張 成，郭元博，薛 婧，王芝曉，龍 肇

中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙 410004

0 引言

乳酸菌生物合成能力弱，利用蛋白質(zhì)氮的能力低，在酸奶中人為添加碳源和氮源可以促進乳酸菌的生長。植物蛋白水解產(chǎn)物主要成分是小分子肽和游離氨基酸，是促進乳酸菌生長代謝良好的氮源[1，2]。添加蛋白水解物不僅有利于促進乳酸菌在發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸能力，而且可賦予酸奶良好的品質(zhì)特性。Wang等[3]證實，添加小分子蟬蛹肽對酸奶中乳酸菌的增殖有明顯促進作用。廖蘭等[4]發(fā)現(xiàn)，添加小麥蛋白肽在縮短酸奶發(fā)酵周期的同時，提高了酸奶的黏度和感官得分。董世榮等[5]研究表明，添加膠原蛋白肽提高了酸奶的硬度和持水能力。Varedesara等[6]證實，葡萄籽蛋白水解物有利于抑制酸奶貯藏期間的乳清析出。

但目前的研究大多是利用可溶性植物蛋白以及動物蛋白發(fā)酵酸奶，它們?nèi)芙庑粤己?，易被乳酸菌吸收利用。但價格昂貴，若大量用于酸奶基質(zhì)中，大大增加了生產(chǎn)成本。而且只局限于對酸奶發(fā)酵后的品質(zhì)進行研究，缺少酸奶貯藏期間品質(zhì)變化的研究。米渣蛋白作為生產(chǎn)淀粉糖漿、有機酸和味精的工業(yè)副產(chǎn)品，產(chǎn)量極大，但因其溶解性極差，很難應用到食品工業(yè)中，目前多用于動物飼料。本文利用堿性蛋白酶對米渣蛋白進行水解，通過添加1%，2%，3%，4%，5%的米渣蛋白水解物，探究促發(fā)酵效果最好的添加量。在最適添加量條件下，研究不同水解度下的米渣蛋白水解物對酸奶促發(fā)酵能力的影響，并通過質(zhì)構(gòu)特性、持水力、感官得分的方法研究酸奶在貯藏期間的品質(zhì)變化。為米渣蛋白的充分利用以及降低酸奶企業(yè)的成本提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米渣蛋白（蛋白質(zhì)含量為79.02%），無錫金農(nóng)生物科技有限公司；全脂奶粉（蛋白質(zhì)含量為24.50%、脂肪含量為26.30%），新西蘭乳品有限公司；丹尼斯克300型酸奶發(fā)酵劑（嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種），丹尼斯克（中國）有限公司；葡萄糖，阜豐營銷有限公司；蔗糖，河南萬邦化工科技有限公司；堿性蛋白酶（400 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司；Gly-Gly-Gly（189 Da）、Gly-Gly-Tyr-Arg（451 Da）、桿菌肽（1 423 Da）、抑肽酶（6 512 Da）、細胞色素c（12 384 Da），美國Sigma公司。高效液相色譜所用試劑為色譜級，其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AuY220 電子分析天平，島津（香港）有限公司；Five Easy pH計，梅特勒托利多（上海）有限公司；TDZ5-WS 低速離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；D-6L 高壓均質(zhì)機，美國PhD公司；SPX-270生化培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司；K9840自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；TA XT Plus 質(zhì)構(gòu)儀，英國 Stable Micro System 公司；Waters600 高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米渣蛋白水解物的制備

米渣蛋白按1∶10的料液比加水攪拌均勻，用1.0 M NaOH調(diào)pH至8.5，加入堿性蛋白酶4 000 U/g，于55 ℃恒溫水浴分別攪拌水解6 h、12 h、18 h、24 h、36 h后，沸水浴10 min滅酶，冷卻至25 ℃，用1.0 M NaOH調(diào)pH至7.0，3 000 r/min離心20 min，收集上清液冷凍貯藏。其中，水解6 h的水解物為A6，水解12 h的水解物為A12，A18、A24、A36以此類推。

1.3.2 水解物氨態(tài)氮的測定方法

參考張婧倩等[7]的方法，取4 g水解液，用去離子水補到80 g，0.1 M NaOH調(diào)pH至8.2，加10 mL甲醛，繼續(xù)用0.1 M NaOH調(diào)pH至9.2，消耗NaOH體積為V1，以去離子水作空白，消耗NaOH體積為V2。氨態(tài)氮含量計算公式如下。

式中：C，NaOH標準溶液的濃度，mol/L；M，水解液的質(zhì)量，g；0.014，氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。

1.3.3 水解物蛋白含量的測定

參考Raya[8]的方法，取10.0 g上清液，加入10.0 mL濃硫酸，0.4 g硫酸銅，6.0 g硫酸鉀，經(jīng)石墨消解儀消化完成后，采用自動凱氏定氮儀進行測定。蛋白質(zhì)含量計算公式如下。

式中：W，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)，%；M，樣品質(zhì)量，g；0.014，氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；5.95，米渣蛋白質(zhì)系數(shù)。

1.3.4 水解物水解度的計算公式

式中：DH為米渣蛋白水解物的水解度，%。

1.3.5 水解物分子量的測定

參考Zheng等[9]的方法，采用G2000 SWXL TSK凝膠色譜柱（7.8 mm ×300 mm，5 μm），0.5 mg/mL樣品經(jīng)0.22μm濾膜過濾后上機測試。色譜條件：流動相為乙腈：水：三氟乙酸=20∶80∶0.1，流速1 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長214 nm，溫度25 ℃。擬合標準曲線，y = -1.4507x + 11.5779，R2= 0.9958；y為各標準品相對分子質(zhì)量的對數(shù)值，x為各標準品的出峰時間。

1.3.6 酸奶的制備

12.00 g全脂奶粉，4.25 g葡萄糖，4.25 g蔗糖混合均勻后，添加1%、2%、3%、4%、5% A24，以及添加不同水解度下的3%米渣蛋白水解物，用去離子水補至100 g，60 ℃恒溫下緩慢攪拌30 min至水化完成，冷卻至常溫后于20 MPa均質(zhì)1次，85 ℃水浴滅菌10 min，冷卻至42 ℃后接種20 DCU/100 L發(fā)酵劑，于42 ℃發(fā)酵至pH 4.40，快速冷卻至18 ℃，4 ℃冷藏待用。

1.3.7 酸奶 pH值的測定

在酸奶發(fā)酵過程中每隔1 h用pH計對酸奶的pH值進行測定，每次使用前后都用pH為4.01，7.00的磷酸緩沖溶液校準。

1.3.8 酸奶可滴定酸度的測定

在酸奶發(fā)酵過程中每隔1 h對酸奶的可滴定酸度進行測定。

可滴定酸度的測定參考曾羲[10]的方法，稱取5.0 g混合均勻的試樣，置于150.0 mL錐形瓶中，加入25.0 mL新煮沸冷卻至25 ℃的去離子水，攪拌均勻，加入0.2 mL酚酞指示劑，用標定后的0.1 mol/L NaOH 溶液滴定至淺紅色且10 s內(nèi)不變色，用等體積的去離子水作空白對照，整個滴定過程在60 s內(nèi)完成?？傻味ㄋ岫扔嬎愎饺缦?。

式中：X，試樣的酸度，°T；C，NaOH標準溶液的濃度，mol/L；V1，滴定試樣消耗NaOH溶液的體積，L；V0，空白滴定消耗NaOH溶液的體積，L；100，100 g試樣；M，試樣的質(zhì)量，g；0.1，酸度理論定義NaOH的摩爾濃度，mol/L。

1.3.9 酸奶質(zhì)構(gòu)特性的測定

分別在4 ℃冷藏1 d，7 d，14 d，21 d的酸奶取出立即進行質(zhì)構(gòu)測定。每個樣品做3 次平行。測試參數(shù)及設置值見表1。

表1 質(zhì)構(gòu)儀測試參數(shù)及設置值

1.3.10 酸奶持水力的測定

取在4 ℃下冷藏1 d，7 d，14 d，21 d的酸奶樣品10 g，參考Xz等[11]的方法，在25 ℃條件下，3 000 r/min離心20 min，倒出上清物，保持離心管倒置10 min，結(jié)束后立即稱重。每個樣品做3次平行。持水力計算公式如下。

式中：WHC，酸奶持水力，g/g；M1，酸奶離心后沉淀和離心管總重，g；M0，離心管質(zhì)量，g；M2，酸奶質(zhì)量，g。

1.3.11 酸奶感官品質(zhì)的測定

在4 ℃冷藏1 d取出酸奶，測定酸奶的感官特性。感官評定由經(jīng)培訓的50名專業(yè)品評人員鑒評（男25名、女25名），對試樣的色澤、氣味、滋味和組織狀態(tài)進行評分。酸奶感官評價標準見表2。

表2 酸奶感官評價標準

1.3.12 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗均重復3 次，用Origin 2018進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 22.0進行多重比較分析（P＜0.05）。數(shù)據(jù)表示為“平均值±標準偏差”。

2 結(jié)果與討論

2.1 米渣蛋白水解物的水解度和蛋白質(zhì)含量

表3顯示了不同水解時間的米渣蛋白水解物的水解度和蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明在水解時間6~36 h內(nèi)，隨著水解時間的延長，米渣蛋白的蛋白質(zhì)含量呈增加趨勢，氨態(tài)氮含量逐漸增加，水解度逐漸增大。其中A18蛋白質(zhì)含量較A6提高了9.25%，A24氨態(tài)氮含量較A6增加了22.22%，A36水解度較A6上升了30.45%。這是因為水解時間的延長，使得堿性蛋白酶與米渣蛋白充分接觸，米渣蛋白更多的肽鍵被打開，生成了小分子肽和游離氨基酸[12]。

表3 米渣蛋白水解物的水解度和蛋白質(zhì)含量

2.2 米渣蛋白水解物分子量組成

米渣蛋白水解物的分子量分布見表4，由表4可知，米渣蛋白在水解時間（6~36 h）下，增加水解時間，水解物中大于1 000 Da含量不斷減少，小于1 000 Da含量逐漸增加。其中，A6小于1 000 Da的含量為74.54%，A36小于1 000 Da的含量則提高至83.07%。水解物中小分子含量的上升說明堿性蛋白酶可以較好的把米渣蛋白水解為小分子肽和游離氨基酸。

表4 米渣蛋白水解物的分子量分布（%）

2.3 A24不同添加量對酸奶發(fā)酵時間的影響

圖1顯示了堿性蛋白酶水解24 h得到的米渣蛋白水解物不同添加量下對酸奶發(fā)酵時間的影響。由圖可知，在水解物添加量1%~3%條件下，隨著添加量的增加，酸奶的發(fā)酵時間逐漸縮短；其中CK發(fā)酵時間為7.21 h，添加1%的A24可以縮短發(fā)酵時間0.71 h，當添加量增加至3%，酸奶發(fā)酵時間則可以縮短1.09 h。而當A24添加量增加至4%時，酸奶的發(fā)酵時間較空白有所延長，說明過高的添加量則會抑制酸奶的發(fā)酵；可能是因為米渣蛋白水解物添加量過高影響了酸奶基質(zhì)中的pH值和滲透壓，反而不利于乳酸菌的生長。由圖可得米渣蛋白水解物在3%添加量條件下，對酸奶的促發(fā)酵能力最好。

圖1 A24不同添加量對酸奶發(fā)酵時間的影響

2.4 添加3%米渣蛋白水解物對酸奶促發(fā)酵的影響及比較

圖2顯示了米渣蛋白水解物不同水解度下酸奶發(fā)酵期間的pH變化，由圖看出所有酸奶的pH下降速度都呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。與對照組相比，添加3%（w/w）米渣蛋白的酸奶不但沒有促進發(fā)酵效果，反而延長了發(fā)酵時間，可能是由于米渣蛋白溶解性差，很難被分解成可溶性氮，而乳酸菌利用蛋白質(zhì)氮的能力低，因此不利于發(fā)酵期間乳酸菌的增殖產(chǎn)酸[13]。隨著水解度的增加，酸奶發(fā)酵時間持續(xù)縮短，其中A6較CK縮短了0.21 h，當水解時間延長至36 h，發(fā)酵時間較CK縮短了1.58 h。這與譚允冰等[14]研究大豆蛋白酶解產(chǎn)物對酸奶的促發(fā)酵結(jié)果類似。米渣蛋白在水解過程中被分解成分子肽和游離氨基酸，這為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的生長提供了可溶性氮源。

圖2 米渣蛋白水解物對酸奶發(fā)酵時間的影響

圖3顯示了酸奶可滴定酸度隨發(fā)酵時間的變化，由圖可知在發(fā)酵前2 h，所有酸奶的酸度增加趨勢相當，添加米渣蛋白水解物沒有改變?nèi)樗峋倪t滯時間。發(fā)酵2 h后，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌進入對數(shù)增長期，導致酸奶可滴定酸度急劇增大。添加米渣蛋白水解物的酸奶滴定酸度在2 h后顯著高于未添加樣。與酸奶發(fā)酵期間pH下降趨勢相同，水解時間越長，可滴定酸度增加速率越高。小分子肽和游離氨基酸促進了乳酸菌在發(fā)酵期間的生長代謝，提高了乳酸菌的產(chǎn)酸能力[15]。發(fā)酵后期所有酸奶的酸度增加趨于平緩，可能是因為乳酸含量的提高抑制了菌種繼續(xù)產(chǎn)酸的能力[16]。

圖3 米渣蛋白水解對酸奶滴定酸度的影響

2.5 米渣蛋白水解物對酸奶質(zhì)構(gòu)特性的影響

質(zhì)構(gòu)儀分析是一門重要的食品分析技術(shù)，通過模擬人體口腔的咬和咀嚼來評價酸奶的質(zhì)構(gòu)特性[17]。硬度是指酸奶達到一定形變需要的力，反映了酸奶凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的強度。黏度是探頭為了測試酸奶的黏附性而做的功，它對酸奶的口感有積極影響，且是控制酸奶穩(wěn)定性的重要因素[18]。內(nèi)聚性表示酸奶內(nèi)部結(jié)合的強度；彈性是指酸奶經(jīng)過第一次壓縮后再恢復的能力，取決于很多因素，如熱處理、蛋白質(zhì)相互作用等[19]。咀嚼性是指酸奶在咀嚼過程中需要的能量。

表5顯示了不同酸奶貯藏期間的質(zhì)構(gòu)特性。由表可知，隨著貯藏時間的延長，所有酸奶的硬度、黏度都逐漸減小。貯藏第1 d，CK硬度為25.05 g，而A24的硬度為29.96 g；A36的硬度為25.06 g。這可能是因為適度水解使得米渣蛋白被分解成的小分子肽和游離氨基酸有利于加強酸奶貯藏期間的蛋白質(zhì)膠束作用[20]，過度水解則會破壞米渣蛋白的小分子活性肽[21]。酸奶的黏度與酸奶固形物的含量，均質(zhì)條件，發(fā)酵溫度等因素有關(guān)[22]。貯藏第21 d，CK的黏度為-21.00 g，而A24的黏度為-30.30 g?？赡苊自鞍仔》肿踊钚噪母玫谋皇葻徭溓蚓捅＜永麃喨闂U菌吸收，酸奶胞外多糖的含量逐漸升高，從而提高了酸奶多糖-多糖，蛋白-多糖的相互作用[23]。由表可知，酸奶的內(nèi)聚性沒有顯著性差異，A24的彈性、咀嚼性明顯高于CK，說明A24具有更好的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。

表5 米渣蛋白水解物對酸奶貯藏期間質(zhì)構(gòu)特性的影響

2.6 米渣蛋白水解物對酸奶持水力的影響

持水力可以反映酸奶凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)保持水分的能力，如果酸奶的持水力不強，會導致乳清析出嚴重，影響酸奶的口感和外觀，貨架期也會縮短。

添加不同水解度水解物的酸奶在貯藏期間持水力的變化如圖4，由圖可知，隨著貯藏時間的延長，酸奶的持水力不斷減小。這是因為貯藏時間的增加導致乳酸菌分泌更多的蛋白水解酶，使得酸奶體系中微小的蛋白質(zhì)亞膠體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而減弱其親和連接作用，造成膠體網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)結(jié)合水含量下降[24]。添加不同水解程度的米渣蛋白水解物時酸奶持水力基本呈先增大后減小趨勢。由圖可知，在貯藏1 d時，CK的持水力為0.54%，而A24的持水力為0.66%，說明添加米渣蛋白水解物顯著提高了酸奶的持水能力。這與劉曉恒[25]發(fā)現(xiàn)酸奶中添加大豆蛋白導致酸奶凝膠結(jié)構(gòu)更加緊密，蛋白質(zhì)膠束連接作用增強，酸奶持水力增加類似。

圖4 米渣蛋白水解物對酸奶貯藏期間持水力的影響

2.7 米渣蛋白水解物對酸奶感官品質(zhì)的影響

感官評價是指通過人的味覺、觸覺、視覺等感官對食品評價的一門科學[26]。酸奶的感官評價主要包括色澤、氣味、滋味、組織狀態(tài)四個方面，每一方面的得分都會影響最后的結(jié)果。不同酸奶的感官得分如表6?？梢钥闯?，添加米渣蛋白水解物的酸奶色澤得分低于空白組，并且其水解時間越長，酸奶的色澤得分越低。由表看出，添加米渣蛋白水解物對酸奶組織狀態(tài)的影響最為顯著。酸奶的組織狀態(tài)與酸奶的硬度、黏度和持水能力密切相關(guān)，其持水能力越高的酸奶凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)越緊密，從外觀表現(xiàn)為組織狀態(tài)好，沒有乳清析出[27]。從感官總分可以看出，A24得分為9.33，明顯高于CK的8.78；說明添加米渣蛋白水解物賦予酸奶一定的大米香味，提高了酸奶的感官特性。

表6 米渣蛋白水解物對酸奶感官品質(zhì)的影響

3 結(jié)論與展望

相比米渣蛋白水解物1%，2%，4%，5%添加量，3%米渣蛋白水解物明顯縮短了酸奶的發(fā)酵時間，在一定水解時間（6~36 h），水解時間越長，米渣蛋白水解物對酸奶促發(fā)酵效果越顯著。在貯藏期間（1~21 d），酸奶的硬度、黏度都呈現(xiàn)下降趨勢。酸奶在貯藏1 d后，A24的硬度較CK提高了19.60%，黏度較CK增加了23.73%；說明適宜水解度下的米渣蛋白水解物顯著改善了酸奶貯藏期的質(zhì)構(gòu)特性。在相同貯藏時間下，A24的持水力明顯高于CK，說明添

加米渣蛋白水解物賦予酸奶較好的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，使其結(jié)合水能力變強。米渣蛋白水解物雖然降低了酸奶的色澤，但提高了酸奶的組織狀態(tài)，改善了酸奶的感官特性。

總體而言，米渣蛋白水解物富含豐富的多肽和氨基酸等成分，通過控制水解時間調(diào)整米渣蛋白水解物合適的水解度，將其添加到酸奶基質(zhì)中，既可以縮短酸奶的發(fā)酵時間，同時有利于酸奶的品質(zhì)。為米渣蛋白在食品工業(yè)中的應用擴大了價值。

本文研究局限于米渣蛋白水解物對酸奶發(fā)酵和品質(zhì)的影響，關(guān)于對嗜熱鏈球菌和乳酸桿菌的生長代謝機制沒有深入的研究，也沒有繼續(xù)探討米渣蛋白水解產(chǎn)物對微生物的基因調(diào)控和表達。這也是今后需要研究的方向之一。