周 洋，楊嘉君

1)上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306 2)上海市第六人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 上海 201306

膠質(zhì)瘤約占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的60%，迄今為止，其具體的分子機制尚不明晰[1-2]。丁酸鈉(sodium butyrate,NaB)是一種短鏈脂肪酸鹽，在人體內(nèi)主要來源于大腸微生物對不可消化多糖的厭氧發(fā)酵[3]。NaB可以通過改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開合影響細(xì)胞凋亡[4]。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是一種DNA烷基化試劑，可透過血腦屏障誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA甲基化，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]，是膠質(zhì)瘤治療的一線藥物，但患者也很容易對TMZ產(chǎn)生耐藥[6]。細(xì)胞焦亡也是一種程序性細(xì)胞死亡過程[7]。與凋亡不同，焦亡是通過效應(yīng)蛋白Caspase-1實現(xiàn)的[8]，這一蛋白的活化會刺激消皮素D(gasdermin D，GSDMD)的活化、裂解，其N末端在細(xì)胞表面形成穿孔，造成細(xì)胞破裂，進而導(dǎo)致眾多促炎細(xì)胞因子如IL-1β和IL-18的激活，進一步促發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)[9]。細(xì)胞凋亡則難以產(chǎn)生這種強烈的炎癥反應(yīng)。本研究聚焦于NaB聯(lián)合TMZ對膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM培養(yǎng)基購于美國HyClone公司，胎牛血清購于美國Gibco公司。NaB和MTT購于美國Sigma-Aldrich Chemical公司，TMZ購于美國MCE公司。結(jié)晶紫試劑選購于中國北京索萊寶科技有限公司，Transwell系統(tǒng)購于美國Corning公司，Matrigel試劑購于美國BD Biosciences公司。BCA試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒均購于中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于中國翌圣生物公司。NLRP3、IL-1β、GSDMD和β-actin抗體均購于美國Abcam公司。

1.2 NaB作用濃度的篩選人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞自美國類型培養(yǎng)物收集中心獲取。將U251細(xì)胞按5 000個/孔接種于96孔板，用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，于37 ℃和體積分?jǐn)?shù)5%CO2的保濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。分別加入2.5、5.0、10.0和20.0 mmol/L NaB刺激24 h，將原培養(yǎng)基棄除，更換為MTT溶液處理4 h，吸除MTT溶液并添加DMSO，置于搖床振蕩10 min。以未加NaB處理的細(xì)胞為空白對照。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測樣品在570 nm處的吸光度，細(xì)胞活性=實驗組吸光度/空白對照吸光度×100%。選取適宜濃度用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組將U251細(xì)胞分別用100 μmol/L TMZ、10 mmol/L NaB、兩者聯(lián)合(同時加藥)處理，以未加藥處理的細(xì)胞為空白對照。處理24 h后進行各項指標(biāo)的檢測。

1.4 細(xì)胞遷移能力的測定將U251細(xì)胞按1×105個/孔接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度達90%左右時，用200 μL無菌移液槍頭垂直于6孔板內(nèi)進行劃痕，用PBS清洗并更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基，立即拍攝劃痕照片，此時計為0 h。之后按1.3分組處理，每組3孔。24 h后再次拍攝劃痕照片，用Image J軟件處理圖像并計算遷移率，實驗重復(fù)3次。遷移率=(0 h劃痕寬度-處理后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.5 細(xì)胞侵襲能力的測定將Transwell小室上室用Matrigel包被，于下室中加入600 μL完全培養(yǎng)基。將U251細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基混勻，按5×104個/孔接種到上室，按1.3分組處理24 h后，將下室用多聚甲醛固定20 min，以結(jié)晶紫染色，最后于倒置顯微鏡下成像。選取3個200倍視野計數(shù)細(xì)胞，取平均值，即為侵襲細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測將U251細(xì)胞按1×105個/孔接種于6孔板內(nèi)，按1.3分組處理24 h。收集細(xì)胞并用PBS清洗3遍，加PI和Annexin V-FITC染色15 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞中ROS生成量的檢測U251細(xì)胞按1×105個/孔接種到24孔板中，按1.3分組處理24 h。之后將細(xì)胞與10 μmol/L DCFH-DA充分混勻，于37 ℃避光環(huán)境中孵育20 min，用PBS清洗3次，上流式細(xì)胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞中GSDMD、NLRP3和IL-1β蛋白的檢測將U251細(xì)胞按每孔1×105個接種于6孔板內(nèi)，按1.3分組培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，在低溫環(huán)境中用RIPA緩沖液提取蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。使用100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，BSA封閉膜1 h，4 ℃環(huán)境中加GSDMD、NLRP3、IL-1β(均按1∶1 000稀釋)及β-actin(1∶5 000稀釋)抗體孵育12 h，室溫下加二抗孵育1 h，成像儀中掃描顯影。其中GSDMD抗體可顯示出GSDMD、GSDMD-N兩種蛋白。將所得圖片用Image J軟件進行灰度值分析，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達量。實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析，4組U251細(xì)胞的遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞凋亡率、ROS生成量，以及GSDMD、GSDMD-N、NLRP3和IL-1β蛋白表達水平的比較采用2×2析因設(shè)計的方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NaB作用濃度的篩選不同濃度NaB作用后，U251細(xì)胞活性測定結(jié)果見圖1。根據(jù)圖1，后續(xù)實驗選擇10 mmol/L NaB處理細(xì)胞。

*:與0.0 mmol/L組相比，P<0.05

2.2 NaB聯(lián)合TMZ對U251細(xì)胞遷移、侵襲能力及ROS生成的影響4組細(xì)胞遷移和侵襲實驗結(jié)果見圖2、3。4組細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)及ROS生成量的比較見表1?？梢钥闯?，NaB與TMZ均能抑制U251細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進U251細(xì)胞ROS的生成,兩者聯(lián)合作用效果更強。

圖2 4組U251細(xì)胞遷移實驗結(jié)果

圖3 4組U251細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果

表1 4組U251細(xì)胞遷移率、 侵襲細(xì)胞數(shù)及ROS生成量的比較

2.3 NaB聯(lián)合TMZ對U251細(xì)胞凋亡的影響由表2可知NaB與TMZ均能促進U251細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合作用更強。

2.4 NaB聯(lián)合TMZ對U251焦亡的影響由圖4和表3可知，TMZ與NaB均能促進細(xì)胞中GSDMD蛋白的解離及炎癥蛋白IL-1β及NLRP3的表達，兩者聯(lián)合作用更強。

表2 4組U251細(xì)胞凋亡率的比較

1：空白對照組；2：TMZ組；3：NaB組；4：聯(lián)合作用組

表3 4組U251細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達水平的比較

3 討論

手術(shù)聯(lián)合放化療是現(xiàn)階段治療膠質(zhì)瘤的主流手段，化療藥物耐藥是膠質(zhì)瘤治療需要面對的重要問題[2]。TMZ很容易穿透血腦屏障，通過誘導(dǎo)不依賴于DNA損傷的應(yīng)激反應(yīng)來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是臨床上治療腦腫瘤最有效的藥物之一，但使用劑量較高，易產(chǎn)生明顯的毒副作用[6]。所以，如何提高其療效同時降低毒性是目前研究的重點。越來越多的研究[10-11]表明，NaB是一種潛在的抗癌藥物，在結(jié)腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等顯示出治療效應(yīng)[12-15]。NaB與其他藥物聯(lián)合治療腦腫瘤是一個可行的選擇[16-17]。研究[4,14]發(fā)現(xiàn)， NaB可以通過打開膠質(zhì)瘤線粒體膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔，引起細(xì)胞內(nèi)線粒體質(zhì)子漏增多，進而引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，并且這一凋亡現(xiàn)象與NaB提高腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶-2的表達相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，NaB在體外可以抑制U251細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡，并且NaB與TMZ聯(lián)合作用效果更顯著。細(xì)胞焦亡是一種有炎癥小體參與的細(xì)胞程序性死亡[18]，活化的GSDMD/GSDME蛋白導(dǎo)致細(xì)胞膜孔的形成，最終致使細(xì)胞漲破，促進IL-1β和IL-18的釋放和活化[19]。有研究[20]表明GSDMD的過度表達與膠質(zhì)瘤的分級以及不良預(yù)后有關(guān)。細(xì)胞焦亡是一種高度敏感的過程，ROS可以調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡[21]。本研究結(jié)果顯示，NaB與TMZ聯(lián)合作用后U251細(xì)胞GSDMD-N蛋白和炎癥蛋白IL-1β及NLRP3表達升高，表明NaB與TMZ聯(lián)合可以促進U251細(xì)胞中GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。

本實驗結(jié)果支持NaB與TMZ聯(lián)合作用增加U251細(xì)胞凋亡和焦亡的假設(shè)。因此，NaB與TMZ聯(lián)合使用可能是治療膠質(zhì)瘤的一種可選途徑。