差異不顯著。上述結(jié)果可與之前的MTT結(jié)果相互印證，說(shuō)明bta-miR-1343-3p通過(guò)靶向調(diào)節(jié)NEDD8基因的表達(dá)抑制了卵泡顆粒細(xì)胞的增殖。

綜上所述，bta-miR-1343-3p靶向的NEDD8基因調(diào)控了牛卵泡顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡，對(duì)卵泡發(fā)育起著重要的作用。