提俊陽，張玉芹，楊恒山，張瑞富，邰繼承，薩如拉，韓鎂琪

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)飼用作物工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古通遼 028000）

0 引言

內(nèi)蒙古自治區(qū)是中國重要的糧食主產(chǎn)區(qū)，玉米作為主要糧食作物大面積連年種植，有些區(qū)域已經(jīng)20年甚至30余年連作，種植結(jié)構(gòu)單一、化肥過量與利用效率低。玉米替代種植可以調(diào)整農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)，但由于過分強調(diào)比較效益，人們放棄了合理輪作體系，形成一種掠奪式的種植結(jié)構(gòu)[1]，玉米長期連作下導(dǎo)致土壤物理性狀惡化[2]、有機質(zhì)含量降低、同一耕層深度內(nèi)的單一養(yǎng)分消耗較多，土壤養(yǎng)分失衡，出現(xiàn)缺肥和偏肥現(xiàn)象[3]。與此同時，土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生改變，導(dǎo)致玉米生理病害、微生物病害和營養(yǎng)失衡頻繁發(fā)生[4-5]，產(chǎn)量多年一直停滯甚至下降，影響糧食持續(xù)增產(chǎn)。因此，解決玉米連作障礙，提升土壤肥力已成為本地區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中亟待解決的重要問題。優(yōu)化耕作制度以最大限度地發(fā)揮植物-土壤反饋的積極作用[6]，科學(xué)合理的輪作模式可緩解連作引起的土壤環(huán)境惡化。研究表明，豆科與禾本科作物輪作中，禾本科作物吸收的氮量有5%～34%來自于前茬豆科作物根瘤所固定的氮素[7]，其增產(chǎn)效果已得到廣泛認可[8]。輪作能夠影響土壤微生物群落生長代謝和群落結(jié)構(gòu)[9-10]，研究表明，玉米-玉米-大豆輪作能夠顯著提高土壤細菌的多個多樣性指數(shù)[11]；相較于玉米連作，玉米-大豆輪作能夠提高總細菌和固氮菌的多樣性并改變了細菌群落結(jié)構(gòu)[12]。在內(nèi)蒙古大豆主產(chǎn)區(qū)建立了玉米-大豆輪作的種植模式[1]，其中呼倫貝爾市大力推行大豆-玉米、大豆-玉米-玉米輪作模式。前人從產(chǎn)量和效益方面也做了研究[13-14]，發(fā)現(xiàn)在旱澇年份，輪作對產(chǎn)量影響效果大于常年[13]。免耕秸稈覆蓋結(jié)合燕麥-大豆-玉米輪作模式增產(chǎn)效果較好[15]；在旱作區(qū)，通過實施多年免耕輪作可實現(xiàn)作物的增產(chǎn)增收[16]。前人對內(nèi)蒙古作物輪作農(nóng)田系統(tǒng)的研究主要集中在輪作周期土壤物理化學(xué)質(zhì)量，土壤微生物生物量碳、氮、磷含量及土壤酶活性的季節(jié)變化、年際變化和空間變異規(guī)律的分析方面；針對大豆玉米輪作模式下土壤固氮細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化未見報道。本研究以連作玉米為對照，以nif-H基因為固氮菌的指示基因，利用高通量測序技術(shù)，分析大豆-玉米和大豆-玉米-玉米2種輪作模式下固氮細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化，并分析其與土壤有機質(zhì)和氮素養(yǎng)分之間的關(guān)系，明確不同輪作方式對土壤養(yǎng)分及固氮細菌的影響，以期為呼倫貝爾市及同類地區(qū)合理的推行米豆輪作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2018—2020年在內(nèi)蒙古呼倫貝爾阿榮旗農(nóng)業(yè)科技園區(qū)(47°56′54″—49°19′35″N,122°02′30″—124°05′40″E)進行。當?shù)貙贉貛Т箨懶园霛駶櫄夂颍昶骄邓?58.4 mm，年有效積溫2394.1℃，無霜期90～130天。土壤類型為黑鈣土，有機質(zhì)31.51 g/kg，全氮1.84 g/kg，有效磷8.97 mg/kg，速效鉀67.66 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

以玉米連作為對照(MMM)，設(shè)大豆-玉米2年輪作周期(MSM)和大豆-玉米-玉米3年輪作周期(SMM)2個處理。大豆選用高產(chǎn)、宜機收品種‘蒙豆30’，采用壟上雙行的種植方式，行距65 cm，株距10～15 cm，種植密度37.5萬株/hm2，底施復(fù)合肥(26-15-10)315 kg/hm2；玉米品種選用‘A6565’，采用等行距65 cm種植，種植密度75000株/hm2，底施復(fù)合肥(26-15-10)450 kg/hm2，于玉米大喇叭口期追施尿素(46-0-0)150 kg/hm2；玉米、大豆均為4月下旬播種，10月初收獲。每處理3次重復(fù)，小區(qū)面積5 m×8 m=40 m2。

1.3 土壤樣品采集

于2020年（8月2日）春玉米吐絲期，各小區(qū)分別取0～20 cm和20～40 cm土層土壤，每個小區(qū)按S型分布取5個樣點，將每小區(qū)相同土層5個樣點的土混合成一個樣品，除去碎石、根系及其他雜物后，充分混合后分成3份，1份裝于已滅菌的5個10 mL試管并置于冰盒中，迅速帶回實驗室，保存于-80℃冰箱中，用于nif-H基因測序；第2份裝于自封袋于-20℃冷凍保存，用于測定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮；第3份風(fēng)干后用于測定土壤有機質(zhì)、全氮和堿解氮含量。具體土樣名稱編號見表1。

表1 不同處理不同土層土樣編號

1.4 土壤養(yǎng)分測定

有機質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化-比色法(A590 nm)測定；土壤全氮采用H2SO4-H2O2消煮后用全自動離子分析儀（easychem，意大利SYSTEA）測定；土壤堿解氮采用堿擴散法測定；土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮采用2 mol/L KCl溶液浸提后，用全自動離子分析儀（easychem，意大利SYSTEA）測定。

1.5 土壤DNA提取和固氮細菌nif-H基因PCR擴增

土壤樣品送至北京奧維森生物技術(shù)公司進行nif-H基因提取及PCR擴增樣品測序，每個試驗樣品取0.3 g土樣，采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit(Omega，CA，USA)試劑盒提取土壤DNA，選用正向引物(5′-AAA GGY GGWATC GGYAAR TCC ACC AC-3′)和反向引物(5′-TTG TTS GCS GCR TACATS GCCATCAT-3′)擴增固氮細菌nif-H基因。PCR反應(yīng)體系包含XμL(30 ng)DNA樣品、1 μL正向引物(5 uM)、1 μL反向引物(5 uM)、3 μL BSA(2 ng/μL)、12.5 μL 2xTaq Plus Master Mix、7.5-X μL dd H2O，總計25 μL；反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)，72℃延伸7 min，置于4℃冰箱內(nèi)保存。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增目的條帶大小，并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化，使用Illumina Miseq高通量測序平臺上機測序。

1.6 PCR擴增產(chǎn)物的質(zhì)量控制

對擴增固氮細菌nif-H基因進行雙端測序，截去條形碼和引物序列后使用FLASH(V1.2.7)對每個樣品的讀長(reads)進行拼接；通過QIIME(V 1.7.0)過濾掉低質(zhì)量的拼接序列，并使用UCHIME算法去除嵌合體；將得到的有效序列通過Uparse C(V7.0.1001)在97%的相似性水平上進行OTUs聚類，對OTUs代表序列進行物種注釋。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019、DPS(V9.5)對不同處理不同土層間土壤養(yǎng)分、在97%一致性閾值下的α樣性指數(shù)(Chao1、ACE、Shannon、Simpson)進行多重比較（LSD法，P＜0.05為具有顯著性差異），并用R軟件(V2.15.3)對不同菌門、屬繪制稀釋曲線、柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土層土壤養(yǎng)分含量

如表2所示，與MMM相比，兩種輪作模式0～20、20～40 cm土層土壤有機質(zhì)、全氮、堿解氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮均顯著增加；MSM土壤有機質(zhì)0～20 cm土層顯著高于SMM，堿解氮和硝態(tài)氮2個土層均顯著高于SMM，全氮和氨態(tài)氮差異不顯著。說明輪作可增加土壤有機質(zhì)和氮素養(yǎng)分含量。

表2 不同輪作模式土壤樣品養(yǎng)分含量

2.2 測序結(jié)果質(zhì)量分析

使用IlluminaMiseq技術(shù)對固氮微生物nif-H基因測序分析，經(jīng)進一步去除嵌合體、短序列等，6個樣品共得到原始序列256133條，經(jīng)進一步去除嵌合體、短序列后得到優(yōu)質(zhì)序列244033條。如圖1所示，序列數(shù)量達到20000時稀釋性曲線均趨于平坦，說明此測序深度獲得序列數(shù)據(jù)量可以反映土壤樣品固氮微生物信息。

圖1 不同輪作模式土壤樣品稀釋曲線

2.3 不同輪作模式固氮細菌的多樣性

從表3可知，相較于MMM、MSM和SMM固氮細菌Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在0～20 cm土層和20～40 cm土層均顯著增加，輪作1年周期MSM高于2年周期SMM；Shannon多樣性和Simpson多樣性在0～20 cm土層MSM與SMM間差異不顯著，但均顯著高于MMM，20～40 cm土層MSM顯著高于MMM。

表3 固氮細菌多樣性指數(shù)

2.4 土壤固氮細菌群落結(jié)構(gòu)分析

通過對樣品獲得的OTUs進行歸類，得到15個門、23個綱、56個目、89個科和163個屬。由圖2可知，MMM、MSM、SMM各組樣品優(yōu)勢菌門主要分布在變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacteria)，這3個門的OTUs豐度占所有固氮菌門的87.68%～91.5%。其中，他們的豐度分別為81.59%～88.0%、0.2%～5.2%和1.13%～2.9%。MSM和SMM的0～20 cm和20～40 cm土層變形菌門相對豐度相較于MMM均有所提高(0.17%、0.17%；3.57%、1.06%)，MSM較SMM變形菌門0～20 cm土層相對豐度沒有顯著差異，20～40 cm土層提高2.5%。

圖2 不同輪作方式土壤在門分類水平上nif-H基因的分布

從圖3可知，各組樣品優(yōu)勢菌屬包括12個屬，他們分別是慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、斯科曼氏球菌屬(Skermanella)、偽食酸菌屬(Pseudacidovorax)、地桿菌屬(Geobacter)、厭氧粘桿菌屬(Anaeromyxobacter)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、甲基孢囊菌屬(Methylocystis)、脫硫菌屬(Desulfarculus)、脫氯單胞菌屬(Dechloromonas)、弗蘭克氏菌屬(Frankia)、固氮弧菌屬(Azoarcus)和纖毛菌屬(Leptothrix)，占所有菌屬的73.39%～82.21%。與MMM相比，MSM和SMM的0～20 cm土層慢生根瘤菌屬(8.18%、6.36%)、未知菌屬(2.87%、4.72%)、弗蘭克氏菌屬(0.02%、0.07%)和纖毛菌屬(0.02%、1.30%)相對豐度均有所提高；20～40 cm土層慢生根瘤菌屬(10.24%、9.73%)、偽食酸菌屬(5.64%、2.32%)、地桿菌屬(0.66%、1.74%)和固氮弧菌屬(2.08%、0.38%)相對豐度均有所提高。MSM與SMM相比，0～20、20～40 cm土層慢生根瘤菌屬(1.83%、0.52%)、甲基孢囊菌屬(4.76%、2.84%)和固氮弧菌屬(0.46%、1.70%)均有所提高。

圖3 不同輪作方式土壤在屬分類水平上nif H基因的分布

2.5 土壤固氮細菌多樣性指數(shù)和優(yōu)勢菌屬與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析

從表4可知，Chao1、ACE指數(shù)與各養(yǎng)分指標均呈正相關(guān)，OM達到顯著水平，AN、NO3--N達到極顯著水平；Shannon、Simpson指數(shù)與AN、NO3--N呈正相關(guān)，與OM、TN、NH4+-N呈負相關(guān)。

表4 土壤固氮細菌多樣性指數(shù)與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析

從表5所示，慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)與各養(yǎng)分指標呈正相關(guān)，OM、TN、NH4+-N達到極顯著水平；斯科曼氏球菌屬(Skermanella)與各養(yǎng)分指標呈負相關(guān)；偽食酸菌屬(Pseudacidovorax)與各養(yǎng)分指標呈負相關(guān)，TN、NH4+-N達到極顯著水平；地桿菌屬(Geobacter)與NH4+-N呈正相關(guān)，與其他養(yǎng)分指標呈負相關(guān)；厭氧粘桿菌屬(Anaeromyxobacter)與各養(yǎng)分指標呈正相關(guān)；固氮螺菌屬(Azospirillum)與各養(yǎng)分指標呈負相關(guān)；甲基孢囊菌屬(Methylocystis)與OM、TN、NH4+-N呈負相關(guān)，與AN、NO3--N呈正相關(guān)；脫硫菌屬(Desulfarculus)與各養(yǎng)分指標呈正相關(guān)；脫氯單胞菌屬(Dechloromonas)與各養(yǎng)分指標呈負相關(guān)；弗蘭克氏菌屬(Frankia)與AN呈正相關(guān)，與其他各養(yǎng)分指標呈負相關(guān)；固氮弧菌屬(Azoarcus)與各養(yǎng)分指標呈正相關(guān)；纖毛菌屬(Leptothrix)與各養(yǎng)分指標呈負相關(guān)。

表5 土壤固氮細菌優(yōu)勢菌屬與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

相較于玉米連作，大豆-玉米-玉米輪作和大豆-玉米輪作明顯提高土壤養(yǎng)分和有機質(zhì)含量，增加了土壤固氮細菌豐度和多樣性，提高了變形菌門和慢生根瘤菌屬的相對豐度。2種輪作模式下，固氮細菌大豆-玉米2年輪作周期下豐度較高。固氮細菌豐度指數(shù)與有機質(zhì)、堿解氮和硝態(tài)氮呈顯著正相關(guān)，有機質(zhì)、全氮和銨態(tài)氮對優(yōu)勢菌屬影響較大。

4 討論

4.1 大豆-玉米輪作對玉米土壤固氮細菌豐度及多樣性的影響

土壤養(yǎng)分的差異是影響土壤微生物群落豐度和多樣性的主要原因之一[17]。作物輪作多樣性和作物殘茬影響作物活力和相關(guān)微生物[18]，大豆玉米輪作模式通過輪換種植不同作物，不同作物對土壤養(yǎng)分偏耗不同，不同作物殘茬改變了土壤養(yǎng)分，對土壤微生物豐度和多樣性影響顯著[19]。與營養(yǎng)元素相比，微生物組更好地預(yù)測作物生物量和產(chǎn)量[18]；本研究發(fā)現(xiàn)，大豆-玉米和大豆-玉米-玉米輪作模式下固氮細菌的多樣性和豐度均改變，0～20 cm土層MSM和SMM豐度指標Chao1和ACE與多樣性指標Shannon和Simpson均顯著高于MMM；2種輪作模式相比較，MSM豐度指標Chao1和ACE顯著高于SMM。作物影響土壤生物群落的主要手段是通過有機物的輸入，大豆和固氮細菌之間的相互作用，促進土壤碳儲存[6]；土壤碳和氮等養(yǎng)分是土壤固氮細菌豐度及群落改變的主要影響因素[20]，固氮細菌所需能量主要源于土壤有機質(zhì)，MSM土壤固氮細菌豐度顯著高于SMM，這可能由于MSM的有機質(zhì)養(yǎng)分含量高，為固氮菌生長提供較多的碳源；而SMM和MMM土壤養(yǎng)分含量低，限制了固氮細菌的生長。此外，固氮細菌多樣性與作物殘茬和根系分泌物關(guān)系密切[21]，根系分泌物顯著增加了土壤中與氮循環(huán)生物過程相關(guān)的基因，如固氮等[22]，MSM土壤固氮細菌的豐富度和多樣性較高，可能由于根系分泌物和殘茬較多，根系分泌物誘導(dǎo)了更高的養(yǎng)分礦化，以幫助植物調(diào)節(jié)微生物的募集，以滿足更快生長時期對養(yǎng)分的需求[22]。同時，后茬作物玉米輪作兩年實際上又造成了禾本科作物的連作也是其原因之一。相關(guān)性分析表明，有機質(zhì)、堿解氮、硝態(tài)氮對固氮細菌豐度指數(shù)的提高影響顯著，Chao1、ACE指數(shù)與有機質(zhì)、堿解氮、硝態(tài)氮達到顯著正相關(guān)。HU等[23]研究表明，土壤pH、全氮和硝態(tài)氮是調(diào)控固氮菌網(wǎng)絡(luò)的主要因子。因此，土壤養(yǎng)分可利用性提高，有利于固氮細菌生長繁殖，土壤微生物多樣性升高[24]。

4.2 大豆-玉米輪作對固氮細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

作物輪作能使土壤中聚集多種作物殘茬和作物根系分泌物，使土壤內(nèi)微生物生長和繁殖所需的營養(yǎng)成分均衡，從而改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。研究表明，不同輪作模式下土壤固氮細菌的群落結(jié)構(gòu)有所不同[25-26]，輪作方式、種植年限等因素會導(dǎo)致研究結(jié)果產(chǎn)生差異[27-28]。本研究中，2種輪作模式土壤固氮優(yōu)勢門和屬類群相似，以變形菌門和慢生根瘤菌屬為主，相較于MMM、MSM和SMM 2個土層的變形菌門相對豐度較高，慢生根瘤菌屬也較高，兩種輪作方式下，MSM高于SMM。豆科作物與禾本科作物輪作可以提高土壤有機碳含量[29]，MSM土壤有機質(zhì)含量高和玉米生長旺盛根系分泌物較多，它們共同作用可能促進變形菌門菌群生長，導(dǎo)致變形菌門相對豐度顯著高于SMM和MMM。HU等[23]研究了連續(xù)35年單施或配施含氮、磷或鉀的無機肥對東北黑土固氮微生物群落豐度和組成的影響，發(fā)現(xiàn)施氮肥處理固氮菌群落以α-變形菌綱（屬水平上的慢生根瘤菌）為主；本研究中慢生根瘤菌屬相對豐度MSM最高，可能由于其前茬種植大豆，慢生根瘤菌屬是大豆進行根瘤固氮的主要菌屬[30]，而大豆殘茬的存在導(dǎo)致次年土壤內(nèi)慢生根瘤菌屬相對豐度較高。最近的研究表明凋落物的輸入類型可以強烈地影響土壤生物群落分解有機化合物的能力，并導(dǎo)致微生物群落向特定凋落物類型分化[6]；土壤有機物質(zhì)輸入的類型、速率和時間是土壤微生物群落的重要驅(qū)動力[6]；大豆玉米輪作農(nóng)田系統(tǒng)中作物秸稈類型多樣化，大豆和玉米秸稈分解速率不同，還入土壤的時間不同，這可能是輪作微生物多樣性不同于玉米連作的原因。

植物根系的位置是控制細菌群落的主要因素，其次是發(fā)育階段和土壤類型[31]；本研究中MSM和SMM對不同土層固氮菌的影響有所不同，0～20 cm土層弗蘭克氏菌屬相對豐度有所提高，20～40 cm土層中均提高了偽食酸菌屬和固氮弧菌屬相對豐度。弗蘭克氏菌是一種能與非豆科植物共生形成根瘤并實現(xiàn)生物固氮的放線菌[32]，其固氮效率遠遠高于豆科植物根瘤菌，還能夠促進宿主植物對旱寒等各種不同生境的適應(yīng)性[33]，在重金屬污染土壤復(fù)墾中弗蘭克氏菌與其宿主的共生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[34-35]；偽食酸菌具有固氮作用[36]。因此，大豆玉米輪作增加了土壤中固氮效率高多功能的有益微生物類群。研究表明，變形菌門的細菌大多屬于異養(yǎng)型微生物，其中包含許多與碳循環(huán)有關(guān)的細菌，可用來指示土壤肥力狀況[37]；慢生根瘤菌在多種環(huán)境中普遍存在，土壤中處于優(yōu)勢地位[38]，慢生根瘤菌與叢枝菌根真菌協(xié)同作用顯著提高了結(jié)瘤、固氮、營養(yǎng)、種子產(chǎn)量和生物量[39]；本研究中，優(yōu)勢菌屬與養(yǎng)分的相關(guān)性分析表明，慢生根瘤菌屬、厭氧粘桿菌屬、脫硫菌屬、固氮弧菌屬與有機質(zhì)、全氮、堿解氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮呈正相關(guān)，其中慢生根瘤菌屬與有機質(zhì)、全氮、銨態(tài)氮呈極顯著正相關(guān)，說明微生物與土壤養(yǎng)分之間的正相關(guān)關(guān)系表明豆米輪作土壤碳、氮養(yǎng)分的增加僅對共生固氮菌慢生根瘤菌屬有促進作用。輪作條件下固氮細菌和參與碳循環(huán)細菌之間的耦合關(guān)系值得進一步研究。