雷豆豆 ， 馬潤(rùn)然 ， 王伽伯 ， 孔維軍

1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137

農(nóng)藥殘留是指農(nóng)藥使用一段時(shí)間后未被完全分解而殘留于生物體、農(nóng)產(chǎn)品、土壤、水、大氣中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱［1］。目前，農(nóng)藥的不合理施用現(xiàn)象普遍存在，農(nóng)藥殘留是影響我國(guó)食品業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人們身心健康的重要因素，有研究發(fā)現(xiàn)全國(guó)23個(gè)大中城市的大型蔬菜批發(fā)市場(chǎng)中，有47%的蔬菜中農(nóng)藥殘留超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

農(nóng)藥殘留的靈敏與準(zhǔn)確檢測(cè)是保障食品質(zhì)量和安全的重要手段。隨著科技的快速發(fā)展，我國(guó)在食品農(nóng)殘檢測(cè)及新技術(shù)開發(fā)等方面已取得了巨大進(jìn)步，特別是在利用生物技術(shù)進(jìn)行農(nóng)殘精準(zhǔn)檢測(cè)方面，不僅能保證農(nóng)殘檢測(cè)的質(zhì)量與效率，也能為人們的生命安全保障作出積極貢獻(xiàn)，促進(jìn)我國(guó)社會(huì)和諧穩(wěn)定發(fā)展［2］。本綜述分析了食品中農(nóng)藥殘留的現(xiàn)狀，強(qiáng)化了農(nóng)殘檢測(cè)的意義，并且詳細(xì)總結(jié)了近年來(lái)生物技術(shù)在食品農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為相關(guān)領(lǐng)域的農(nóng)藥殘留分析提供參考。

1 食品農(nóng)藥殘留及檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀

近年來(lái)，食品中農(nóng)藥殘留情況不僅涉及領(lǐng)域廣，而且發(fā)生率和殘留量較高，超標(biāo)現(xiàn)象非常嚴(yán)重。土豆、菠菜、西紅柿、西瓜、蘋果等各類瓜果蔬菜中均能檢測(cè)出農(nóng)藥殘留。2017—2019年，吉林省286份出售蔬菜中農(nóng)藥殘留總檢出率為69.93%，超標(biāo)率為5.94%［3］。2019—2021年，江蘇省25 197份蔬菜中農(nóng)殘檢出率為24.2%，超標(biāo)率為0.84%［4］。2022年，重慶9個(gè)區(qū)縣778份蔬菜中農(nóng)殘檢出率為55.53%，超標(biāo)率為2.83%，327批水果檢出率為42.20%，超標(biāo)率為1.22%［5］。食品中農(nóng)藥污染及殘留超標(biāo)已成為人們普遍關(guān)注的問題。

我國(guó)是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國(guó)，兩者均居世界首位［6］。我國(guó)施用農(nóng)藥面積在2.8×108hm2以上，每年用量50～60萬(wàn)t，除30%左右被作物等吸收外，大部分農(nóng)藥流失在土壤、水體、農(nóng)產(chǎn)品和空氣中，使它們?cè)馐懿煌潭鹊奈廴荆?］。此外，隨著用藥量和用藥次數(shù)增加，食品中農(nóng)藥的殘留量也進(jìn)一步提高，不僅影響食品質(zhì)量和安全，還會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大危害。此外，農(nóng)藥殘留還會(huì)影響食品出口貿(mào)易，因此，需要對(duì)農(nóng)殘的限量及農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)提出更高的要求，從而進(jìn)一步提高我國(guó)食品的質(zhì)量，保障人民飲食安全，同時(shí)還可以更好地推動(dòng)我國(guó)食品對(duì)外貿(mào)易的發(fā)展［8］。當(dāng)前，各級(jí)政府及質(zhì)檢部門高度重視食品安全問題，制定了100余種農(nóng)藥殘留的限量標(biāo)準(zhǔn)，并出臺(tái)了一系列農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法和技術(shù)手段，為農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供了技術(shù)支持。傳統(tǒng)質(zhì)譜法和色譜法被視為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在設(shè)備笨重、樣品前處理復(fù)雜、成本較高、對(duì)操作人員要求嚴(yán)苛等缺點(diǎn)，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速、大批量樣品檢測(cè)的需求，這也促進(jìn)了新型生物技術(shù)的發(fā)展及其在食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用。

2 基于生物技術(shù)的食品農(nóng)殘檢測(cè)

近年來(lái)，免疫分析和生物傳感器等生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用吸引了全世界的廣泛關(guān)注，不僅檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便，而且靈敏度和精確度較高，可滿足現(xiàn)場(chǎng)快速、大批量樣品的檢測(cè)需求。

2.1 免疫分析技術(shù)

免疫分析是農(nóng)殘檢測(cè)的重要方法之一，其利用抗原-抗體的特異識(shí)別反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定性定量檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已在食品的農(nóng)殘檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用［9］，主要包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、熒光免疫分析法（fluorescence immunosorbent assay，F(xiàn)LISA）、生物條形碼免疫法（bio-barcode immunoassay，BCIA）等。

2.1.1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）是目前最常用的免疫測(cè)定方法之一，其基于抗原-抗體識(shí)別反應(yīng)特異性和酶高效催化底物的特性，通過(guò)酶作用后顯色的深淺來(lái)達(dá)到定性或定量檢測(cè)的目的［10］，具有操作簡(jiǎn)單、預(yù)處理速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確度高、易普及、成本低、可高通量分析、對(duì)工作人員的專業(yè)技能要求不高等優(yōu)點(diǎn)，特別適合大量樣本的快速篩查［11］。

近年來(lái)，研究者們對(duì)ELISA技術(shù)在食品中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方面開展了大量研究。Navarro等［12］將毒死蜱（chlorpyrifos）和倍硫磷（fenthion）農(nóng)藥的2種單獨(dú)ELISA試驗(yàn)整合開發(fā)了雙聯(lián)ELISA法，實(shí)現(xiàn)了天然和商業(yè)橘汁樣品中2種有機(jī)磷殺蟲劑（organophosphorous insecticides，OPPs）的殘留檢測(cè)（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的雙聯(lián)ELISA測(cè)定，通過(guò)簡(jiǎn)單的樣品稀釋，沒有額外的樣品清理程序，在40 min內(nèi)即可完成。對(duì)毒死蜱和倍硫磷的檢測(cè)限（limits of detection，LODs）分別為0.20±0.04 μg·L-1和0.50±0.06 μg·L-1，回收率在95%～106%之間。邢瑋瑋和陳燕敏［13］通過(guò)ELISA技術(shù)測(cè)定食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，同時(shí)對(duì)比氣相/液相色譜法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ELISA測(cè)定結(jié)果的可靠性更高，且操作更簡(jiǎn)便。Hongsibsong等［14］開發(fā)了一種室內(nèi)間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法（ic-ELISA）用于檢測(cè)來(lái)自泰國(guó)部分地區(qū)菜市場(chǎng)采集的蔬菜樣品中的毒死蜱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法對(duì)毒死蜱的IC50為0.80 μg·kg-1，敏感性較高，對(duì)其他有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)較低，對(duì)毒死蜱的加標(biāo)回收率范圍為95.3%～117.8%（平均值為102.9%）。他們的結(jié)果顯示，黃瓜、芫荽和牽?；ㄖ卸舅莉鐨埩羲阶罡?，分別為275、145和35.3 μg·kg-1，陽(yáng)性樣品中毒死蜱的最高中位數(shù)水平為大白菜（332 μg·kg-1）、黃瓜（146.3 μg·kg-1）和羽衣甘藍(lán)（26.95 μg·kg-1）。同時(shí)，所有的陽(yáng)性樣品均經(jīng)氣相色譜-火焰光度檢測(cè)法（gas chromatography-flame photomebric detection， GC-FPD）驗(yàn)證。

圖1 雙聯(lián)ELISA法檢測(cè)毒死蜱和倍硫磷[12]Fig. 1 Detection of chlorpyrifos and fenthion by double ELISA[12]

雖然ELISA是當(dāng)下較為理想的食品農(nóng)殘檢測(cè)的重要技術(shù)之一，但其對(duì)試劑的選擇性高，對(duì)結(jié)構(gòu)相似的化合物易出現(xiàn)不同程度的交叉反應(yīng)。未來(lái)需要從抗體研發(fā)入手，加速不同ELISA檢測(cè)試劑盒的研發(fā)，更好地普及和推廣ELISA檢測(cè)技術(shù)。

2.1.2熒光免疫分析法 熒光免疫分析法（FLISA）是一種將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性和熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來(lái)的分析方法?；驹硎且詿晒馑貥?biāo)記抗原或抗體，再與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)，于熒光顯微鏡下觀察，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)。常用的FLISA可分為直接熒光法和間接熒光法，其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在專一性強(qiáng)、靈敏度高、實(shí)用性好、操作簡(jiǎn)單快捷、檢測(cè)成本適中等［15］。

廖蕓等［16］建立了一種基于CdSe/ZnS量子點(diǎn)（QDs）的快速、簡(jiǎn)便、靈敏的FLISA法以檢測(cè)農(nóng)藥三唑磷。他們以CdSe/ZnS QDs作為攜帶單克隆抗體（mAb）的探針，游離的三唑磷分子和卵清蛋白（ovalbumin，OVA）修飾的半抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合探針表面的mAb，通過(guò)記錄探針的熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)三唑磷的快速檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法對(duì)三唑磷的 線 性 響 應(yīng) 范 圍 為0.01～25.00 μg·L-1，檢 測(cè) 限（IC10）為0.508 ng·L-1，加 標(biāo) 樣 品 的 回 收 率 在82.6%～96.6%之間，為食品、農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中痕量三唑磷農(nóng)藥的靈敏檢測(cè)提供了可靠的方法。為了實(shí)現(xiàn)多種農(nóng)藥殘留的同時(shí)檢測(cè)，姜名荻等［17］建立了一種可同時(shí)檢測(cè)3種農(nóng)藥的仿生熒光免疫分析方法（biomimetic FLISA）。他們以2-（二乙氧基磷酸）乙酸為模板分子，F(xiàn)e3O4@SiO2為支撐材料，制備了具有多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)和較高吸附能力的超順磁性核殼類分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）。進(jìn)而以Fe3O4@SiO2@MIP作為仿生抗體，QDs為標(biāo)記物，可實(shí)現(xiàn)甲基對(duì)硫磷、毒死蜱和敵百蟲等3種有機(jī)磷農(nóng)藥的仿生熒光免疫檢測(cè)。在優(yōu)化條件下，該方法對(duì)甲基對(duì)硫磷、毒死蜱和敵百蟲的最低檢出限分別為0.21±0.021 μg·L-1、0.44±0.069 μg·L-1和0.32±0.033 μg·L-1，在添加了靶標(biāo)農(nóng)藥的蘋果和柑橘樣品中回收率為73.1%～119.3%，并可用于梨、胡蘿卜、獼猴桃和香蕉樣品中3種農(nóng)藥的檢測(cè)，且分析結(jié)果與氣相色譜法結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

2.1.3生物條形碼免疫法 生物條形碼免疫法（BCIA）是將具有信號(hào)放大作用的寡聚核苷酸鏈作為探針，以一定的方式結(jié)合到納米材料（如金納米顆粒，AuNPs）表面，形成多級(jí)放大體系，在外加磁場(chǎng)作用下以磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）分離，將生物條形碼解離下來(lái)，測(cè)定其含量，從而將目標(biāo)物的檢測(cè)轉(zhuǎn)換為探針檢測(cè)，間接得到待測(cè)物的含量，顯著提高了檢測(cè)的靈敏性［18］，因其靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、成本低、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，已被用于農(nóng)殘的檢測(cè)。

Wang等［19］首次將熒光定量PCR技術(shù)引入競(jìng)爭(zhēng)性生物條形碼免疫分析法中，以檢測(cè)農(nóng)藥等小分子化合物（圖2A）。他們將抗體與烷基硫醇封端DNA（捕獲DNA）和生物編碼DNA組裝到AuNPs上，制備了生物條形碼AuNPs探針。然后將MNPs和OVA與小分子半抗原結(jié)合，制備磁性納米粒子探針。由于顆粒富集，少量靶標(biāo)可以轉(zhuǎn)換為大量條形碼，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)三唑磷農(nóng)藥的高靈敏分析，LOD為0.02 ng·mL-1，比ELISA法低10～20倍。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)又開發(fā)了一種基于多修飾AuNPs和熒光信號(hào)放大的競(jìng)爭(zhēng)型生物條形碼擴(kuò)增免疫分析法檢測(cè)三唑磷農(nóng)藥［20］（圖2B）。他們采用單克隆抗體和6-羧基熒光素標(biāo)記的單鏈硫醇寡核苷酸（6-FAM-SH-ssDNAs）修飾AuNPs，6-FAM熒光被AuNPs淬滅。然后將OVA連接的半抗原包被在微孔板底部，與樣品中的三唑磷競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合AuNPs探針上的抗體。研究所監(jiān)測(cè)到的熒光強(qiáng)度與分析物濃度成反比。在最佳條件下，鹽漬過(guò)程縮短到1 h，每個(gè)AuNP上可固定166±9條ssDNA，然后采用二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）取代復(fù)合物上的6-FAM-SH-ssDNA，通過(guò)記錄釋放的熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)三唑磷的檢測(cè)。該方法對(duì)三唑磷的LOD低至6 ng·L-1，相比上一項(xiàng)研究，其靈敏度得到顯著提升，不僅能實(shí)現(xiàn)水、大米、黃瓜、卷心菜和蘋果樣品中三唑磷的靈敏測(cè)定，且與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）之間具有良好的相關(guān)性［19］。張秀宛等［21］開發(fā)了基于反復(fù)DNARNA雜交循環(huán)和核糖核酸酶H（RNase H）分解熒光團(tuán)的生物條形碼多殘留免疫分析法用于檢測(cè)三唑磷農(nóng)藥（圖2C）。他們將附著在AuNPs上的mAbs涂上DNA寡核苷酸作為信號(hào)發(fā)生器，并使用互補(bǔ)的熒光RNA進(jìn)行信號(hào)放大。通過(guò)DNA-RNA雜交和RNase H分解熒光基團(tuán)生成檢測(cè)信號(hào)。而RNase H只分解DNA-RNA雙鏈，不裂解單鏈或雙鏈DNA。因此，通過(guò)反復(fù)的DNA-RNA雜交循環(huán)可以獲得足夠強(qiáng)的信號(hào)，用于定量檢測(cè)三唑磷殘留。在優(yōu)化條件下，該方法對(duì)三唑磷展現(xiàn)了較寬的線性范圍（0.01～100 ng·mL-1）和較高的靈敏度（LOD為0.003 2 ng·mL-1），且具有穩(wěn)定性和重復(fù)性好、殘留檢測(cè)可靠等優(yōu)點(diǎn)，為食品和農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏檢測(cè)提供了一種新方法。

圖2 生物條形碼免疫法檢測(cè)三唑磷[19-21]Fig. 2 Detection of triazophos by biological bar code immunoassay[19-21]

免疫分析方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，非常適于大批量食品中農(nóng)藥殘留的快速篩查和定量分析，但是在特異性多元化檢測(cè)方面仍然存在局限性，未來(lái)可通過(guò)制備群選型抗體和提高抗原抗體的親和力等手段實(shí)現(xiàn)食品中多種農(nóng)藥的同時(shí)高靈敏檢測(cè)。

2.2 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器是由生物感受器（識(shí)別元件）和換能器及信號(hào)放大裝置構(gòu)成的一種分析檢測(cè)工具［21］。作為一種新型農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)，其利用生物活性物質(zhì)（如酶、微生物、細(xì)胞等）來(lái)實(shí)現(xiàn)食品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。含靶標(biāo)農(nóng)藥的樣品溶液擴(kuò)散后與生物識(shí)別元件匯集，傳感器的生物敏感層迅速和待測(cè)農(nóng)藥會(huì)以酶-底物、抗原-抗體、核酸-互補(bǔ)片段等方式進(jìn)行特異性識(shí)別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生顏色、電流、熒光等信號(hào)變化，由換能器轉(zhuǎn)換成可定量處理的信號(hào)形式，經(jīng)特定儀表放大處理后被記錄，從而獲得待檢靶標(biāo)農(nóng)藥的數(shù)量和濃度信息［22-23］。

識(shí)別元件是構(gòu)建生物傳感器的關(guān)鍵，通常情況下按識(shí)別元件可分為酶?jìng)鞲衅?、免疫傳感器、微生物傳感器、DNA/適配體（aptamer）傳感器和細(xì)胞傳感器等。生物傳感技術(shù)具有諸多優(yōu)勢(shì)，如操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好、傳感反應(yīng)速度快、靈敏性高、檢測(cè)成本低且易于實(shí)現(xiàn)快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等，近年來(lái)在食品農(nóng)殘檢測(cè)方面被廣泛研究和利用。

2.2.1電化學(xué)生物傳感器 電化學(xué)傳感器是生物傳感器發(fā)展史上首個(gè)報(bào)告的商業(yè)化生物傳感器［24］。其工作原理是以固體電極（如金電極、玻碳電極等）為基礎(chǔ)電極，將生物敏感分子（如抗體、適配體等）固定于電極表面，進(jìn)而選擇性地識(shí)別目標(biāo)分子并將其捕獲到電極表面，基礎(chǔ)電極作為信號(hào)傳導(dǎo)器將電極表面發(fā)生的識(shí)別反應(yīng)信號(hào)導(dǎo)出，變成可測(cè)量的電信號(hào)（如電流、阻抗等），從而對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性定量分析。電化學(xué)生物傳感器直接將物理技術(shù)與生物技術(shù)相結(jié)合，兼具物理學(xué)的高靈敏性、高準(zhǔn)確率和生物學(xué)的特異選擇性，其以靈敏度高、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、成本低、可在線分析等優(yōu)點(diǎn)［25］在食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中備受青睞。

Kaur等［26］將自行制備的農(nóng)藥馬拉硫磷抗體固定在聚乙烯二氧噻吩-羧基化多壁碳納米管（PEDOT-c-MWCNTs）修飾的氟-氧化錫（fluorine tin oxide，F(xiàn)TO）電極上構(gòu)建了可檢測(cè)馬拉硫磷的電化學(xué)免疫傳感器。當(dāng)待測(cè)溶液中存在馬拉硫磷時(shí)，抗體特異捕獲馬拉硫磷，使電極的阻抗發(fā)生變化，信號(hào)探針鐵離子的電化學(xué)信號(hào)也隨之變化，進(jìn)而可實(shí)現(xiàn)馬拉硫磷的靈敏檢測(cè)，LOD為1.1 fM。所制備的電化學(xué)免疫傳感器成功應(yīng)用于萵苣等食品的農(nóng)殘檢測(cè)，回收率高于液相色譜法。但該研究以活體家兔制備抗體，過(guò)程繁瑣且成本較高，同時(shí)所得到的抗體易受多種實(shí)驗(yàn)條件的影響，在一定程度上限制了電化學(xué)免疫傳感器的發(fā)展。

在檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥的電化學(xué)酶抑制型生物傳感器中，常以乙酰膽堿作為底物。如Chen等［27］制備了MWCNTs/鄰苯二甲酸酯的絲網(wǎng)印刷電極（screen-printed electrode，SPE）固定乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE），進(jìn)而開發(fā)了電化學(xué)AChE傳感器以實(shí)現(xiàn)毒死蜱農(nóng)藥的原位檢測(cè)。該復(fù)合電極對(duì)硫代乙酰膽堿的氧化具有催化作用，在放大其氧化的電化學(xué)信號(hào)的同時(shí)，可以降低檢測(cè)時(shí)電位窗口的干擾。同時(shí)，所制備的修飾電極對(duì)AChE具有良好的親和性，顯著提升了傳感器的穩(wěn)定性。在優(yōu)化條件下，該傳感器對(duì)毒死蜱的LOD低至0.05 μg·L-1，可用于蔬菜樣品中低濃度毒死蜱的檢測(cè)。但值得注意的是，AChE的穩(wěn)定性較差，可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性。為此，研究者們致力于合成生物相容性好的高穩(wěn)定性復(fù)合材料以提升傳感器的穩(wěn)定性。如Hu等［28］制備了一種新型圖形化結(jié)構(gòu)的AChE傳感器檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥?；诙趸仯═iO2）和殼聚糖（chitosan，CS）良好的生物相容性，他們以TiO2-CS溶膠的凝膠復(fù)合物修飾玻碳電極組裝生物傳感器。該溶膠-凝膠復(fù)合物中存在大量的孔隙，有利于AChE酶的粘附和電子轉(zhuǎn)移，大大增強(qiáng)了傳感器的穩(wěn)定性。該傳感器首次采用了圖形化的新型結(jié)構(gòu)，對(duì)敵敵畏的檢測(cè)范 圍 為1.13 nmol·L-1～22.6 μmol·L-1，LOD 為0.23 nmol·L-1，為蔬菜汁中敵敵畏農(nóng)藥的高靈敏檢測(cè)提供了一條新途徑。電化學(xué)酶抑制型傳感器具有技術(shù)較成熟、響應(yīng)快、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，但易受重金屬及其他氨基甲酸酯類農(nóng)藥的影響，特異性較低。此外，酶的穩(wěn)定性較差，其活性易受外界環(huán)境的干擾，在一定程度上限制了該類型生物傳感器在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用。

適配體對(duì)靶分子的高特異性和親和力使電化學(xué)適配體傳感器逐漸成為食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的熱點(diǎn)。在另一項(xiàng)研究中，F(xiàn)an等［29］基于六氰基鐵酸鎳納米顆粒（NiHCF NPs）和電化學(xué)還原氧化石墨烯（electrochemical reduction of graphene oxide，ERGO），在 玻 碳 電 極（glassy carbon electrode，GCE）上設(shè)計(jì)了一種用于檢測(cè)阿特拉津的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)適配傳感器。他們首先將NiHCF NPs固定在ERGO/GCE電極上作為信號(hào)探針，然后利用電沉積AuNPs固定適配體提高電極的導(dǎo)電性和穩(wěn)定性。樣品中存在的待測(cè)阿特拉津分子被傳感器表面的適配體捕獲形成“阿特拉津-適配體”復(fù)合物，阻礙電子轉(zhuǎn)移和導(dǎo)電性檢查，使電化學(xué)信號(hào)降低，記錄電化學(xué)信號(hào)的變化可定量檢測(cè)阿特拉津。該電化學(xué)適配體傳感器對(duì)阿特拉津表現(xiàn)出高選擇性和高靈敏度（LOD低至0.1 pmol·L-1）。為了提高農(nóng)藥的檢測(cè)通量，Zhu等［30］基于碳納米角/蒽醌-2-羧酸/金納米顆粒（CNHs/AQ/AuNPs）復(fù)合物的比率型電化學(xué)適配體傳感器同時(shí)檢測(cè)馬拉硫磷（malathion， MAL）和 氧 化 樂 果（omethoate，OMT）。他們通過(guò)室溫方法合成的CNHs/AQ/AuNPs復(fù)合材料用作基底以產(chǎn)生參比信號(hào)（IAQ）并放大響應(yīng)信號(hào)，然后在該基底上固定發(fā)夾DNA（hDNA），以提供獨(dú)立和特異的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)一步吸附亞甲基藍(lán)標(biāo)記的MAL適配子（MB-Apt1）和二茂鐵（Fc）標(biāo)記的OMT適配體（Fc-Apt2）。當(dāng)樣品存在的MAL或OMT與適配體結(jié)合后使MB-Apt1或Fc-Apt2從傳感器表面釋放下來(lái)，導(dǎo)致MB或Fc的電流信號(hào)（IMB或IFc）降低，而參比信號(hào)保持不變?；诖?，通過(guò)記錄并計(jì)算（IMB/IAQ或IFc/IAQ）可同時(shí)定量待測(cè)食品中MAL和OMT的殘留水平。CNHs/AQ/AuNPs具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和較大的比表面積，hDNA具有穩(wěn)定的二維結(jié)構(gòu)，使該電化學(xué)適配體傳感器具有較高的靈敏度、選擇性和可靠性，對(duì)MAL和OMT的LODs分別低至1.3和2.8 pg·mL-1，在萵苣和西紅柿樣品中的加標(biāo)回收率分別為95.0%～105.0%和93.0%～101.2%，為實(shí)際樣品中馬拉硫磷和氧化樂果的低濃度殘留檢測(cè)提供了較好的技術(shù)支撐。作為一小段DNA或RNA序列，適配體的生物化學(xué)性質(zhì)較酶和抗體更穩(wěn)定，且合成簡(jiǎn)單、易修飾，可標(biāo)記或修飾多種電化學(xué)活性物質(zhì)。但是，目前報(bào)道的農(nóng)藥適配體序列有限，尚不能較好地滿足大量不同種類農(nóng)藥檢測(cè)的需求。隨著篩選技術(shù)的發(fā)展和成熟，越來(lái)越多的農(nóng)藥分子都可以篩選出對(duì)應(yīng)的適配體，使適配體傳感器在實(shí)際大量檢測(cè)中應(yīng)用成為可能。

隨著納米材料合成技術(shù)的發(fā)展和提高，電化學(xué)生物傳感器在識(shí)別元件使用壽命有限、非特異性吸附明顯、在微型化和納米界面的高通量檢測(cè)中缺乏研究等方面的問題也將逐漸得到完善，從而在食品的農(nóng)藥殘留檢測(cè)中得以廣泛應(yīng)用。

2.2.2光學(xué)生物傳感器 光學(xué)生物傳感器是一類以酶、抗體、適配體等生物材料為感應(yīng)元件，通過(guò)光學(xué)信號(hào)的變化將生物識(shí)別事件顯示出來(lái)以檢測(cè)對(duì)象的生物傳感器。其具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、靈敏度高、響應(yīng)速度快、非破壞性測(cè)量和受干擾小等特點(diǎn)，已被廣泛用于食品農(nóng)殘的檢測(cè)［31-32］。

基于氮雜二苯乙烯（azastilbene）探針的熒光特性及其與啶蟲脒、吡蟲啉等農(nóng)藥之間形成絡(luò)合物而濃度依賴性地淬滅其熒光的現(xiàn)象，Narayanan等［33］建立了一種turn-off型氮雜二苯乙烯熒光傳感器檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘留的方法。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喹硫磷與氮雜二苯乙烯之間形成了最穩(wěn)定的農(nóng)藥熒光團(tuán)絡(luò)合物，其熒光淬滅效率最高（淬滅常數(shù)為2.5×103L·mol-1），可用于卷心菜樣品中喹硫磷農(nóng)藥殘留的準(zhǔn)確檢測(cè)。

基于適配體對(duì)靶標(biāo)識(shí)別的高特異性和強(qiáng)親和力，Lin等［34］以適配體為識(shí)別元件構(gòu)建了一種新型turn-on熒光傳感器，用于啶蟲脒的定量和成像檢測(cè)。將ZnS：Mn QDs與啶蟲脒適配體偶聯(lián)制備ZnS：Mn適配體熒光探針，與MWCNTs之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移后，該探針的熒光被MWCNTs淬滅。當(dāng)樣品中存在的啶蟲脒被探針中的適配體捕獲后，探針的熒光被恢復(fù)?；诒O(jiān)測(cè)和記錄的熒光恢復(fù)強(qiáng)度，可實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中啶蟲脒的定量檢測(cè)。研究結(jié)果表明，該傳感器具有較高的特異性和靈敏度，對(duì)啶蟲脒的線性檢測(cè)范圍為0～150 nmol·L-1，LOD低至0.7 nmol·L-1，在卷心菜葉樣品中的加標(biāo)回收率為90%～95%，且操作簡(jiǎn)單，為復(fù)雜食品基質(zhì)中啶蟲脒殘留的痕量檢測(cè)提供了參考方法。隨后，基于AuNPs對(duì)熒光碳點(diǎn)（carbon dots，CDs）的內(nèi)濾效應(yīng)（inner filter effect，IFE），Wang等［35］構(gòu)建了一種新型熒光適體傳感器檢測(cè)啶蟲脒。此傳感器以啶蟲脒的S-18適配體作為特異性識(shí)別元件，CDs作為信號(hào)探針，表面包裹S-18適配體序列的AuNPs處于分散狀態(tài)，與CDs之間通過(guò)發(fā)生IFE而淬滅其熒光。當(dāng)樣品中存在啶蟲脒時(shí)，其會(huì)被游離的S-18適配體捕獲，使AuNPs失去了適配體的保護(hù)而發(fā)生聚集，進(jìn)而CDs的熒光得到恢復(fù)?；谠摶謴?fù)的熒光強(qiáng)度可定量測(cè)定啶蟲脒，LOD低至1.08 μg·L-1，在番茄、黃瓜和卷心菜中的平均回收率為92.6%～102.6%，與LC-MS的測(cè)定結(jié)果相一致。

分子印跡技術(shù)是一種重要的分子識(shí)別技術(shù)，其通過(guò)制備的分子印跡聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）對(duì)靶標(biāo)分子具有高特異性的識(shí)別和吸附能力，體現(xiàn)了與抗體和適配體類似或更優(yōu)的性能?；诖耍琗ie等［36］結(jié)合熒光分析、表面分子印跡、離子液體和磁分離的優(yōu)點(diǎn)，以Fe3O4@SiO2為載體，熒光離子液體（ionic liquid，IL）為功能單體，開發(fā)了一種新型磁性分子印跡熒光傳感器（Fe3O4@SiO2@MIPIL）。該傳感器能夠?qū)料x啉（imidacloprid，IMD）特異性響應(yīng)，最低LOD為0.3 nmol·L-1，且具有靈敏度高、表面吸附容量大、水溶性和選擇性好、聚合物和靶標(biāo)分離富集快速、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，在蘋果、大米和卷心菜等食品樣品IMD痕量分析中具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

集光學(xué)、生物、化學(xué)和材料學(xué)等為一體的光學(xué)傳感器為深入推進(jìn)食品領(lǐng)域的痕量農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供了新平臺(tái)。但是，目前開發(fā)和應(yīng)用的熒光傳感材料的選擇性和熒光強(qiáng)度有限，在復(fù)雜基質(zhì)和特殊環(huán)境中可能受到某些酸類物質(zhì)的干擾。此外，已報(bào)道的熒光傳感器大多只能檢測(cè)單一農(nóng)藥殘留，同時(shí)檢測(cè)多種農(nóng)藥的熒光探針和傳感平臺(tái)較少。未來(lái)可合成更多不同類型的識(shí)別元件及熒光報(bào)告分子，進(jìn)而需要開發(fā)多模式的熒光傳感平臺(tái)，滿足食品中多種農(nóng)藥的高通量檢測(cè)技術(shù)體系。

2.2.3壓電生物傳感器 壓電生物傳感器又稱石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM），是一種高精度的質(zhì)量傳感儀器。其以壓電介質(zhì)激發(fā)聲波，介質(zhì)表面固定生物敏感膜，膜上固定生物識(shí)別分子，能與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合。通過(guò)聲波與環(huán)境的相互作用，傳感器將反應(yīng)過(guò)程中環(huán)境介質(zhì)的物理、化學(xué)變化轉(zhuǎn)換成相應(yīng)傳感檢測(cè)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的檢測(cè)。該傳感器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低、無(wú)需標(biāo)記、能同時(shí)感應(yīng)外界環(huán)境的機(jī)械變化和電特性變化等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)和疾病診斷等領(lǐng)域［37-38］。

Liu等［39］制備了一種高選擇性和高靈敏度的石英晶體微天平，該天平通過(guò)與聚氯乙烯和原位固定在壓電石英晶體（piezoelectric quartz crystal，PQC）芯片上的分子印跡聚合物微球（molecularly imprinted polymer microspheres， MIPMs）混 合 實(shí)現(xiàn)，作為農(nóng)藥硫丹的識(shí)別元件，最低檢測(cè)限（lowest detection limit，LDL）為5.59 ng·mL-1，在水和牛奶樣品中的加標(biāo)回收率分別為96.0%～104.1%和101.8%～108.0%。該MIPMs QCM制備和操作簡(jiǎn)單、選擇性好、價(jià)格低廉，且可重復(fù)使用，是硫丹農(nóng)藥殘留的可靠分析方法。Prasad和Jauhari［40］開發(fā)了一種基于雙模板印跡仿生樹枝狀納米纖維的壓電傳感器，用于同時(shí)分析實(shí)際樣品中有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕（dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）和六氯苯（hexachlorobenzene，HCB）的殘留水平（圖3A）。他們先通過(guò)Au-S鍵將2，5-噻吩二酰氯分子固定在金石英晶體表面，再共價(jià)連接到樹突分子單體上，加入靶標(biāo)分析物、交聯(lián)劑和引發(fā)劑后通過(guò)自組裝得到分子印跡樹狀大分子納米纖維。在優(yōu)化的條件下，該壓電生物傳感器對(duì)待測(cè)農(nóng)藥DDT和HCB的特異性較強(qiáng)，無(wú)交叉反應(yīng)LODs分別為0.75和0.69 ng·mL-1，在各自的濃度范圍5.0～150.0 ng·mL-1和5.0～75.0 ng·mL-1內(nèi)線性關(guān)系較好，為實(shí)際食品樣品中多農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)支撐。近期，基于抗體對(duì)靶標(biāo)農(nóng)藥的特異識(shí)別能力，F(xiàn)ernández-Benavides等［41］首次開發(fā)了一種新型鉍基（95BNT-2.5BKT-2.5BT）無(wú)鉛壓電陶瓷免疫傳感器（圖3B），能夠檢測(cè)到濃度低至0.03 μg·L-1的西維因農(nóng)藥，顯著低于高頻和低頻石英晶體商用諧振器；同時(shí)，可定量西維因的最低含量為0.11 μg·L-1，明顯低于任何商用石英生物傳感器，可用于食品中西維因農(nóng)藥痕量殘留的高選擇性、高靈敏快速檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化其他關(guān)鍵因素，如采用先進(jìn)的制造技術(shù)生產(chǎn)添加劑、更復(fù)雜的鈣鈦礦或優(yōu)化單相鈣鈦礦的結(jié)構(gòu)和微觀化學(xué)性質(zhì)等，可大大地拓展BNT-BKT-BT壓電免疫傳感器的傳感能力及在食品農(nóng)殘檢測(cè)的空間。此外，將壓電傳感器與其他技術(shù)（如電化學(xué)、光學(xué)等）結(jié)合，可以獲得更多的樣品檢測(cè)信息。

圖3 基于壓電傳感器檢測(cè)農(nóng)藥[40-41]Fig. 3 Pesticide detection based on piezoelectric sensor[40-41]

與ELISA等檢測(cè)技術(shù)相比，生物傳感器技術(shù)具有操作更簡(jiǎn)單便捷、靈敏度更高、樣品檢出限更低、分析樣品速度更快等優(yōu)點(diǎn)，未來(lái)需要開發(fā)制備特異性更好的識(shí)別元件和新型壓電介質(zhì)，以促進(jìn)其食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的變革與創(chuàng)新，提高其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。

3 展望

農(nóng)殘的分析方法多種多樣且各有優(yōu)勢(shì)，這為不同種類農(nóng)藥檢測(cè)提供了多樣化的選擇。隨著人們對(duì)食品安全的高度重視及對(duì)檢測(cè)技術(shù)便捷性、靈敏度、準(zhǔn)確性、快速高效的追求，生物技術(shù)如免疫分析和傳感器等憑借自身優(yōu)勢(shì)逐漸在食品的農(nóng)殘檢測(cè)中備受關(guān)注且得到廣泛應(yīng)用。雖然生物技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確性好、能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，但免疫分析技術(shù)和免疫傳感器法存在抗體制備難度大、對(duì)結(jié)構(gòu)類似化合物有一定的交叉反應(yīng)、只適用于單一靶標(biāo)農(nóng)藥測(cè)定等問題，開發(fā)新型特異性識(shí)別的生物識(shí)別分子（如適配體、分子印跡聚合物、納米抗體、改良的生物大分子等）有望解決這一問題。此外，穩(wěn)定性和重復(fù)性仍是部分生物傳感器亟待解決的問題，尤其是酶生物傳感器。微型化設(shè)計(jì)檢測(cè)系統(tǒng)，以開發(fā)出穩(wěn)定可重復(fù)使用的簡(jiǎn)單、便攜、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的生物傳感器系統(tǒng)，尤其是無(wú)線通信集成的光學(xué)、電化學(xué)生物傳感器在食品農(nóng)殘檢測(cè)中應(yīng)用的前景非?？捎^?；谛滦图{米材料和納米技術(shù)的光學(xué)、電化學(xué)生物傳感器正推動(dòng)著農(nóng)殘檢測(cè)設(shè)備向簡(jiǎn)單化、小型化、集成化和高通量發(fā)展。此外，后續(xù)研究亦可將光學(xué)、電化學(xué)、光譜學(xué)等技術(shù)相結(jié)合、互為補(bǔ)充，開發(fā)出新型生物傳感器，從而實(shí)現(xiàn)更快速、更靈敏、特異性更強(qiáng)的食品農(nóng)殘檢測(cè)。

為了促進(jìn)食品中農(nóng)殘檢測(cè)與生物技術(shù)之間的結(jié)合，還需開展大量的研究和創(chuàng)新工作，合成特異性更高的識(shí)別元件，制備更微型化的便攜設(shè)備，提升檢測(cè)質(zhì)量和效率，滿足現(xiàn)場(chǎng)快速、大批量食品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測(cè)需求，以更好地保障食品安全，避免農(nóng)藥殘留超標(biāo)的不安全食品流入市場(chǎng)，對(duì)保障人們的身體健康和促進(jìn)社會(huì)發(fā)展具有重要意義。