招鈺娟 何國(guó)成 林慶昶 周秀瑩 賈曉菲 林小貞 黎小鵬

(中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437)

磺胺類藥物(sulphonamides,SAs)是人工合成的抗菌藥，早在1935年開始用于臨床，與其他抗菌藥相比其應(yīng)用的時(shí)間較長(zhǎng)，具有性質(zhì)穩(wěn)定、使用簡(jiǎn)便、抗菌譜廣等特點(diǎn)，至今在養(yǎng)殖生產(chǎn)和臨床中仍廣泛使用，是重要的化學(xué)治療藥物。我國(guó)的養(yǎng)殖生產(chǎn)還處于散戶養(yǎng)殖較多的階段，部分養(yǎng)殖戶由于對(duì)抗菌藥缺乏了解而未合理使用或過度使用，引起細(xì)菌對(duì)于磺胺類藥物的耐藥性，藥物殘留從而污染下游產(chǎn)品，進(jìn)而危害人體健康。近年的研究表明，長(zhǎng)期對(duì)動(dòng)物使用SAs，特別是磺胺甲噁唑、磺胺喹噁啉等，殘留物有可能引起人體過敏、中毒、造血功能障礙、急性溶血性貧血、粒細(xì)胞缺乏癥等，也有致畸、致癌、致突變的“三致”作用，并可能導(dǎo)致耐藥性菌株產(chǎn)生，造成生態(tài)環(huán)境污染[1]。因此，為了保障動(dòng)物用藥的安全性和有效性，國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)以及許多的國(guó)家都對(duì)動(dòng)物源性食品中的SAs含量都作了非常嚴(yán)格的規(guī)定[2]，我國(guó)在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》GB 31650-2019中明確要求，所有動(dòng)物產(chǎn)品中SAs的最高殘留限量為0.1mg·kg-1，同時(shí)磺胺二甲基嘧啶在牛奶中的殘留限量為0.025mg·kg-1。

SAs是以對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)為主體的藥物總稱，一般為白色或微黃色結(jié)晶性粉末，遇光易變質(zhì)，顏色逐漸變深，有共同的對(duì)-氨基苯磺酰胺母核結(jié)構(gòu)，大多數(shù)SAs具有酸堿兩性，可溶于酸或堿溶液中，也較易溶于乙醇、乙腈或丙酮中；大多數(shù)SAs在水中溶解度極低[3]。根據(jù)SAs的理化特點(diǎn)，研究人員開發(fā)了多種檢測(cè)方法，主要有熒光光譜法[4]、化學(xué)發(fā)光法[5]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[6]、電化學(xué)法[7]、免疫分析法[8]、微生物抑制法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]、高效液相色譜法[11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12,13]。我國(guó)有關(guān)部門已發(fā)布多個(gè)磺胺類藥物殘留量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，主要使用液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。液質(zhì)聯(lián)用是目前SAs定性定量檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確性好的方法，但由于儀器昂貴，對(duì)使用人員要求高，在基層實(shí)驗(yàn)室尚未普及。而液相色譜-紫外檢測(cè)器，是多數(shù)實(shí)驗(yàn)室配置的儀器，絕大部分基層實(shí)驗(yàn)室已配置，具有選擇性高，定量準(zhǔn)確、穩(wěn)定，靈敏度適用等優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)我國(guó)畜禽養(yǎng)殖目前還處于散戶養(yǎng)殖階段的特點(diǎn)，基層實(shí)驗(yàn)室使用液相色譜法開展SAs殘留量檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中濫用抗菌素的問題，可預(yù)防超標(biāo)產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)危害人們健康。目前現(xiàn)行有效的SAs液相色譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，多發(fā)布于十多年前，前處理操作比較復(fù)雜，隨著檢測(cè)技術(shù)理論的發(fā)展，并針對(duì)各自實(shí)驗(yàn)室的儀器、人員配置等實(shí)際情況開展研究，選擇出結(jié)果穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)易的前處理和儀器方法，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-紫外檢測(cè)器HPLC1260-VWD(安捷倫科技有限公司)；振蕩搖床KS-501(德國(guó)IKA集團(tuán))；渦漩振蕩器(德國(guó)IKA公司)；離心機(jī)Sigma 3-30KS(德國(guó)Sigma離心機(jī)有限公司)。

5種磺胺標(biāo)準(zhǔn)品，磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉，購自德國(guó)DrEhrenstorferGmbH公司。

乙腈、甲酸(色譜純,Fisher公司)；無水硫酸鈉(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；堿性氧化鋁固相萃取柱(6mL，2g SUPELCO)、0.2μm PTFE針式過濾器(安捷倫科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。

洗脫液：25mL乙腈加0.3mL甲酸加75mL水混合，搖勻。

1.2 提取

取畜禽肌肉、肝臟樣品，攪拌成勻漿狀。稱取5.00g(±0.05g)試樣于50mL離心管中，加入約5mL水、2顆陶瓷均質(zhì)子、20.00mL甲酸乙腈(甲酸0.3%)，搖床震蕩30min，300rpm。加入8～10g無水硫酸鈉，渦旋震蕩1min，8000rpm離心5min，全部上清液轉(zhuǎn)至另一50mL離心管，加入約15mL正己烷，渦旋震蕩1min，棄去上層，再加入約15mL正己烷，渦旋震蕩1min，8000rpm離心5min，下層(乙腈層)備用。

1.3 凈化

準(zhǔn)確吸取上述備用液(下層)16.00mL注入已活化的堿性氧化鋁固相萃取柱，上樣前用10mL乙腈活化，在自然重力下流出，棄去濾液，擠干，2mL洗脫液洗脫，重復(fù)1次，收集全部洗脫液，定容至總體積4mL，過0.2μm PTFE針式過濾器后上機(jī)檢測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取5種磺胺類藥物10mg (精確至0.01 mg)，用甲醇溶解并定容至10mL,配制成1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別準(zhǔn)確移取上述單一標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10mL于同一10mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到10μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃以下保存。

準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10mL于樣品瓶中，加入0.90mL洗脫液，得到1000μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；精確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用洗脫液稀釋成質(zhì)量濃度為20μg·L-1、50μg·L-1、100μg·L-1、200μg·L-1、500μg·L-1、1000μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱，Agilent Pursuit 5 C18(150mm×4.6mm，5.0μm)，柱溫為35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270nm；進(jìn)樣量20.0μL，流量1.000mL·min-1，流動(dòng)相洗脫程序如表1所示，后運(yùn)行時(shí)間1min。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

乙腈[14]和乙酸乙酯[15]是SAs常用的提取溶劑，而SAs容易在酸性溶液中離子化[16]，提高提取效率。同時(shí)考慮到畜禽產(chǎn)品含有較高的蛋白質(zhì)，容易對(duì)檢測(cè)造成干擾，含有乙腈的提取溶劑具有沉淀蛋白、減少共提物的作用[17]，結(jié)果則為色譜圖的雜峰較少。本研究比較了乙腈、甲酸乙腈和乙酸乙酯3種提取溶劑，考察添加濃度0.040mg·kg-1的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值，觀察加標(biāo)樣品的色譜圖，比較不同提取溶劑對(duì)后續(xù)凈化步驟操作便利性的影響等多種因素，優(yōu)選出甲酸乙腈作為本試驗(yàn)的提取溶劑。

2.2 凈化方法的選擇

本試驗(yàn)使用液相色譜-紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，與液質(zhì)聯(lián)用法相比選擇性較弱，只是以保留時(shí)間作為定性條件，凈化效果低的方法容易產(chǎn)生干擾。比較QuEChERS[18]凈化管(內(nèi)含50mg PSA、150mg C18EC 和900mg Na2SO4，15mL)、陽離子交換(MCX)固相萃取柱[19]、堿性氧化鋁固相萃取柱[14,20]3種凈化方法，3種方法的加標(biāo)回收率均在70%～110%，但QuEChERS凈化管的色譜圖有比較多雜峰，容易產(chǎn)生干擾；MCX柱容易發(fā)生堵塞現(xiàn)象[21]，選擇堿性氧化鋁SPE柱作為本研究的凈化方法。使用甲酸乙腈作提取溶劑，結(jié)合堿性氧化鋁柱凈化，經(jīng)優(yōu)化后整個(gè)前處理不需要使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、氮吹儀濃縮或置換有機(jī)溶劑，大大減少前處理時(shí)間，簡(jiǎn)化操作，也能減少SAs的揮發(fā)，提高提取凈化效率，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。與趙敏兒[22]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 定量方法的線性檢測(cè)范圍

以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，各目標(biāo)化合物色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性關(guān)系相關(guān)系數(shù)、回歸方程見表2。5種磺胺在0.02～1000mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2值均大于0.9999。

2.3.2 方法檢出限

方法檢出限按低濃度點(diǎn)0.05mg·kg-1的響應(yīng)值與基線噪聲響應(yīng)的3倍計(jì)算，檢出限結(jié)果見表2。5種磺胺的方法檢出限為0.003～0.005mg·kg-1，能滿足動(dòng)物源性食物中磺胺類抗生素的檢測(cè)。5種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

表2 動(dòng)物源性食物中5種磺胺的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.3.3 方法回收率和精密度

在相同的試驗(yàn)條件下，分別對(duì)6個(gè)空白雞肉、豬肝、脂肪樣品添加濃度為0.020mg·kg-1、0.040mg·kg-1、0.200mg·kg-1的5種磺胺混合標(biāo)樣，進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度測(cè)試，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果見表3。5種磺胺的加標(biāo)回收率為80.1%～108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.48%～10.0%。方法具有很好的回收率和精密度。

圖1 5種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(0.05μg·mL-1)

表3 動(dòng)物源性食物中5種磺胺的加標(biāo)濃度、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化提取溶劑，有效提高提取效率，簡(jiǎn)化提取步驟；使用正己烷前處理，并優(yōu)選出固相萃取小柱同時(shí)富集和凈化，簡(jiǎn)化整個(gè)前處理的步驟，無需旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、氮吹儀置換溶劑，大大提高工作效率，前處理操作比較簡(jiǎn)便。結(jié)合高效液相色譜和紫外檢測(cè)器，建立了操作簡(jiǎn)便、回收率高、準(zhǔn)確穩(wěn)定的動(dòng)物性食品中5種常用磺胺類藥物殘留的分析方法,易于在基層實(shí)驗(yàn)室開展測(cè)定，及時(shí)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的磺胺類藥物濫用情況，為農(nóng)業(yè)行政主管部門制定政策和加強(qiáng)管理提供參考。