韓艷曹麗李闖姚琪譚化王洋王娜于婭王忠偉

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002； 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130033)

馬鈴薯作為全球第4種主要作物，產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性強，是生活中不可缺少的蔬菜、糧食作物，同時也是能為農(nóng)民增加收入的經(jīng)濟(jì)作物，在吉林省地區(qū)廣泛種植。在連年的種植中，由于病毒的侵染和積累，導(dǎo)致馬鈴薯植株葉片卷曲壞死、莖稈矮小細(xì)弱，塊莖畸形龜裂，產(chǎn)量逐年降低[1]。目前，馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，其利用馬鈴薯細(xì)胞的全能性及病毒在根尖和莖尖的分生組織中含量少或不含的特性[2]。在實際操作中，不同馬鈴薯品種的脫毒方式、莖尖大小、培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的成分、培養(yǎng)條件及快繁培養(yǎng)基成分、試管薯誘導(dǎo)環(huán)境存在顯著差異?！凹?號”馬鈴薯是吉林吉科生物高技術(shù)公司選育的新品種，具有薯塊大而整齊、大薯率高、營養(yǎng)豐富等特點，但該品種莖尖培養(yǎng)成苗困難，成活率不高，生長緩慢，出現(xiàn)黃化死亡的現(xiàn)象。在進(jìn)行異地快繁時，由于試管苗不易儲存，運輸中損耗較大，將試管苗誘導(dǎo)出試管薯可以有效改變這種現(xiàn)狀，顯著降低長途運輸中的損耗，本研究對“吉科6號”馬鈴薯脫毒方式和組織快繁培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出適宜的試管薯誘導(dǎo)條件，建立了“吉科6號”脫毒快繁技術(shù)體系，為實現(xiàn)“吉科6號”馬鈴薯的工廠化育苗及種薯快繁提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

“吉科6號”，塊莖橢圓形，薯皮光滑、黃色，薯肉黃色，芽眼淺。由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)植物研究所馬鈴薯課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同消毒方法比較

選擇健康的馬鈴薯塊莖在室溫下進(jìn)行催芽，待芽長3cm時，切取1cm長的莖芽作為試驗材料，對莖芽進(jìn)行消毒處理。試驗設(shè)計6個處理，設(shè)置3次重復(fù)。每個處理30個芽，調(diào)查并記錄相應(yīng)的數(shù)據(jù)。具體試驗設(shè)置見表1。

1.2.2 不同莖尖大小比較

在無菌條件下，將接種材料消毒后，剝離不同大小的莖尖并分析莖尖的分化生長情況。莖尖大小分別為0.1～0.2mm、0.2～0.3mm、0.3～0.4mm、0.4～0.5mm、0.5～0.6mm，每個處理30個芽，重復(fù)3次。接種到相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)查并記錄相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

1.2.3 不同激素濃度配比對馬鈴薯莖尖成苗率的影響

將MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，因為生長調(diào)節(jié)劑6-BA對芽的誘導(dǎo)能力強于GA3和NAA[3]，因此采用張媛媛[4]的方法，將NAA、GA3濃度固定為0.1mg·L-1同時調(diào)節(jié)6-BA的使用濃度。試驗設(shè)計6個處理，每個處理30個芽，設(shè)置3次重復(fù)。調(diào)查并記錄相應(yīng)的數(shù)據(jù)。具體試驗方案見表2。

表1 不同消毒方式

表2 不同培養(yǎng)基成分

1.2.4 莖段快繁

將誘導(dǎo)獲得的脫毒小苗切去莖尖后，切成帶單個腋芽的莖段，將其插入含有不同成分不同濃度多效唑PP333、矮壯素CCC、丁酰肼B9、助壯素PIX的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁，以MS培養(yǎng)基作為對照組，試驗設(shè)置3個處理，每個處理30瓶，每瓶10個莖段。3次重復(fù)。25d后觀察分析莖段的生長狀況并記錄相應(yīng)的數(shù)據(jù)。具體試驗方案見表3。

1.2.5 誘導(dǎo)形成試管薯

當(dāng)脫毒試管苗長有6～7片葉時，去掉頂芽，取中部4～5個莖段進(jìn)行馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基，不添加任何生長調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)期間不更換培養(yǎng)基。試驗設(shè)置9個處理，每個處理30瓶，每瓶10個莖段，3次重復(fù)。光照時間為8h·d-1，誘導(dǎo)4周，再進(jìn)行4周全黑暗誘導(dǎo)。全黑暗誘導(dǎo)4周后進(jìn)行收獲，統(tǒng)計每個處理試管秒誘導(dǎo)生產(chǎn)試管薯的大薯數(shù)(≥0.05g)、大薯重、小薯數(shù)(<0.05g)、小薯重、結(jié)薯數(shù)和結(jié)薯重，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。具體試驗方案見表4。

表3 不同培養(yǎng)基成分

表4 誘導(dǎo)環(huán)境

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用WPS進(jìn)行處理，DPS 7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

莖尖成活率=成活莖尖個數(shù)/接種莖尖個數(shù)

接種3個月后統(tǒng)計。

莖尖成苗率=成苗莖尖個數(shù)/成活莖尖個數(shù)

接種6個月后統(tǒng)計。

脫毒率=無病毒株數(shù)/檢測株數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法比較

試驗選擇0.1%升汞和0.1%NaClO作為主要滅菌劑，研究不同浸泡時間對消毒效果的影響，結(jié)果如表5所示，隨著滅菌時間的增加，染菌率和成活率均呈現(xiàn)下降的趨勢，根據(jù)各處理結(jié)果對染菌率及成活率的影響，推薦采用自來水沖洗20min加0.1%升汞浸泡7min加75%乙醇浸泡1min加無菌水沖洗2次的消毒方法用于馬鈴薯“吉科6號”莖芽消毒處理，染菌率降至17%的同時可以保障成活率達(dá)到92.22%。

表5 不同消毒方法對莖尖染菌率及成活率的影響

2.2 不同莖尖大小比較

由表6可以看出，馬鈴薯“吉科6號”成活率與莖尖剝離的大小呈正相關(guān)，成活率隨著莖尖剝離長度的增加而逐漸升高：與脫毒率呈負(fù)相關(guān)，脫毒率隨著莖尖剝離長度的增加而逐漸降低。在本試驗條件下，適宜馬鈴薯“吉科6號”剝離莖尖最佳大小為0.3～0.4mm，脫毒率達(dá)到48.89%，成活率達(dá)到49.6%。

表6 不同莖尖大小對脫毒率及成苗率的影響

2.3 不同激素濃度配比對馬鈴薯莖尖成苗率的影響

生長調(diào)節(jié)激素赤霉素GA3能抑制愈傷組織的形成，且有助于馬鈴薯莖尖生長和分化；細(xì)胞分裂素6-BA可誘導(dǎo)芽的分化，但不利于莖的伸長；生長素NAA可促進(jìn)莖的伸長，但不利于芽的分化增殖，將上述3種激素混合使用，可以有效調(diào)節(jié)馬鈴薯試管苗的生長。由表7可以看出，生長調(diào)節(jié)激素6-BA、NAA、GA3對馬鈴薯莖尖的誘導(dǎo)分化影響顯著，在本研究中，處理2的成活率最高為93.33%，與處理3之間不存在顯著性差異，與其他處理均存在顯著性差異；處理3的成苗率最高為74.07%，與其他處理存在顯著性差異，因此，綜合分析得出，在本試驗中最適宜馬鈴薯“吉科6號”的生長調(diào)節(jié)劑組合是MS加0.1mg·L-1NAA加0.1mg·L-1GA3加0.15mg·L-16-BA。

表7 不同生長調(diào)節(jié)激素組合調(diào)節(jié)下馬鈴薯莖尖成苗情況

2.4 不同成分培養(yǎng)基對莖段生長的影響

表8 不同培養(yǎng)基中莖段生長情況

由表8可以看出，在添加各種生長延緩劑的培養(yǎng)中，雖然馬鈴薯“吉科6號”試管苗在對照培養(yǎng)基中根長、株高顯著大于其他處理，但是在生根率、莖粗、新增單芽節(jié)數(shù)方面明顯低于其他處理。使用過生長抑制劑的處理植株變得矮而粗壯，更有利于移栽及試管薯的誘導(dǎo)。在本試驗中，MS加PIX 0.5mg·L-1的培養(yǎng)基組合，對促進(jìn)馬鈴薯“吉科6號”脫毒苗生根，增加莖粗，抑制徒長，促進(jìn)壯苗等綜合效果最佳。

2.5 誘導(dǎo)形成試管薯

由表9可以看出，當(dāng)溫度在20℃，光照強度為80μmol·m-2·s-1，光照8h·d-1，誘導(dǎo)4周，黑暗誘導(dǎo)4周，結(jié)薯數(shù)2218.96個和結(jié)薯重14.84g顯著高于其他處理，是最適宜馬鈴薯“吉科6號”的試管薯誘導(dǎo)方法。

表9 溫度和光照強度對試管薯形成的影響

3 討論與結(jié)論

影響馬鈴薯莖尖脫毒效果及脫毒苗快繁、試管薯誘導(dǎo)的因素有很多。外植體的消毒是馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)取得成功的基礎(chǔ)，對于莖尖的處理既要使其不受污染，又要確保其成活狀態(tài)，現(xiàn)有的研究報道表明[5]，氯化汞或次氯酸鈉與75%乙醇組合使用對馬鈴薯莖尖的消毒效果較好；莖尖剝離的大小是影響馬鈴薯莖尖脫毒的關(guān)鍵因素，現(xiàn)有的研究表明[6]，莖尖剝離保留1～2個葉原基，可以保證莖尖的脫毒率及成活率；在MS培養(yǎng)基中加入生長調(diào)節(jié)劑GA3、6-BA、NAA制成分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基的成分及濃度是影響成苗的關(guān)鍵，濃度過低會出現(xiàn)大量愈傷組織無法分化成苗，濃度過高，會出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，導(dǎo)致成活率降低，現(xiàn)有研究表明[7]，上述常用的3種生長調(diào)節(jié)劑對馬鈴薯的作用存在差異。多效唑(PP333)、矮壯素(CCC)、丁酰肼(B9)和助壯素(PIX)等生長延緩劑，可增強試管苗的適應(yīng)性和抗性，能顯著提高移栽成活率。研究表明[8]，影響馬鈴薯試管薯形成的因素很多，溫度、光照、黑暗誘導(dǎo)時間、馬鈴薯品種等。

鑒于已有的研究報道結(jié)果，本研究以馬鈴薯新品種“吉科6號”莖尖為外植體，對其消毒方式、剝離莖尖大小、生長調(diào)節(jié)劑成分、快繁培養(yǎng)基組分、試管薯誘導(dǎo)環(huán)境進(jìn)行了優(yōu)化。在本試驗中，確定了用自來水沖洗20min加0.1%升汞浸泡7min加75%乙醇浸泡1min加無菌水沖洗2次對馬鈴薯“吉科6號”莖芽消毒處理后，污染率降至17%；確定莖尖剝離長度為0.3～0.5mm，脫毒率48.89%，成活率49.6%；用MS加0.1mg·L-1NAA加0.1mg·L-1GA3加0.15mg·L-16-BA培養(yǎng)基誘導(dǎo)莖尖分化成苗，成活率90%，成苗率74.07%。再經(jīng)MS加PIX 1.0mg·L-1培養(yǎng)基繼代，可獲得大量健壯的馬鈴薯無菌種苗，之后在培養(yǎng)室內(nèi)溫度調(diào)至20℃，光照強度調(diào)至80μmol·m-2·s-1，光照時間調(diào)至8h·d-1，誘導(dǎo)4周，之后全黑暗誘導(dǎo)4周，可以獲得大量試管薯，滿足長途運輸及工廠化生產(chǎn)的目標(biāo)。