王皓梵，李穎穎，王媛媛，田慶豐，封全靈

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院社會(huì)醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理學(xué)教研室 鄭州 450001

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤[1]，目前化療被認(rèn)為是晚期或復(fù)發(fā)性宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但較大的毒副作用限制了其臨床應(yīng)用[2-3]。血管生成在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用[4]。呋喹替尼(fruquintinib,FRU)是我國(guó)自主研發(fā)的小分子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)抑制劑[5]，能夠高選擇性、強(qiáng)效抑制VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3[6]。但FRU具有疏水性，在血液循環(huán)過程中對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性較差、循環(huán)性低，而且現(xiàn)階段劑型單一，這些在一定程度上限制了FRU在臨床上的應(yīng)用[4,7]。聚合物類膠束目前已被認(rèn)為是最具潛力的納米藥物遞送體系之一[8]。該膠束以納米材料為載體，將藥物選擇性輸送至病變部位，在特定外部條件[9]或靶標(biāo)刺激下實(shí)現(xiàn)藥物釋放[10-13]。研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境的酸度(pH 5.8～6.5)遠(yuǎn)高于血液(pH 7.4)，因此pH響應(yīng)型載藥膠束作為一種新型抗腫瘤藥物載體，有著很大的開發(fā)潛能。此外，納米藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)應(yīng)在確保療效的同時(shí)減少對(duì)正常細(xì)胞的損害[16-18]，其中靶向整合素受體是最常用的方法之一[19]。目前，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(RGD)及其衍生物已被廣泛用作整合素的配體。RGD的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(cRGD)比線性結(jié)構(gòu)具有更好的選擇性和穩(wěn)定性[14]。本研究擬設(shè)計(jì)一種負(fù)載FRU的酸敏感靶向膠束(cRGD-FRU-acid sensitive targeted micelle，cRGD-FRU-ASM)，以達(dá)到優(yōu)異的抗腫瘤效果，同時(shí)減小毒副作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備FRU購自武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，磷脂-聚(2-乙基-2-噁唑啉)(DSPE-PEOz)、磷脂-聚乙二醇2000-環(huán)肽(DSPE-PEG2K-cRGD)購自西安瑞禧生物科技有限公司，甲醇、氯仿(色譜純)購自天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，十二烷基硫酸鈉購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，異硫氰酸熒光素(FITC)購自美國(guó)Sigma公司，VEGFR-2抗體購自美國(guó)Immuno Way公司。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC、宮頸癌細(xì)胞系Hela購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 cRGD-FRU-ASM的制備cRGD-FRU-ASM的制備原理和腫瘤微環(huán)境響應(yīng)示意圖見圖1。

圖1 cRGD-FRU-ASM的制備

以cRGD為靶頭，DSPE-PEOz、DSPE-PEG2K-cRGD為藥物載體，F(xiàn)RU為模型藥物，通過薄膜分散法制備cRGD-FRU-ASM。精密稱取一定比例上述材料[m(DSPE-PEOz)∶m(DSPE-PEG2K-cRGD)∶m(FRU)=9∶1∶1]于25 mL茄形瓶中，緩慢滴加3 mL氯仿，超聲至完全溶解，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 ℃低壓旋轉(zhuǎn)形成均勻薄膜后，增加旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀壓力，徹底除去氯仿。加入PBS(pH 7.4)，繼續(xù)置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水化，使薄膜完全脫落。取下茄形瓶，將所制備載體置于5 mL EP管中，冰浴下探超(探超功率150 W，探超3 s，停5 s)后，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩Ｍ喜襟E分別制備空白載體(cRGD-ASM)、無響應(yīng)型膠束(cRGD-FRU-M)、無靶頭膠束(FRU-ASM)。使用FITC代替沒有熒光的FRU，同上制備FITC-ASM和cRGD-FITC-ASM膠束。

1.3 cRGD-FRU-ASM表征測(cè)定制備成功的膠束冰浴下探超分散后吸取100 μL于EP管中，加入2 mL超純水稀釋，使用激光粒度分析儀測(cè)定粒徑、分散指數(shù)以及電位，平行測(cè)定3次。

另取制備成功的膠束，冰浴下探超分散后吸取適量滴于準(zhǔn)備好的銅網(wǎng)，重復(fù)進(jìn)行2～3次，用體積分?jǐn)?shù)0.2%磷鎢酸染色，室溫下放置，晾干后采用透射電鏡觀察形態(tài)，拍照。將制備好的樣品甲醇破乳后，使用高效液相色譜(HPLC)儀測(cè)定藥物含量。包封率= 膠束載藥質(zhì)量/藥物總質(zhì)量×100%，載藥量= 膠束載藥質(zhì)量/(膠束載藥質(zhì)量+ 空白載體質(zhì)量)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 cRGD-FRU-ASM臨界濃度的測(cè)定根據(jù)濃度梯度法將膠束制成系列濃度(0.09、0.18、0.37、0.73、1.46、2.93、5.86、11.72、23.44、46.88、93.75、187.50、375.00、750.00、1 500.00 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶劑為PBS)。在容量瓶中分別加入配制好的以丙酮為溶劑、終濃度為4×10-4g/L的芘-丙酮溶液100 μL，揮干溶劑，繼續(xù)加入1.5 mL膠束標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋，避光條件下振搖過夜。使用熒光分光光度儀測(cè)定350～450 nm范圍內(nèi)待測(cè)溶液的熒光光譜，平行實(shí)驗(yàn)5次。熒光條件設(shè)置為激發(fā)波長(zhǎng)334 nm，狹縫寬度2.5 nm，記錄373、383 nm處的熒光強(qiáng)度值(I)，計(jì)算I373 nm/I383 nm的比值。以膠束濃度(C)的負(fù)對(duì)數(shù)(lgC)為橫坐標(biāo)，I373 nm/I383 nm的比值為縱坐標(biāo)繪圖，曲線突變處橫坐標(biāo)即為膠束臨界濃度的負(fù)對(duì)數(shù)。

1.5 cRGD-FRU-ASM藥物體外釋放效率精密移取cRGD-FRU-ASM 1 mL于透析袋(載留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500)中，將其置于含0.5 g/L十二烷基硫酸鈉的PBS透析介質(zhì)中，分別調(diào)節(jié)透析介質(zhì)pH為7.4、6.5、5.0。分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h取樣，采用HPLC法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)FRU釋放量。以無響應(yīng)型膠束cRGD-FRU-M為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 cRGD-FRU-ASM體外抗腫瘤活性測(cè)定

1.6.1cRGD-FRU-ASM對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用 首先觀察空白載體對(duì)正常細(xì)胞活力的影響。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，在避光條件下用含有不同濃度(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 mg/L)空白載體cRGD-ASM的培養(yǎng)基刺激24或48 h，加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入180 μL的二甲基亞砜，37 ℃搖床搖晃20 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白對(duì)照組)/(A對(duì)照組-A空白對(duì)照組)，空白對(duì)照組僅有PBS溶液，對(duì)照組僅有細(xì)胞和培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，在避光條件下，用含不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 mg/L)FRU或cRGD-FRU-ASM的培養(yǎng)基處理，同上方法檢測(cè)作用24 h或48 h后的細(xì)胞存活情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.2細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞以每孔2×105個(gè)均勻鋪于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)基，分別加入含游離FITC、FITC-ASM、cRGD-FITC-ASM的培養(yǎng)基(FITC濃度均為2.5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、4 h，棄去培養(yǎng)基。用PBS清洗3遍，收集細(xì)胞，加入200 μL PBS吹打成單細(xì)胞懸液保存在冰盒中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hela細(xì)胞對(duì)不同制劑的攝取情況。

1.6.3Transwell實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn)分為6組：空白對(duì)照組(PBS)、空白載體組(cRGD-ASM)、FRU組(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)RU的濃度取3 mg/L)、無響應(yīng)型膠束組(cRGD-FRU-M)、無靶頭膠束組(FRU-ASM)、終制劑組(cRGD-FRU-ASM)。將含有上述制劑的無血清Hela細(xì)胞懸液分別加入Transwell上室中，將含有高濃度血清(體積分?jǐn)?shù)20%)的培養(yǎng)基加入下室中。孵育24 h后，用脫脂棉擦掉上室中沒有遷移的細(xì)胞，然后用40 g/L多聚甲醛溶液固定20 min，再用PBS進(jìn)行清洗，清洗后用10 g/L結(jié)晶紫染色20 min。用PBS清洗掉上室表面的浮色后，顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的Hela細(xì)胞。侵襲實(shí)驗(yàn)為在上室中預(yù)先加入20 μL稀釋后的基質(zhì)膠，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。遷移率(侵襲率)=實(shí)驗(yàn)組下室Hela細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照組下室Hela細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6.4HUVEC小管形成實(shí)驗(yàn) 基質(zhì)膠以50 μL/孔加入96孔板中，放置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜固化，之后用PBS水化。加入含有不同制劑(同1.6.3分組)的單細(xì)胞懸液，靜置常規(guī)培養(yǎng)6 h后，顯微鏡下觀察HUVEC小管形成情況：每組隨機(jī)取5個(gè)視野(×20)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野里的小管數(shù)，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.5HUVEC中VEGFR-2蛋白表達(dá)的檢測(cè) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞傳代，待其貼壁后，用不同制劑(同1.6.3分組)進(jìn)行刺激，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集沉淀，用RIPA裂解液處理后在4 ℃、12 000×g條件下離心15 min。采用Western blot檢測(cè)VEGFR-2蛋白的表達(dá)，VEGFR-2一抗按1∶1 000稀釋，以β-actin為內(nèi)參。目的蛋白的表達(dá)水平以目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)圖繪制。采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較各組Hela細(xì)胞遷移率、侵襲率、HUVEC小管形成數(shù)及VEGFR-2蛋白表達(dá)水平的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 cRGD-FRU-ASM的表征cRGD-FRU-ASM為乳白色混懸液，粒徑大小均一，分散性良好。cRGD-FRU-ASM的粒徑約為31.89 nm，分散指數(shù)為0.231，電位為-17.4 mV。透射電鏡下可見cRGD-FRU-ASM膠束為規(guī)整的近圓形(圖2)。膠束對(duì)FRU有較好的包封，包封率為(96.4±0.9)%，載藥量為(8.8±0.7)%。

圖2 透射電鏡下的cRGD-FRU-ASM

2.2 cRGD-FRU-ASM的臨界濃度圖3中的突變點(diǎn)所對(duì)應(yīng)濃度即為臨界濃度的負(fù)對(duì)數(shù)，換算得到臨界濃度為4.267 mg/L。

圖3 cRGD-FRU-ASM濃度曲線

2.3 cRGD-FRU-ASM藥物體外釋放效率見圖4。cRGD-FRU-ASM中FRU的釋放量隨pH的降低逐漸增多，pH 7.4時(shí)，F(xiàn)RU累積釋放量不到30%，pH 5.0時(shí)，F(xiàn)RU累積釋放量約80%。而各pH條件下cRGD-FRU-M FRU的釋放量無明顯差異。

圖4 cRGD-FRU-ASM的體外藥物釋放效率

2.4 cRGD-FRU-ASM對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用不同濃度空白載體cRGD-ASM刺激HUVEC 24 h和48 h后，細(xì)胞存活率均超過80%(圖5A)，提示空白載體對(duì)細(xì)胞活力的影響很小。

與相同濃度的FRU相比，終制劑cRGD-FRU-ASM處理后Hela細(xì)胞存活率降低，且處理48 h的細(xì)胞活力均低于24 h(圖5B)。

2.5 Hela細(xì)胞對(duì)不同制劑攝取量的比較Hela細(xì)胞對(duì)不同制劑的攝取量不同，對(duì)游離FITC的攝取量在1、2、4 h時(shí)分別為4.6%、7.5%和15.3%，對(duì)無靶頭制劑FITC-ASM的攝取量為13.3%、36.5%和47.4%，而對(duì)有靶頭終制劑cRGD-FITC-ASM的攝取量分別為43.0%、82.5%和96.7%。

2.6 不同制劑對(duì)Hela細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6A、B)與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6C、D)一致，空白對(duì)照組(PBS)和空白載體組(cRGD-ASM)遷移細(xì)胞數(shù)最多，含有FRU的各實(shí)驗(yàn)組制劑均能不同程度地抑制Hela細(xì)胞遷移，其中終制劑組(cRGD-FRU-ASM)遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均少于其他各實(shí)驗(yàn)組，遷移率和侵襲率最低(F=194.840、84.119，P均<0.001)。

2.7 各組HUVEC小管形成數(shù)量及VEGFR-2蛋白表達(dá)量的比較空白對(duì)照組和空白載體組可以清晰看到完整的環(huán)狀小管結(jié)構(gòu)，含有FRU的制劑組(FRU組、無響應(yīng)型膠束組、無靶頭膠束組、終制劑組)小管形成數(shù)量明顯減少，其中終制劑組(cRGD-FRU-ASM)內(nèi)皮細(xì)胞小管形成數(shù)量最少(F=98.260，P<0.001)，無明顯完整的小管形成(圖7)。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，含有FRU的各制劑組HUVEC細(xì)胞中VEGFR-2的水平均有所降低，且終制劑組最低(F=158.664，P<0.001)(圖8)。

A：cRGD-ASM對(duì)HUVEC增殖的影響；B：FRU和cRGD-FRU-ASM對(duì)Hela增殖的影響

A、B:遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果；C、D:侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果；a:空白對(duì)照組；b:空白載體組；c:FRU組；d：無響應(yīng)型膠束組；e:無靶頭膠束組；f:終制劑組；*：P<0.05

a:空白對(duì)照組；b:空白載體組；c:FRU組；d：無響應(yīng)型膠束組；e:無靶頭膠束組；f:終制劑組；*：P<0.05

a:空白對(duì)照組；b:空白載體組；c:FRU組；d：無響應(yīng)型膠束組；e:無靶頭膠束組；f:終制劑組；*：P<0.05

3 討論

FRU可以抑制酪氨酸激酶的活性，起到抗血管生成的作用，作用靶點(diǎn)是VEGFR激酶家族[5]。本研究采用薄膜分散法成功制備了酸敏感靶向膠束cRGD-FRU-ASM，對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)觀察，并分別測(cè)定了包封率、載藥量及臨界濃度；再分別以pH 7.4、6.5、5.0模擬正常組織、腫瘤組織以及腫瘤微環(huán)境，考察cRGD-FRU-ASM的體外藥物釋放情況；為觀察Hela細(xì)胞對(duì)cRGD-FRU-ASM的攝取情況，本實(shí)驗(yàn)選擇具有強(qiáng)烈黃綠色熒光的FITC代替沒有熒光的FRU，觀察FITC、FITC-ASM、cRGD-FITC-ASM在Hela細(xì)胞內(nèi)的攝取情況；接著進(jìn)行cRGD-FRU-ASM體外抗腫瘤活性的觀察。既往研究[8]顯示在新生血管形成后期，HUVEC已經(jīng)完成遷移和侵襲，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)逐漸形成小管狀的結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)通過小管形成實(shí)驗(yàn)體外觀察cRGD-FRU-ASM對(duì)內(nèi)皮小管形成的抑制情況，評(píng)價(jià)其體外抗血管生成作用[20]。

本實(shí)驗(yàn)制備的cRGD-FRU-ASM粒徑在30 nm左右，呈規(guī)整的近圓形，大小均勻，分散性良好。該載體制劑臨界濃度低，表明cRGD-FRU-ASM可用于靜脈注射，具有較高的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的微循環(huán)時(shí)間，從而具有更有效的腫瘤殺傷作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白載體cRGD-ASM對(duì)HUVEC幾乎沒有殺傷作用，證明本研究選用的靶向膠束載體具有良好的生物安全性。cRGD-FRU-ASM在腫瘤微酸環(huán)境中FRU釋放量最高，同時(shí)Hela細(xì)胞對(duì)靶向膠束的攝取率大大提高，可實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤組織的富集和攝??；終制劑(cRGD-FRU-ASM)刺激的細(xì)胞活力低于FRU，這可能是由于FRU的半衰期較短，而用膠束包裹后形成的終制劑延長(zhǎng)了FRU的釋藥時(shí)間，增強(qiáng)了對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲、遷移的抑制作用。此外，各組細(xì)胞內(nèi)皮小管形成數(shù)量及VEGFR-2蛋白表達(dá)量進(jìn)一步證實(shí)cRGD-FRU-ASM具有較好的抗血管生成作用。

綜上所述，cRGD-FRU-ASM靶向膠束可實(shí)現(xiàn)FRU在腫瘤組織的富集，提高了FRU的利用度，可能是一個(gè)有潛力的FRU新劑型。然而本研究?jī)H考察了體外抗腫瘤活性，其長(zhǎng)期安全性和有效性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。