趙 爽,周羽琪,楊旭妍,范震宇,李方全,袁太勇,吳 桐,王玉書
(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)
硫代葡萄糖苷(以下簡稱硫苷)是十字花科植物中所特有的一類含硫、氮元素的次生代謝產(chǎn)物,其在植物生長發(fā)育、風(fēng)味形成等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。根據(jù)硫苷前體氨基酸側(cè)鏈基團的不同,硫苷可分為脂肪族(蛋氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)、吲哚族(色氨酸)以及芳香族(苯丙氨酸和酪氨酸)三大類,目前在十字花科植物中已發(fā)現(xiàn)近200 種硫苷[2-3]。硫苷在黑芥子酶的作用下水解生成異硫氰酸酯,異硫氰酸酯在抑制I型致癌酶產(chǎn)生的同時,還可激活I(lǐng)I型脫毒酶抑制化學(xué)致癌基因來發(fā)揮其抗癌功效[4]。硫苷及其降解產(chǎn)物除了對多種癌癥有一定的預(yù)防作用外[5],還可降低人體心血管疾病的患病風(fēng)險[6],并對糖尿病也有一定的預(yù)防作用[7]。
硫苷合成過程受溫度、光照、營養(yǎng)元素、激素、逆境脅迫等生長環(huán)境因素影響,同時硫苷含量也與硫元素密切相關(guān),外源施加硫元素是提高植物中硫苷含量的有效方法。初婷等[8]通過噴施不同濃度的MgSO4顯著提高了西藍花芽苗菜中硫苷含量。Yang Runqiang等[9]研究發(fā)現(xiàn)噴施ZnSO4溶液和K2SO4也同樣可以顯著提高西藍花芽苗菜的硫苷含量。其原因在于SO42-在被植物吸收后,經(jīng)過還原同化等反應(yīng)形成半胱氨酸,為硫苷合成提供原料[10]。而當(dāng)環(huán)境中硫元素不足時,植物通過減少次級代謝產(chǎn)物硫苷的合成和增加硫苷降解來滿足初生代謝中對硫元素的需求,從而緩解硫元素缺乏對植物的影響[11]。硒與硫為同主族元素,二者在植物代謝過程中具有協(xié)同促進和競爭性抑制關(guān)系,然而外源補充硒元素對硫苷的影響尚無一致的結(jié)論。有學(xué)者證明適當(dāng)?shù)奈猁}處理會增加蘿卜葉片中硫苷的含量[12]。但Tian Ming等[13]研究表明補充硒元素抑制了硫苷合成基因MYB28和MYB34的表達,從而降低了植株中總硫苷含量及吲哚族、脂肪族硫苷含量。硒是人體必需的微量元素,其形成的硒甲基化合物在抗癌、抗氧化等方面效果顯著[14]。
白菜(Brassica rapavar.glabraRegel)口感清甜柔嫩、營養(yǎng)豐富,是世界范圍內(nèi)廣泛栽培和食用的葉菜類蔬菜。研究發(fā)現(xiàn)十字花科蔬菜芽苗菜硫苷含量及活性成分均顯著高于成熟蔬菜[15]。芽苗菜具有種植周期短、種植簡單方便、口味獨特,綠色安全同時營養(yǎng)價值豐富等優(yōu)點,但目前在我國,十字花科商品芽苗菜主要以蘿卜芽苗菜和西藍花芽苗菜為主,而對白菜芽苗菜的研究鮮有報道。因此本研究以白菜芽苗菜為試材,研究硒、硫及硒硫聯(lián)合處理對其硫苷含量和生理生化指標的影響,為開發(fā)富硒、高含量硫苷的功能性食品提供理論參考。
‘德高536’白菜種子 山東德高種業(yè)有限公司。 沒食子酸、DEAE-Sephadex A-25 北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、硫酸酯酶、烯丙基硫苷美國Sigma公司;Folin-酚、甲醇、乙酸鋇 國藥集團上海化學(xué)試劑有限公司。
超高效液相色譜靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾公司;Optima 7300 DV電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國珀金埃爾默公司;WX-8000密閉微波消解系統(tǒng) 上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司。
1.3.1 種子發(fā)芽處理
挑選約1000 粒籽粒飽滿的種子于50 mL蒸餾水中浸泡4 h,將其均勻點播在發(fā)芽盤(30 cmh 22 cm)中,盤底加400 mL去離子水,每2 d換1 次水,置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中,光照16 h/黑暗8 h。第1天各組均噴施20 mL去離子水,此后每24 h各組分別噴施20 mL不同溶液,設(shè)置以下不同處理:噴施去離子水為對照,記作CK;噴施4 mmol/L ZnSO4溶液記作S4;噴施50 μmol/L Na2SeO3溶液記作LSe;噴施100 μmol/L Na2SeO3溶液記作HSe;噴施10 mL 4 mmol/L ZnSO4溶液和10 mL 50 μmol/L Na2SeO3溶液記作LSeS;噴施10 mL 4 mmol/L ZnSO4溶液和10 mL 100 μmol/L Na2SeO3溶液記作HSeS。
分別于處理4 d和6 d進行取樣,洗凈芽苗菜殘留溶液,擦干水分,部分鮮樣用于測定生理指標,其余樣品冷凍干燥后使用高通量研磨儀將葉片粉碎,得到芽苗菜凍干粉末。
1.3.2 形態(tài)特征及生長指標測定
從各處理組中隨機選取10 株芽苗菜,擺放整齊后,用相機拍攝記錄形態(tài)特征。隨機選取30 株芽苗菜,用游標卡尺測量芽長,并用萬分之一天平稱質(zhì)量,計算芽苗菜單株平均質(zhì)量。
1.3.3 總酚含量和DPPH自由基清除能力測定
上海市家庭醫(yī)生團隊成員對社區(qū)藥學(xué)服務(wù)的認知、評價和需求調(diào)查 ……………………………………… 沈 美等(13):1841
取各處理組芽苗菜,參照Wang Mengyu等[16]的方法測定芽苗菜總酚含量;參照龔春燕等[17]的方法測定芽苗菜DPPH自由基清除能力。
1.3.4 硫苷組分及含量測定
硫苷組分及含量測定參考Yin Ling等[18]的方法并稍作修改。稱取0.2 g芽苗菜凍干粉末于75 ℃水浴鍋中加熱1 min,加入4 mL提前預(yù)熱至75 ℃的70%(體積分數(shù),下同)甲醇溶液和100 μL 5 mmol/L 2-丙烯基硫苷(內(nèi)標物)溶液,75 ℃水浴10 min,取出冷卻后加入1 mL 0.4 mol/L乙酸鋇溶液,5000 r/min離心10 min,收集上清液,剩余沉淀再用70%甲醇溶液提取2 次,合并3 次提取的上清液并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容。取5 mL上述提取液經(jīng)DEAE-Sephadex A-25陰離子交換柱純化,提取液排干后向柱中加入250 μL 1.2 mg/mL的硫酸酯酶溶液,于室溫下酶解16 h,然后用2 mL去離子水洗脫,所得洗脫液經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后,采用超高效液相色譜靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(配備Hypersil GOLD? C18色譜柱(50 mmh 2.1 mm,1.9 μm))分析硫苷組分及含量。
液相色譜條件:流動相A為0.1%甲酸-水溶液;流動相B為純甲醇;梯度洗脫程序:0~3 min,2% B;3~20 min,25% B;20~25 min,50% B;25~28 min,2% B;流速0.3 mL/min。
質(zhì)譜條件:電噴霧正離子源模式;質(zhì)量范圍105~1000m/z;鞘層氣體流速35 Arb;輔助氣體流速15 Arb;噴霧電壓3.50 kV;毛細管溫度320 ℃;輔助氣體加熱器溫度300 ℃。
1.3.5 硒、硫元素含量測定
硒、硫元素含量測定參考Tian Ming等[13]的方法并稍作修改。稱取0.01 g芽苗菜凍干樣品粉末加入微波消解罐中,加入3 mL質(zhì)量分數(shù)36.5%濃鹽酸和1 mL質(zhì)量分數(shù)68%濃硝酸,旋緊罐蓋,于WX-8000密閉微波消解系統(tǒng)進行消解,消解完成冷卻后,用質(zhì)量分數(shù)3%稀硝酸溶液定容至100 mL,利用Optima 7300 DV電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定硒、硫元素含量。
2.1.1 白菜芽苗菜形態(tài)特征及芽長、單株平均質(zhì)量
不同處理下芽苗菜生長4 d和6 d的外觀形態(tài)如圖1所示,芽苗菜經(jīng)4 mmol/L ZnSO4溶液處理后其生長狀態(tài)相較于對照組受到了明顯的抑制,而50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理促進芽苗菜的生長,50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液聯(lián)合4 mmol/L的ZnSO4溶液處理緩解了4 mmol/L的ZnSO4溶液處理對芽苗菜生長的抑制作用。
圖1 不同處理對白菜芽苗菜外觀形態(tài)的影響Fig.1 Effects of different treatments on morphology of Chinese cabbage sprouts
如圖2所示,在白菜發(fā)芽期間,芽苗菜的芽長及單株平均質(zhì)量都隨著發(fā)芽時間的延長而增加。4 mmol/L的ZnSO4溶液處理后芽苗菜芽長和單株平均質(zhì)量均顯著低于對照組(P<0.05),50 μmol/L的Na2SeO3溶液處理下芽苗菜的芽長和單株平均質(zhì)量均最高,且均顯著高于相同發(fā)芽時間的對照組(P<0.05);發(fā)芽6 d時,100 μmol/L Na2SeO3溶液處理的芽苗菜芽長及單株平均質(zhì)量與對照組相比未表現(xiàn)出明顯變化。4 mmol/L的ZnSO4溶液分別聯(lián)合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理下芽苗菜的芽長和單株平均質(zhì)量雖然都顯著低于相同發(fā)芽時間的對照組,但均高于4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組,說明Na2SeO3溶液處理會緩解4 mmol/L的ZnSO4溶液處理對芽苗菜生長的抑制作用。
圖2 不同處理對白菜芽苗菜芽長(A)和單株平均質(zhì)量(B)的影響Fig.2 Effects of different treatments on sprout length (A) and average mass (B) of Chinese cabbage sprouts
2.1.2 白菜芽苗菜總酚含量
如圖3所示,在芽苗菜發(fā)芽期間,總酚含量隨著發(fā)芽時間的延長而降低,發(fā)芽6 d時的總酚含量顯著低于發(fā)芽4 d時的總酚含量(P<0.05)。在發(fā)芽4 d時,4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組總酚含量顯著高于對照組,說明4 mmol/L的ZnSO4溶液處理對芽苗菜總酚合成具有一定促進作用;而50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理下芽苗菜總酚含量均低于對照組,分別降低了5.33%和7.13%,其中100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組總酚含量顯著低于對照組(P<0.05);4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合50 μmol/L和100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組總酚含量分別高于對照組12.87%和6.28%。在發(fā)芽6 d時,4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合50 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組總酚含量顯著高于其他處理組(P<0.05),其他處理組之間總體無顯著性差異。
圖3 不同處理對白菜芽苗菜總酚含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on the content of total phenolics in Chinese cabbage sprouts
2.1.3 白菜芽苗菜DPPH自由基清除能力
如圖4所示,在芽苗菜發(fā)芽期間DPPH自由基清除能力隨著發(fā)芽時間的延長而降低,各組發(fā)芽6 d時的DPPH自由基清除能力顯著低于發(fā)芽4 d(P<0.05),同時與對照組相比,在發(fā)芽6 d時50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組DPPH自由基清除能力顯著降低(P<0.05),其他處理組之間總體無顯著性差異(P>0.05)。4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組發(fā)芽4 d時芽苗菜的DPPH自由基清除能力顯著高于對照組(P<0.05);4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合50 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組芽苗菜DPPH自由基清除能力均顯著高于對照(P<0.05),而4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合100 μmol/L Na2SeO3溶液處理組芽苗菜DPPH自由基清除能力略高于相同發(fā)芽時間的對照組,但并未達到顯著水平(P>0.05)。
圖4 不同處理對白菜芽苗菜DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effects of different treatments on DPPH radical scavenging capacity of Chinese cabbage sprouts
2.1.4 白菜芽苗菜硒元素和硫元素含量
由圖5A可知,在芽苗菜發(fā)芽期間,除對照組和4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組外,各處理組硒元素含量均隨著發(fā)芽時間的延長顯著升高(P<0.05)。在發(fā)芽4 d或6 d時,無論是50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組還是4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組,芽苗菜硒元素含量均顯著高于對照組及4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組(P<0.05),且硒元素含量依次為100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組>4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組>50 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組>4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合50 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組>對照組或4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組,隨著施用Na2SeO3溶液濃度的升高,芽苗菜中硒元素含量也明顯升高,說明Na2SeO3溶液作為富硒食品營養(yǎng)強化劑,其施用濃度與芽苗菜中硒元素含量成正比。如圖5B所示,芽苗菜中硫元素含量除4 mmol/L ZnSO4溶液聯(lián)合100 μmol/L Na2SeO3溶液處理組在發(fā)芽6 d時顯著升高外,其余各處理組間硫元素含量沒有明顯的變化,說明硒與硫的施用并不會引起芽苗菜中硫元素含量的變化。
圖5 不同處理對白菜芽苗菜硒元素(A)和硫元素(B)含量的影響Fig.5 Effects of different treatments on the contents of total Se (A)and S (B) in Chinese cabbage sprouts
2.2.1 白菜芽苗菜硫苷組分鑒定結(jié)果
硫苷極性較強,且不同硫苷單體在結(jié)構(gòu)上只有側(cè)鏈R基團的微小區(qū)別。在正電離子噴霧的碰撞下,已經(jīng)過硫酸酯酶作用形成的脫硫硫苷失去1分子葡萄糖(m/z162.1),形成特征碎片離子[M-G+H]+,同時還易與H+、Na+、K+結(jié)合形成[M+H]+、[M+Na]+及[M+K]+離子,因此可通過特征離子計算脫硫硫苷的相對分子質(zhì)量,進而對硫苷分子進行定性。如表1所示,在白菜芽苗菜中共檢測出11 種硫苷成分,分別為脂肪族(6 種)、吲哚族(4 種)、芳香族(1 種)硫苷,并且不同處理組中的硫苷組分相同。
表1 白菜芽苗菜硫苷組分鑒定結(jié)果Table 1 Glucosinolates identified in Chinese cabbage sprouts
2.2.2 白菜芽苗菜的硫苷含量
由圖6可知,隨發(fā)芽時間的延長,各組的硫苷含量大體呈增加趨勢。發(fā)芽4 d時,與對照組相比,不同溶液處理顯著提高了芽苗菜5MOSP和4OH的含量(P<0.05)。與對照組相比,在芽苗菜發(fā)芽4 d和6 d時,4 mmol/L的ZnSO4溶液處理總體上提高了各組分硫苷含量;與對照組相比,50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理顯著提高了發(fā)芽期間(4 d和6 d時)GER含量和發(fā)芽4 d時NAS含量(P<0.05),而發(fā)芽4 d時GBC含量無顯著變化(P>0.05);與對照組相比,相同發(fā)芽時間50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理組PRO、GAP、GRA、GBN、NEO含量均顯著降低(P<0.05),而4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理緩解了單獨噴施50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液對硫苷合成的抑制作用。
圖6 不同處理對白菜芽苗菜各組分硫苷含量的影響Fig.6 Effects of different treatments on the contents of individual glucosinolates in Chinese cabbage sprouts
2.2.3 不同處理白菜芽苗菜芳香族、脂肪族、吲哚族硫苷及總硫苷含量
發(fā)芽6 d時白菜芽苗菜不同類型硫苷含量如表2所示。與對照組相比,4 mmol/L的ZnSO4溶液處理可以顯著提高脂肪族、吲哚族、芳香族硫苷及總硫苷含量(P<0.05);100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理對芳香族硫苷含量無顯著影響(P>0.05);50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理均顯著降低了脂肪族、吲哚族硫苷及總硫苷含量(P<0.05);相對而言,4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理會緩解50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液對硫苷合成的抑制作用,其總硫苷含量甚至高于4 mmol/L的ZnSO4溶液處理組,其中4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合50 μmol/L Na2SeO3溶液處理組發(fā)芽6 d時總硫苷含量最高,比對照增加約50%,為50 μmol/L Na2SeO3溶液處理組芽苗菜發(fā)芽6 d時的2.75 倍。此外,由表2可知,芽苗菜中硫苷主要以脂肪族硫苷為主,約占總硫苷含量的95%。
表2 不同處理對發(fā)芽6 d時白菜芽苗菜硫苷含量的影響Table 2 Effects of different treatments on the contents of glucosinolates in Chinese cabbage sprouts on the sixth day of sprouting
硫苷是十字花科植物中特有的一類重要的含氮、硫元素的次生代謝產(chǎn)物及抗氧化物[19]。硫元素作為植物生長過程中所必需的營養(yǎng)元素,是合成蛋氨酸的主要原料,同時蛋氨酸又是硫苷合成的前體氨基酸之一,所以十字花科作物對于硫的需求尤其敏感[20]。因此,許多學(xué)者試圖通過外源施加硫肥來提高十字花科植物中硫苷含量。在本研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)芽6 d后,與對照組相比,4 mmol/L的ZnSO4溶液處理也可以顯著提高脂肪族、吲哚族、芳香族硫苷及總硫苷含量。硫元素和硒元素是同主族元素,二者代謝途徑相似,外源硒強化可能會影響含硫代謝產(chǎn)物的形成和降解。Tian Ming[13]和Avila[21]等研究證明外源硒強化會顯著降低成熟西蘭花中硫苷含量,而對西蘭花芽苗菜中的硫苷含量沒有影響。但在本研究中發(fā)現(xiàn)50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理會顯著降低白菜芽苗菜中脂肪族、吲哚族硫苷及總硫苷含量。硒處理雖然能夠抑制硫苷的合成,但對硫元素含量無明顯影響,推測硒并不是通過抑制硫的吸收而阻礙硫苷的合成。本研究在白菜中檢測到11 種硫苷組分,硒、硫和硒硫聯(lián)合處理對硫苷物質(zhì)種類沒有影響,其中檢測出的GRA在白菜類蔬菜中鮮有發(fā)現(xiàn)。另外本研究發(fā)現(xiàn)白菜中硫苷主要以GAP和GBN為主,約占總硫苷含量的44%和48%,這與Lee[22]、Wei Jia[23]等研究大白菜和小白菜硫苷組成的結(jié)果相似,而且這些物質(zhì)對白菜類蔬菜風(fēng)味形成具有重要影響[24]。
硫苷能夠起到抗癌作用的主要原因是其降解產(chǎn)物異硫氰酸酯具有一定的抗腫瘤活性[25]。GBC、NAS以及GRA產(chǎn)生的異硫氰酸酯為吲哚-3-甲醇、苯乙基異硫氰酸酯以及蘿卜硫素,它們對乳腺癌及宮頸癌有一定的抑制作用[26-28]。因此,開發(fā)高GBC、NAS、GRA含量的蔬菜具有一定意義。本研究中4 mmol/L的ZnSO4溶液處理可以顯著提高GBC和NAS含量,而GRA含量提高尚未達到顯著水平。硒處理顯著降低GRA和GBC含量,而4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理可以緩解50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理的抑制作用,因此硒硫互作處理可以獲得高硫苷富硒芽苗菜產(chǎn)品。同時本研究結(jié)果表明發(fā)芽6 d時大部分處理組硫苷含量明顯高于4 d時硫苷含量,這和Bellostas等[29]在研究卷心菜和花椰菜時得出發(fā)芽7 d時總硫苷含量較4 d顯著增加的結(jié)果相一致,但卻與韓宇等[30]的研究結(jié)果相反,推測可能與研究對象物種和品種不同有關(guān)。但考慮到并不是所有的硫苷都對人體有積極作用,例如PRO降解產(chǎn)物噁唑烷硫酮就會對人體產(chǎn)生一定的毒害作用[31],基于本研究結(jié)果選擇發(fā)芽6 d時的白菜芽苗菜更具有營養(yǎng)價值??偡邮侵参镏兄匾目寡趸镔|(zhì),對自由基具有一定的清除能力。本研究中4 mmol/L的ZnSO4溶液處理顯著提高了芽苗菜的總酚含量,這是由于4 mmol/L的ZnSO4溶液抑制芽苗菜生長從而促使總酚累積,相應(yīng)地DPPH自由基清除能力也顯著提高。相反,50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理會降低芽苗菜中總酚含量,導(dǎo)致DPPH自由基清除能力下降,此結(jié)果與田明[32]的研究結(jié)果相似。本研究可為培育富硒又具有較高含量活性物質(zhì)的十字花科蔬菜芽苗菜提供一定的參考。
本研究結(jié)果表明,4 mmol/L的ZnSO4溶液處理對白菜芽苗菜造成生長脅迫,單獨施用Na2SeO3溶液可增加芽長和芽苗菜單株平均質(zhì)量,而50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液聯(lián)合4 mmol/L的ZnSO4溶液處理可以有效緩解4 mmol/L的ZnSO4溶液對白菜芽苗菜生長發(fā)育的抑制作用。4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合50、100 μmol/L的Na2SeO3溶液處理后,白菜芽苗菜硒元素含量、總抗氧化能力及硫苷含量均有所提高,其中以4 mmol/L的ZnSO4溶液聯(lián)合50 μmol/L Na2SeO3溶液處理效果最好。大體上各組發(fā)芽6 d時的芽苗菜硒元素含量和總硫苷含量明顯高于發(fā)芽4 d時的芽苗菜。本研究結(jié)果可為具有高營養(yǎng)價值和保健功能芽苗菜的開發(fā)利用提供參考。