唐廣宣 ， 何莉薇 ， 陳泳妤 ， 張佳研 ， 戴雅琪 ， 呂輝雄 ， 劉麗輝，3

1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣州 510632；

2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642；

3.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州 510006

植物內(nèi)生菌是一種可以在健康的植物組織中定居，不會(huì)傷害到宿主，同時(shí)能夠和植物構(gòu)建和諧生態(tài)的微生物［1］。植物內(nèi)生菌包括內(nèi)生細(xì)菌（如固氮菌）和內(nèi)生真菌（如叢枝根真菌），其中內(nèi)生細(xì)菌具有來源廣泛、生殖繁衍快、適應(yīng)性強(qiáng)、種群多樣性和代謝產(chǎn)物豐富等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于植物定殖［2-3］。內(nèi)生菌通過多種方式侵染植物，定殖在植物組織內(nèi)部，包括根、莖、葉、花和種子，其中根部內(nèi)生菌的數(shù)量和多樣性最為豐富［4］。長期定殖作用下，內(nèi)生菌與宿主植株逐步形成穩(wěn)定的共生關(guān)系，且這種互利共棲關(guān)系的作用機(jī)制已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。

內(nèi)生菌侵染和定殖是一個(gè)時(shí)間和空間上的動(dòng)態(tài)過程，定殖過程因?qū)嶋H環(huán)境不同可選擇不同的定殖方式。這種環(huán)境引起的變化在時(shí)間上會(huì)產(chǎn)生定殖菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)過程，在空間上定殖菌會(huì)在宿主植物不同組織間遷移運(yùn)動(dòng)［5］。大多數(shù)情況下，內(nèi)生菌的定殖過程和機(jī)理是無法直接觀察的，這導(dǎo)致定殖動(dòng)態(tài)規(guī)律與機(jī)理的系統(tǒng)性總結(jié)和研究存在很大的困難。為進(jìn)一步克服內(nèi)生菌定殖動(dòng)態(tài)研究中的困難，更好地探究內(nèi)生菌的多樣性及其與宿主的互作機(jī)制，揭示多種定殖機(jī)理與過程，有助于該領(lǐng)域逐漸發(fā)展出多種高效簡便的定殖檢測(cè)技術(shù)。如：利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的綠色熒光標(biāo)記能夠?qū)崿F(xiàn)定殖結(jié)果可視化；通過誘導(dǎo)高抗菌株能夠?qū)崿F(xiàn)抗生素標(biāo)記目標(biāo)菌；實(shí)時(shí)熒光定量PCR與高通量測(cè)序技術(shù)能夠從分子水平檢測(cè)定殖結(jié)果，提高結(jié)果精準(zhǔn)度［6-8］。這些技術(shù)的發(fā)展對(duì)更好地探索定殖相關(guān)的途徑、機(jī)理和信號(hào)分子等具有重要意義。

內(nèi)生菌構(gòu)成了植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，占據(jù)特殊的生態(tài)位，對(duì)植物具有抵抗病蟲害、促進(jìn)生長、降解污染物的作用。隨著生態(tài)學(xué)的日益發(fā)展，內(nèi)生菌定殖開始從基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)向應(yīng)用研究，不斷推動(dòng)著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化、環(huán)境修復(fù)綠色化和生態(tài)恢復(fù)效益化的進(jìn)程。定殖方式及其新型檢測(cè)技術(shù)的研究發(fā)展能夠更好地追蹤定殖菌在宿主植物中的遷移變化，從而預(yù)測(cè)二者的交互作用。本文總結(jié)了植物內(nèi)生菌在定殖過程中的侵染方式、原理及其應(yīng)用，并對(duì)常用的定殖檢測(cè)方法進(jìn)行了整理分析，對(duì)各種檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)和實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行了歸納。在目前的研究發(fā)展水平下，定殖研究與新型分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)方式如高通量測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法相結(jié)合可以更好促進(jìn)內(nèi)生菌定殖研究的發(fā)展，有效探究互作過程中的信號(hào)，了解定殖過程與宿主特性，推動(dòng)定殖研究的應(yīng)用。

1 內(nèi)生菌的侵染和定殖

1.1 內(nèi)生菌侵染植物的途徑

菌株能夠通過某些方式進(jìn)入植物體內(nèi)，從而在植物體內(nèi)定居和繁殖。內(nèi)生菌主要以3種不同方式侵染宿主植物（表1）。①通過宿主葉表的氣孔、植株自然生長時(shí)的擦傷口、人工制造的切口等通道侵入宿主植株體內(nèi)。如果目標(biāo)菌株從根部侵入植株，一般選擇使用傷根法、灌根法或蘸根法等；如果目標(biāo)作用部位是莖干，一般選用打孔法以及針刺法；如果目標(biāo)作用部位是葉片，一般選用傷葉法和噴霧法［12］。②微生物會(huì)通過分泌酶對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行分解，穿透植物細(xì)胞成功進(jìn)入宿主體內(nèi)。例如內(nèi)生細(xì)菌伯克霍爾德菌（Burkholderia phytofirmans）能夠產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶、內(nèi)切葡聚糖酶和內(nèi)聚半乳糖醛酸酶等化合物，這些物質(zhì)參與局部細(xì)胞壁降解，穿過內(nèi)胚層的裂紋，移動(dòng)進(jìn)入木質(zhì)部，進(jìn)而幫助細(xì)菌侵入和定殖［5，13］。研究發(fā)現(xiàn)，微生物通常會(huì)在植物根表面形成生物膜，促進(jìn)細(xì)胞壁降解，從而使微生物更容易侵染和定殖到根部。③通過種子的垂直傳遞，在宿主結(jié)種時(shí)，內(nèi)生菌會(huì)遷移運(yùn)動(dòng)到種子組織附近，從成熟種子的裂縫或者種臍處進(jìn)入組織內(nèi)部［14］。之后伴隨著種子的萌發(fā)，內(nèi)生菌實(shí)現(xiàn)從親本傳遞到宿主后代的目的。由于侵染方式和侵染組織的不同，最終侵染定殖效果會(huì)產(chǎn)生差異［12，14］。有報(bào)道指出，內(nèi)生菌SafensisCS4定殖煙草實(shí)驗(yàn)中選用了浸根和葉面噴霧兩種侵染方式，結(jié)果顯示葉面噴霧處理的定殖率大于浸根處理，說明侵染方式影響定殖能力［15］。因此，探究侵染方式與侵染組織對(duì)定殖效果的影響，有助于揭示內(nèi)生菌的定殖機(jī)理，提高內(nèi)生菌定殖的成功率。

表1 內(nèi)生菌侵染植物的途徑Table 1 The way of endophytic bacteria infecting plants

1.2 內(nèi)生菌在植物體內(nèi)定殖

內(nèi)生菌定殖是指通過各種侵染方式使菌株穿過植物體表，進(jìn)入體內(nèi)最終在植物內(nèi)部長期生存并大量繁殖［16］。Galippe最先推測(cè)，細(xì)菌能進(jìn)入植物組織并且在植物組織內(nèi)定居［17］。隨著植物內(nèi)生菌的研究發(fā)展，發(fā)現(xiàn)自然情況下空氣中的微生物落到宿主莖葉上會(huì)發(fā)生定殖，土壤中的微生物通過自身的運(yùn)動(dòng)性、趨化性、群體感應(yīng)等特性到達(dá)根際發(fā)生定殖，根部是定殖發(fā)生的主場(chǎng)所［18-19］。土壤定殖菌受到宿主根際分泌物的吸引，附著在根際形成生物膜，降解宿主植物細(xì)胞壁，侵染進(jìn)入宿主體內(nèi)，以蒸騰作用為動(dòng)力，通過導(dǎo)管在植物內(nèi)遷移，找到適合生長的植物組織生長繁殖［20］。例如YL6-GFP在小白菜的定殖研究中，因?yàn)槭艿酵寥莱煞值奈瑯?biāo)記菌株首先從宿主根部入侵，隨后由葉柄、葉脈部分向葉肉遷移，最終在宿主各組織內(nèi)維持一定的定殖密度，說明定殖部位不只是入侵部位［21］。研究發(fā)現(xiàn)目標(biāo)菌株除了定殖部位會(huì)發(fā)生改變，定殖量也會(huì)發(fā)生一定的變化。例如，在變棲克雷伯菌SH-1（Klebsiella variicolaSH-1）定殖石斛（Dendrobium officinale）的動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)定殖量隨時(shí)間表現(xiàn)為先增后減，定殖效果隨時(shí)間有所下降［22］，這說明應(yīng)用內(nèi)生菌定殖時(shí)，要充分考慮到定殖是兼具時(shí)間和空間的動(dòng)態(tài)變化的過程。

內(nèi)生菌在宿主體內(nèi)侵染定殖后，目標(biāo)菌與宿主內(nèi)其他微生物種群共同構(gòu)成宿主微生態(tài)系統(tǒng)。它們占據(jù)不同的生態(tài)位并分泌次生代謝產(chǎn)物，一方面與其他微生物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，引起微生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)部發(fā)生演替，另一方面結(jié)合信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起宿主產(chǎn)生生理反應(yīng)，進(jìn)而影響宿主的營養(yǎng)、發(fā)育與抗逆性等［23］。近年來，關(guān)于內(nèi)生菌定殖植物產(chǎn)生互作關(guān)系的研究越來越多。許多研究認(rèn)為定殖菌作為潛在病原菌釋放毒力因子，但是與傳統(tǒng)病原菌不同的是內(nèi)生菌引起的宿主免疫反應(yīng)不會(huì)將其徹底消滅，甚至二者互利互惠［24］。這種動(dòng)態(tài)的維持機(jī)制十分復(fù)雜精密，追蹤定殖菌侵染后在宿主內(nèi)的活動(dòng)過程、產(chǎn)生的活性物質(zhì)、特殊基因的表達(dá)等都需要借助檢測(cè)手段。傳統(tǒng)形態(tài)定殖檢測(cè)技術(shù)是利用重分離方法，直接將宿主植物的根、莖、葉和種子等進(jìn)行研磨，然后涂布培養(yǎng)，篩選目標(biāo)菌。這種方法無法精準(zhǔn)獲得目標(biāo)菌定殖于宿主組織和細(xì)胞層面的具體情況，多種結(jié)合分子生物學(xué)的新型檢測(cè)技術(shù)彌補(bǔ)了這種不足，拓寬了定殖研究的精確度與深度。

2 植物內(nèi)生菌定殖的檢測(cè)方法

利用定殖檢測(cè)技術(shù)追蹤內(nèi)生菌定殖生長的情況，能夠?yàn)檠芯績?nèi)生菌促生、抗性、降解有機(jī)污染物等有益宿主生長等方面做出貢獻(xiàn)。目前常用的新型檢測(cè)方法包括抗生素檢測(cè)法、熒光標(biāo)記法、實(shí)時(shí)熒光定量法、高通量測(cè)序法和特異性寡合核苷酸片段標(biāo)記法。

2.1 綠色熒光蛋白標(biāo)記法

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記方法是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將GFP基因?qū)肽繕?biāo)菌，在菌內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白，使得菌體呈現(xiàn)綠色，在紫外光和藍(lán)光照射條件下發(fā)出綠色熒光，達(dá)到標(biāo)記菌株的目的［25］。該方法可以對(duì)目的菌株進(jìn)行長期穩(wěn)定的標(biāo)記并直接觀察，便于長期追蹤內(nèi)生菌在植物內(nèi)的定殖情況。

GFP存在廣譜表達(dá)性，能夠?qū)攵喾N內(nèi)生菌，包括克雷伯氏菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬、土壤桿菌屬和芽孢桿菌屬等［26］。因此，GFP可以作為一種監(jiān)測(cè)目標(biāo)菌株在宿主植物中定殖情況的報(bào)告基因，了解標(biāo)記菌在宿主體內(nèi)是否成功定殖，以及對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行實(shí)時(shí)定位觀察。例如，通過GFP標(biāo)記內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌YN201490（Bacillus subtilisYN201490），利用熒光拍照技術(shù)證明菌株YN201490能在黃瓜中穩(wěn)定定殖，同時(shí)獲得該菌在黃瓜中的定殖量維持在103～104CFU·g-1鮮重［27］。

與GFP標(biāo)記法同時(shí)發(fā)展的是其觀測(cè)技術(shù)，GFP標(biāo)記的內(nèi)生菌侵入宿主植物后，需要借助檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行觀測(cè)［6］。重分離是最簡便的一種方法，取宿主植物的組織進(jìn)行研磨，培養(yǎng)組織內(nèi)的微生物，隨后在黑暗環(huán)境下使用長波紫外燈或者藍(lán)光對(duì)菌群進(jìn)行照射，觀察是否有發(fā)熒光的菌株［28］。為獲取更加精準(zhǔn)的定殖情況，可以利用顯微鏡輔助觀察，實(shí)現(xiàn)定殖結(jié)果可視化。選擇有適當(dāng)濾光片的熒光顯微鏡，將被測(cè)組織或細(xì)胞送鏡檢測(cè)，直接觀察菌株定殖情況并拍照計(jì)數(shù)［29］。另外，已有研究采用雙光子激光共聚焦掃描鏡對(duì)標(biāo)記菌在宿主中的位置進(jìn)行長期追蹤以及準(zhǔn)確定位分析［30］。雙光子激光共聚焦掃描鏡能有效地克服普通顯微鏡的光漂泊現(xiàn)象，使觀察結(jié)果更加準(zhǔn)確、效果更佳，對(duì)內(nèi)生菌定殖機(jī)制的研究幫助更大。

目前GFP標(biāo)記菌株的主要研究領(lǐng)域是基因?qū)敕绞胶投ㄖ硻z測(cè)方式。此外，定殖中的調(diào)節(jié)機(jī)制、目標(biāo)菌株定殖后的發(fā)光機(jī)理和新型突變體熒光蛋白的改良應(yīng)用等方面仍需深入研究。未來，熒光蛋白在內(nèi)生菌定殖研究中仍會(huì)起到重要作用。

2.2 抗生素標(biāo)記法

抗生素標(biāo)記法依靠菌株的自生抗性或者人工誘化，篩選高抗抗生素的菌株變體，并以此為手段進(jìn)行菌株的定殖檢測(cè)［7］。這種標(biāo)記方法具有易分析、低消耗、快速、適用廣的優(yōu)點(diǎn)，卡那霉素、利福平、氨芐青霉素、鏈霉素、腐霉利、四環(huán)素和青霉素等抗生素在標(biāo)記中都會(huì)經(jīng)常被用到［31］。由于利福平標(biāo)記法的生防性狀不易喪失，因此被作為一種最常用的抗生素標(biāo)記方法［32］。應(yīng)用抗生素標(biāo)記法進(jìn)行內(nèi)生菌定殖檢測(cè)時(shí)，首先采用濃度梯度法篩選得到突變抗性菌株，再通過多代培養(yǎng)，驗(yàn)證突變體子代菌株能否穩(wěn)定保持抗性，以確保遺傳穩(wěn)定性及其他重要特性沒有發(fā)生改變和喪失。例如，目標(biāo)菌株羽毛針禾（Stipagrostis pennata）根部內(nèi)生假單胞菌XG11（PseudomonasXG11）通過抗生素梯度誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選出四環(huán)素作為抗藥性突變體的XG11菌。將四環(huán)素抗性XG11定殖小麥，定時(shí)采樣，研磨法處理小麥不同組織，研磨勻漿涂布于含有300 μg·mL-1四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，完成對(duì)XG11定殖結(jié)果及定殖量的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)內(nèi)生菌定殖的定量定性分析［33］。

目前抗生素標(biāo)記法的研究已從單抗生素標(biāo)記發(fā)展到了多種抗生素同時(shí)標(biāo)記，例如：有研究通過多抗生素誘導(dǎo)法得到解淀粉芽孢桿菌N24菌（Bacillus amyloliquefaciensN24），該菌株具有鏈霉素和利福平兩種藥物的抗性，能夠同時(shí)有效地解決葡萄白粉病和葡萄霜霉病［34］。這種多抗性標(biāo)記的方法不但能夠?yàn)槎ㄖ逞芯刻峁┮环N檢測(cè)手段，還為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物的抗病性研究提供了一個(gè)新方向。近年來，多抗標(biāo)記法在生物防治植物病害中起到了極大的作用，相關(guān)應(yīng)用的文章發(fā)表數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，該方法有望成為內(nèi)生菌促進(jìn)植物抗性發(fā)展的研究熱點(diǎn)。此外，抗生素標(biāo)記方法作為一種常用的定殖檢測(cè)手段，對(duì)內(nèi)生菌在宿主內(nèi)存活狀況的檢測(cè)具有良好效果。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）通常是針對(duì)目標(biāo)菌株特定基因序列定量檢測(cè)，以反映內(nèi)生菌定殖數(shù)量［35］。針對(duì)定殖菌設(shè)計(jì)特異性基因片段，片段在體系中循環(huán)擴(kuò)增，產(chǎn)物以熒光的形式顯示，qPCR中的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)熒光信號(hào)全過程采集，當(dāng)光到達(dá)一定強(qiáng)度，獲得閾值時(shí)片段拷貝數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算定殖菌個(gè)數(shù)［6，12］。針對(duì)目標(biāo)菌的基因組設(shè)計(jì)高特異性熒光探針用于定殖菌的qPCR診斷鑒定，能夠量化組織內(nèi)定殖菌的數(shù)量。近年來，使用較為廣泛的探針包括Taq Man探針和SYBR染料，它們的優(yōu)勢(shì)在于特異性強(qiáng)、反應(yīng)快速、自動(dòng)化程度非常高［36］。Taq Man探針法通過密閉操作，有效減少了假陽性和污染現(xiàn)象，增加了操作的自動(dòng)化程度。而SYBR染色法能夠保證熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物同步增加，因此可繪制兩者相關(guān)的數(shù)量曲線圖，用于計(jì)算目的基因的數(shù)量［37］。

除此之外，qPCR技術(shù)可以很好地分析目標(biāo)菌株定殖過程中發(fā)揮特殊作用的基因，極大地降低了探究定殖機(jī)理的難度。例如，有研究將內(nèi)生菌吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007（Burkholderia pyrrociniaJK-SH007）接種楊樹后，除了利用qPCR技術(shù)檢測(cè)菌株的定殖情況外，還分析了多聚半乳糖醛酸酶基因BpPG在定殖中發(fā)揮的作用，有助于該菌定殖機(jī)理的揭示［38］。目前qPCR技術(shù)在內(nèi)生菌定殖檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，促進(jìn)了內(nèi)生菌定殖研究發(fā)展，為實(shí)際生產(chǎn)帶來效益。

2.4 高通量測(cè)序法

高通量測(cè)序法包括16S基因測(cè)序和宏基因測(cè)序。高通量測(cè)序法通過對(duì)宿主植物組織進(jìn)行測(cè)序，定性定量分析獲得樣本菌群結(jié)構(gòu)，即菌種的組成和豐度，分析菌種的組成可知目的菌定殖是否成功，分析豐度則可知菌株的定殖量［39］。16S rRNA基因測(cè)序與宏基因測(cè)序深入探究宿主微生物群落物種豐度的變化，若宿主內(nèi)目標(biāo)菌種所在屬的豐度增加，可初步判定定殖成功［40］。宏基因測(cè)序獲得宿主組織全基因，通過與目標(biāo)菌株的基因序列比對(duì)，可進(jìn)一步明確內(nèi)生菌定殖情況。Kong等［41］將戈登氏菌QH-11（GordoniaQH-11）定殖油菜（Brassica napusL.），通過高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種后油菜根部及根際土壤戈登屬的豐度從無到有顯著提高，第30天時(shí)戈登屬依舊存在，證明QH-11能夠長期穩(wěn)定定殖于油菜。龐杰等［42］從鎘污染水稻中分離獲得具有耐鎘能力的紅蒼白草螺菌R-13（Herbaspirillum rubrisubalbicansR-13），將R-13定殖于龍葵宿主植株中，定期采樣后利用高通量測(cè)序分析宿主組織內(nèi)生菌群的組成與豐度，結(jié)果顯示龍葵組織中穩(wěn)定包含R-13基因序列，證明R-13成功定殖。

此外，有研究以山羽蘚（Abietinella abietina）為材料，通過高通量測(cè)序技術(shù)得到了山羽蘚微生物的群落結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)共生菌包含226個(gè)屬，慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium jordan）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonassp.）為優(yōu)勢(shì)屬，因此研究人員可預(yù)測(cè)定殖結(jié)果［43］。選擇合適的目標(biāo)菌株種屬及侵染方式進(jìn)行定殖，一定程度上能夠加大目標(biāo)菌株的生態(tài)位，提高定殖成功的概率。利用該方法定期對(duì)植物的不同組織進(jìn)行測(cè)序，可探測(cè)目標(biāo)菌的活動(dòng)軌跡。例如對(duì)果桑測(cè)序發(fā)現(xiàn)感病果桑的根部內(nèi)生菌可通過莖桿移動(dòng)，定殖到感病的果實(shí)中，此檢測(cè)為生物防治的發(fā)展提供了理論依據(jù)［44］。

目前對(duì)于高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用比較廣泛，宏基因測(cè)序在定殖菌的基因和功能層面展開研究，從遺傳水平上對(duì)菌株進(jìn)行解讀，有助于探索內(nèi)生菌在宿主植物體內(nèi)的功能基因、代謝路徑和定殖機(jī)制［39］。比如孟憲法等［45］利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌歐文氏菌（Erwinia）的種間信號(hào)分子AHLs（Acyl-homoserine Lactones）可以借助群體感應(yīng)碳水化合物在宿主內(nèi)的消化分解等代謝過程，進(jìn)而進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)控。因此，可利用高通量測(cè)序展開定殖菌與宿主間信號(hào)交流的研究，為定殖機(jī)制和定殖代謝途徑的探索做出貢獻(xiàn)。

高通量測(cè)序技術(shù)的興起為內(nèi)生菌定殖研究提供了更廣闊的應(yīng)用平臺(tái)，并且16S rRNA基因測(cè)序與宏基因測(cè)序結(jié)合，能夠更精準(zhǔn)地獲得定殖菌功能基因、定殖動(dòng)態(tài)和微生態(tài)群落多樣性。但是該方法還存在一定的局限性，比如檢測(cè)成本高、后續(xù)分析數(shù)據(jù)量大等［45］。高通量測(cè)序技術(shù)有望通過不斷改進(jìn)推動(dòng)生物菌劑的商業(yè)化發(fā)展，在未來發(fā)揮更大的作用。

2.5 特異性寡核苷酸片段標(biāo)記法

特異性寡核苷酸片段標(biāo)記法是以特異的RNA或者DNA序列為探針，通過與宿主或者菌落的DNA進(jìn)行雜交，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)生菌定殖結(jié)果的檢測(cè)，該方法具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，有效地提升了實(shí)驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確率［46］。結(jié)合rRNA含量的不同，依據(jù)探針亮度強(qiáng)弱能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)菌活性的有效評(píng)估。劉佳等［47］根據(jù)內(nèi)生菌XG32中16S RNA的特異性，設(shè)計(jì)了寡核苷酸探針，結(jié)合特異性驗(yàn)證和雜交條件優(yōu)化，成功檢測(cè)了XG32菌在番茄根際的定殖和分布情況。

寡核苷酸探針標(biāo)記熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)使檢測(cè)更為準(zhǔn)確，當(dāng)目標(biāo)菌株的RNA或者DNA與核酸探針雜交以后，借助激光掃描儀或者熒光顯微鏡就能夠?qū)晒庑盘?hào)進(jìn)行觀察［48］。該技術(shù)可以監(jiān)測(cè)菌株定殖信號(hào)，例如以葡萄微繁殖產(chǎn)生的苗為材料，采用DOPE-FISH方法，對(duì)葡萄微繁殖植株進(jìn)行根際定殖試驗(yàn)，結(jié)合共聚焦顯微鏡，探索定殖過程中路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigiiEnv6）與宿主間產(chǎn)生的代謝信號(hào)［49］。此外，還有利用寡核苷酸芯片法進(jìn)行標(biāo)記，該法主要分為表達(dá)譜芯片和檢測(cè)芯片兩種。芯片標(biāo)記技術(shù)可用于基因?qū)嵶儥z測(cè)、多態(tài)性分析、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)等，廣泛應(yīng)用于內(nèi)生菌在轉(zhuǎn)基因作物方面的定殖研究［50］。

2.6 其他檢測(cè)方法

除以上檢測(cè)方法外，再分離法、外源編碼酶標(biāo)記法、同位素示蹤法、組織染色法、放射性標(biāo)記和示蹤分析相結(jié)合等方法在一定程度上可以用于定殖檢測(cè)［51-52］。其中，外源編碼酶標(biāo)記法是借助β-葡糖醛酸糖酶基因（gusA）、熒光素酶基因（LuxAB）和β-半乳糖苷酶基因（LacZ）等編碼酶基因進(jìn)行檢測(cè)［46，51］。

由于各種檢測(cè)方法都有自身的優(yōu)勢(shì)和不足，因此在實(shí)踐中需要根據(jù)目的和條件進(jìn)行綜合考量，選擇合適的檢測(cè)方法，也可以結(jié)合多種檢測(cè)方法相互驗(yàn)證，從而使定殖檢測(cè)更加可靠和精準(zhǔn)。常用新型檢測(cè)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)匯總于表2。

表2 常用的內(nèi)生菌定殖檢測(cè)方法匯總Table 2 The commonly used detection methods for colonization of endophyte

3 內(nèi)生菌的應(yīng)用

多樣性的內(nèi)生菌在生物防治、促進(jìn)宿主植物生長、降解有機(jī)污染物等多方面均有一定程度的促進(jìn)作用。開發(fā)內(nèi)生菌作為菌劑替代化肥和農(nóng)藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，能高效發(fā)揮相關(guān)作用。利用內(nèi)生菌修復(fù)環(huán)境問題，徹底礦化污染物，治理污染土壤與水體。內(nèi)生菌應(yīng)用產(chǎn)生多種有益效果，同時(shí)符合綠色和諧發(fā)展的時(shí)代理念，相信該領(lǐng)域的應(yīng)用會(huì)得到更多重視。

3.1 生物防治

植物病害的生物防治是植物保護(hù)的一種自然方式，可減少化學(xué)物質(zhì)的投入，相比其他生防技術(shù)的優(yōu)勢(shì)非常明顯，近年來得到廣泛應(yīng)用。在生物防治中，內(nèi)生菌具有受保護(hù)的生態(tài)位優(yōu)勢(shì)，與棲息在植物周圍的微生物相比更具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槟苤苯咏佑|宿主細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物，能夠快速做出反應(yīng)，發(fā)揮有益效應(yīng)［56］。內(nèi)生菌主要借助重寄生作用、溶菌作用、營養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等方面實(shí)現(xiàn)病蟲害的防治［57］。研究發(fā)現(xiàn)，一些內(nèi)生菌定殖后能夠產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶、細(xì)菌素和抗生素等抑菌物質(zhì)，甚至部分內(nèi)生菌可同時(shí)分泌多種抗菌物質(zhì)以達(dá)到加強(qiáng)抗菌的效果［58］。還有一些研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌定殖后分泌的一種抗菌物質(zhì)能夠?qū)Χ喾N病害實(shí)現(xiàn)有效防治，其中具有較強(qiáng)抗菌活性的內(nèi)生菌PCE45產(chǎn)生的PCP-1抗菌肽能有效抑制多種病原菌，該物質(zhì)對(duì)稻瘟病菌（Pyricularia oryzaeCav）和 玉 米 彎 孢 菌（Curvularia lunata（Walk） Boed）的抑菌率可達(dá)到93.5%和95.5%［59］。此外，內(nèi)生菌定殖后可以通過與病原菌爭(zhēng)奪營養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位起到一定程度的防治作用［24］。比如，內(nèi)生菌定殖后快速占領(lǐng)植物內(nèi)易侵染的點(diǎn)位，隨后在這些點(diǎn)位和病原菌進(jìn)行營養(yǎng)、水分和氧氣方面的競(jìng)爭(zhēng)，減弱病原菌活性，達(dá)到防治病原菌的效果［60］。另外，內(nèi)生菌中會(huì)出現(xiàn)一類鐵載體，該載體可有效爭(zhēng)奪附近的鐵離子，使病原菌無法獲得鐵元素而出現(xiàn)生長抑制［61］?？偠灾瑑?nèi)生菌進(jìn)行定殖后借助以上方式能夠發(fā)揮良好的生防作用，目前該方式已經(jīng)在實(shí)際生產(chǎn)操作中得到逐步應(yīng)用。

3.2 促進(jìn)植物生長

一些內(nèi)生菌定殖到植物體內(nèi)后，可以促進(jìn)宿主植物生長，提高宿主生物量、株高等生長指標(biāo)，增加氮含量和葉綠素含量等，還可以改善營養(yǎng)形態(tài)和促進(jìn)吸收，對(duì)宿主生長過程進(jìn)行加速［56］。目前研究重點(diǎn)是內(nèi)生菌發(fā)揮促生作用的機(jī)制，主要包括直接促生和間接促生兩種方式。直接促生是內(nèi)生菌定殖后產(chǎn)生乙烯、刺激性植物激素以及分泌有機(jī)酸等物質(zhì)，從而改進(jìn)植物營養(yǎng)狀況［62］。例如，對(duì)歐洲油菜（Brassica napus）接種產(chǎn)生長素的促生菌，發(fā)現(xiàn)宿主根部增粗且分枝越來越多［63］。間接促生是宿主接種內(nèi)生菌之后能夠?qū)崿F(xiàn)有效的生物防治、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性或促進(jìn)根瘤和菌根的形成，增強(qiáng)共生作用［2］。其中，固氮菌屬定殖后具有分泌抗生素、鐵載體、調(diào)節(jié)物質(zhì)以及固氮等功能，通過這些物質(zhì)進(jìn)行生物防治，能幫助宿主減少在病蟲害方面損失的能量，促進(jìn)宿主更好地生長發(fā)育［64］。目前內(nèi)生菌定殖在促進(jìn)植物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用、提高作物產(chǎn)量、拮抗病原菌等功能上已得到研究者們的廣泛重視。未來該方法很可能逐步代替化肥、農(nóng)藥和人工生長調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

3.3 降解有機(jī)污染物

有機(jī)污染物在環(huán)境中具有持久性、積累性、生物放大性等特點(diǎn)，隨著食物鏈和食物網(wǎng)進(jìn)行傳遞，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成威脅［65］。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌定殖植物對(duì)有機(jī)污染有良好的降解效果。內(nèi)生菌定殖植物后通過產(chǎn)生降解酶代謝有機(jī)污染物，降低污染物毒性，雖然植物自身能夠降解一些有機(jī)污染物，使之變成一些小分子物質(zhì)，但微生物降解是去除有機(jī)物污染物的主要途徑［66］。內(nèi)生菌降解有機(jī)污染物可以完全礦化為CO2與H2O，且內(nèi)生菌本身對(duì)植物無害，因此利用內(nèi)生菌降解有機(jī)污染物受到了廣泛關(guān)注。

降解內(nèi)生菌通過定殖幫助宿主提高對(duì)污染物的耐受程度，促進(jìn)根系對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而定殖菌利用宿主組織存活并實(shí)現(xiàn)氧的轉(zhuǎn)移，同時(shí)產(chǎn)生特定降解酶，降解宿主無法轉(zhuǎn)化的有機(jī)污染物［67］。例如，內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌定殖水稻實(shí)驗(yàn)中，宿主為定殖菌提供生存所需的物質(zhì)，定殖菌分泌鄰苯二甲酸酯（phthalic acid ester，PAEs）降解酶，緩解PAEs對(duì)植物的生長脅迫，同時(shí)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物又作為碳源和能源供定殖菌生長［68］。有研究發(fā)現(xiàn)這種方式不僅能有效降低環(huán)境中污染物的含量，同時(shí)還能減少植物累積的污染物，實(shí)現(xiàn)植物內(nèi)環(huán)境與外環(huán)境的雙重修復(fù)。例如多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）具有非常強(qiáng)的毒性且在土壤中狀態(tài)穩(wěn)定，功能內(nèi)生菌定殖小麥能夠顯著促進(jìn)小麥體內(nèi)芘和土壤中PAHs的降解［69］。綜上，對(duì)有機(jī)物進(jìn)行內(nèi)生菌定殖降解，能夠修復(fù)土壤并幫助宿主更好的生長發(fā)育，實(shí)現(xiàn)在宿主內(nèi)“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”的策略。

3.4 其他應(yīng)用

除了以上作用，內(nèi)生菌定殖還有其他醫(yī)藥學(xué)、分子生物學(xué)、植物保護(hù)學(xué)等多方面價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，藥用植物的內(nèi)生菌可分泌產(chǎn)生抗腫瘤、抑菌、藥用活性物質(zhì)等功能成分［70］。如果將這些內(nèi)生菌定殖到其他藥用植物中，對(duì)新藥研發(fā)、藥用植物栽培等方面會(huì)產(chǎn)生巨大的促進(jìn)作用。在基因工程方面，內(nèi)生菌定殖期間可以發(fā)揮外源載體的作用。例如，用棉花的內(nèi)生菌作為載體，對(duì)蘇云金芽胞桿菌基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米莖蛀蟲和棉花蚜蟲防治工程菌的構(gòu)建，然后再向不同的作物中定殖該工程菌實(shí)現(xiàn)生物防治［71］。此外，目前分離出具有強(qiáng)化植物修復(fù)潛力的內(nèi)生菌遍布多個(gè)菌屬，使用內(nèi)生菌定殖還能降低土壤中的重金屬含量。Li等［72］將蘇丹草的內(nèi)生菌根定殖到蘇丹高粱后，增加了宿主植物49%～95%的銅吸收量，且83%～86%的銅富集在植物根部，能夠顯著降低土壤的銅含量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)根際土壤中銅的更大利用。

21世紀(jì)以來，隨著生物檢測(cè)技術(shù)和微生物學(xué)的高速發(fā)展，內(nèi)生菌定殖檢測(cè)方法更加精確化和多樣化，內(nèi)生菌定殖應(yīng)用也更加廣泛。但是在實(shí)際生產(chǎn)中依舊需要注意許多問題，例如作物的微生態(tài)環(huán)境是否適合目標(biāo)菌株生存、目標(biāo)菌株特定功能的穩(wěn)定性以及宿主的栽培條件方式是否影響定殖等。同時(shí)還需深入研究目標(biāo)菌株與植物的有益互作以及是否會(huì)在正常條件或惡劣環(huán)境下產(chǎn)生有害互作。

4 展望

近年來，有關(guān)內(nèi)生菌研究的文獻(xiàn)眾多，涵蓋生物學(xué)、生物多樣性、植物功能、植物生理、潛在價(jià)值優(yōu)化等諸多方面，但是少有研究提供內(nèi)生菌定殖的微觀機(jī)理、動(dòng)態(tài)過程、宿主反應(yīng)、信號(hào)分子等內(nèi)容。內(nèi)生菌確實(shí)影響宿主的生長、拮抗病原菌以及產(chǎn)生對(duì)人類有價(jià)值的次生代謝物，但是分離獲得的大部分內(nèi)生菌由于在實(shí)際環(huán)境中營養(yǎng)條件不足和生長緩慢等原因無法穩(wěn)定存活與繁殖。此外，內(nèi)生菌在定殖過程易受栽培條件與定殖方式影響，這使得定殖菌與宿主植物之間互作機(jī)理研究更加困難。因此，結(jié)合包括高通量測(cè)序、轉(zhuǎn)基因標(biāo)記、特異性寡核苷酸標(biāo)記、qPCR等多種新型檢測(cè)技術(shù)，能夠有效探究二者互作過程中的宿主反應(yīng)，掌握內(nèi)生菌的定殖過程，捕捉定殖效益功能基因。

未來關(guān)于定殖研究工作可以從以下4個(gè)方面展開：①篩選有益內(nèi)生菌，選擇匹配的宿主與侵染方式，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用；②利用分子技術(shù)，研究調(diào)控定殖過程的行為基因、代謝方式與互作機(jī)制；③結(jié)合生理學(xué)與分子生物學(xué)，預(yù)測(cè)定殖菌與宿主的交互作用，優(yōu)化田間定殖，推動(dòng)菌劑商業(yè)化發(fā)展；④開發(fā)多種內(nèi)生菌組合，應(yīng)用組合定殖宿主，探究宿主內(nèi)各菌種如何發(fā)揮效應(yīng)、如何遷移分布、如何聯(lián)合代謝，構(gòu)建宿主內(nèi)新型微生物群落。這些問題的解決能夠加速內(nèi)生菌定殖在實(shí)際生產(chǎn)上的應(yīng)用，將定殖內(nèi)生菌發(fā)展為一種具有特定功能的生物接種劑，在防治病蟲害、促進(jìn)生產(chǎn)、保護(hù)環(huán)境等方面做出貢獻(xiàn)，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展和成功轉(zhuǎn)型。相信隨著內(nèi)生菌定殖研究的逐漸發(fā)展，內(nèi)生菌定殖相關(guān)的應(yīng)用將遠(yuǎn)不止生物防治、促生、污染修復(fù)等方面，內(nèi)生菌定殖有望作為一種綠色的方法在實(shí)踐中得到更多推廣。