劉婷婷，韓 超，趙小玲，孔為民

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院 婦科腫瘤科，北京 100006

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，僅2020年全球就有新發(fā)病例60.4萬(wàn)例，死亡病例34.2萬(wàn)例[1]。與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，發(fā)展中國(guó)家宮頸癌的發(fā)病率及病死率均明顯增加，中國(guó)和印度的病例數(shù)占全世界總病例數(shù)的1/3[2]。早期宮頸癌以手術(shù)治療為主，中晚期宮頸癌以同步放化療為主[3]。然而，嚴(yán)重的放化療不良反應(yīng)及化療耐藥的出現(xiàn)常常導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和惡化，中晚期宮頸癌的5年生存率僅為40%～50%。尋找新的治療方案具有重要的臨床意義，也成為亟待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題。

二甲雙胍(metformin,Met)是治療2型糖尿病最常用的降糖藥物。2005年，Evans等[4]首次發(fā)現(xiàn)其可以降低糖尿病患者的腫瘤發(fā)病率。這一發(fā)現(xiàn)，使越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注到二甲雙胍在惡性腫瘤治療中的價(jià)值，它可以劑量依賴地抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，減少侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。然而，二甲雙胍對(duì)宮頸癌的作用如何尚存在爭(zhēng)議，對(duì)其作用機(jī)制的了解更為有限。因?qū)m頸癌中鱗狀細(xì)胞癌約占80%[6]，本研究選取宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa、CaSki為研究對(duì)象，分析二甲雙胍對(duì)宮頸鱗癌細(xì)胞增殖的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa和CaSKi(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；CCK-8檢測(cè)試劑盒、PI細(xì)胞周期試劑盒、annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗AMPK、p-AMPK、p70S6K、p-p70S6K、4E-BP1、p-4E-BP1單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)；二甲雙胍(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。選取處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞分為對(duì)照組和二甲雙胍組，濃度分別為0.01、0.1、1、5、10、15、25、35和50 mmol/L。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：不同濃度二甲雙胍干預(yù)后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)終止后于450 nm處測(cè)量各孔的吸光值(Avalue)，計(jì)算細(xì)胞增殖率及IC50值。二甲雙胍低濃度、中濃度及高濃度分別參考48 h的10%抑制濃度(IC10)、25%抑制濃度(IC25)及IC50，取臨近值的整數(shù)值作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)不同組采用的二甲雙胍濃度。

細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)孔A-空白孔A)/(對(duì)照孔A-空白孔A)×100%

1.2.3 PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期：消化后的細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞貼壁48 h后用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化，并收集細(xì)胞。細(xì)胞樣品中加入PI染色液，每管0.5 mL，充分混勻，37 ℃避光溫水浴30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光，波長(zhǎng)488 nm。通過(guò)專(zhuān)用軟件分析細(xì)胞DNA含量和光散射情況。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：消化后的細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞貼壁48 h后，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，將細(xì)胞充分混勻。加入10 μL PI染色液，充分混勻。培養(yǎng)10～20 min后放于冰水浴中，此過(guò)程注意避光。培養(yǎng)過(guò)程中，為改善染色的效果可以多次重懸細(xì)胞，一般2～3次。收集細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。取凋亡圖右上象限(早期凋亡率)+右下象限(晚期凋亡率)之和，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Wertern blot檢測(cè)AMPK-mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)：消化完成后將細(xì)胞及培養(yǎng)液移至離心管中，1 000 r/min離心10 min，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)不同的分組加入含不同濃度二甲雙胍的培養(yǎng)基，作用48 h。通過(guò)配膠、樣品裂解、上樣、電泳、轉(zhuǎn)移、染色和圖像分析等步驟，檢測(cè)不同處理組AMPK、p-AMPK、S6K、p-S6K、4E-BP1、p-4E-BP1蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)宮頸鱗癌細(xì)胞增殖能力影響

二甲雙胍對(duì)SiHa和CaSKi細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性(圖1，2)。SiHa細(xì)胞48 和72 h二甲雙胍IC50值分別為(50.95±2.63)和(21.39±5.23)mmol/L，CaSKi細(xì)胞48 和72 h二甲雙胍IC50值分別為(9.98±1.63)和(7.47±2.09)mmol/L。SiHa細(xì)胞低、中、高濃度組二甲雙胍濃度分別選擇2、10和50 mmol/L，CaSKi細(xì)胞分別為1、5和20 mmol/L。

*P<0.05，**P<0.01 compared with 0.01 mmol/L group圖1 二甲雙胍作用后SiHa細(xì)胞增殖曲線Fig 1 Proliferation curve of SiHa cells with metformin

*P<0.05，**P<0.01 compared with 0.01 mmol/L group圖2 二甲雙胍作用后CaSKi細(xì)胞增殖曲線Fig 2 Proliferation curve of CaSKi cells with metformin

2.2 二甲雙胍對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

隨著二甲雙胍濃度的增加，G2/M期細(xì)胞含量逐漸減少，S期細(xì)胞含量逐漸增加，細(xì)胞均阻滯于S期(圖3，4)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖3 SiHa細(xì)胞的細(xì)胞周期各時(shí)相比例Fig 3 Proportion of cell cycle in SiHa cells with metformin

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group 圖4 CaSKi細(xì)胞的細(xì)胞周期各時(shí)相比例Fig 4 Proportion of cell cycle in CaSKi cells

2.3 二甲雙胍對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

不同處理組的SiHa細(xì)胞和CaSKi細(xì)胞凋亡情況(圖5，6)。隨著二甲雙胍濃度的增加，SiHa和CaSKi細(xì)胞凋亡率逐漸增加(圖7，8)。

2.4 二甲雙胍對(duì)AMPK-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，二甲雙胍組p-AMPK表達(dá)量顯著增加，而p-S6K、p-4E-BP1表達(dá)量減少(圖9～12)。

3 討論

二甲雙胍的應(yīng)用雖然能降低某些惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)， 并能改善預(yù)后[7-8]， 但其在宮頸癌中的應(yīng)用效果卻存在爭(zhēng)議。臨床研究方面，有報(bào)道指出使用二甲雙胍可以提高宮頸癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期[9]，亦有學(xué)者認(rèn)為它的使用與宮頸癌患者的生存結(jié)局之間并沒(méi)有關(guān)聯(lián)[10]。體外研究方面，一些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)宮頸癌HeLa、HT-3和MS751細(xì)胞系無(wú)明顯抑制作用[11]，亦有人指出二甲雙胍對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以時(shí)間劑量依賴性地抑制宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa及CaSKi增殖。在相同濃度、相同作用時(shí)間下，CaSKi細(xì)胞系對(duì)二甲雙胍更為敏感。原因可能是CaSKi細(xì)胞系來(lái)源于宮頸癌小腸腸系膜轉(zhuǎn)移組織，具有完整的人乳頭瘤病毒 (human papilloma-virus，HPV)16基因組及HPV18相關(guān)序列，而SiHa細(xì)胞系來(lái)源于患者的原位組織樣品，其癌基因p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白上調(diào)，包含有整合的HPV16基因組[13]。細(xì)胞類(lèi)型的特異性和癌相關(guān)基因的突變可能導(dǎo)致了兩者對(duì)二甲雙胍敏感性不同，具體原因還需要進(jìn)一步研究論證。

圖5 不同處理組SiHa細(xì)胞的凋亡Fig 5 Apoptosis of SiHa cells in different groups

圖6 不同處理組CaSKi細(xì)胞的凋亡Fig 6 Apoptosis of CaSKi cells in different groups

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖7 不同處理組SiHa細(xì)胞的凋亡率Fig 7 Apoptosis rate of SiHa cells in different groups

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖8 不同處理組CaSKi細(xì)胞凋亡率Fig 8 Apoptosis rate of CaSKi cells in different groups

圖9 SiHa細(xì)胞不同處理組的AMPK-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig 9 Expressions of AMPK-mTOR signal pathway related proveins in different groups of SiHa cells

圖10 CaSKi細(xì)胞不同處理組的AMPK-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig 10 Expressions of AMPK-mTOR signal pathway related proveins in different groups of CaSKi cells

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖11 SiHa細(xì)胞不同處理組的AMPK-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig 11 Expressions of AMPK-mTOR signal pathway related proveins in different groups of SiHa cells

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖12 CaSKi細(xì)胞不同處理組的AMPK-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig 12 Expressions of AMPK-mTOR signal pathway related proveins in different groups of CaSKi cells

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和影響細(xì)胞周期分布是二甲雙胍抑制宮頸癌細(xì)胞增殖可能的機(jī)制[14]。有研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍將宮頸癌HeLa細(xì)胞阻滯于S和G2/M期[12]，也有學(xué)者指出，二甲雙胍將宮頸癌CaSKi細(xì)胞系阻滯于G2/M期，將HeLa細(xì)胞系阻滯于G0/G1期[13]。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能促進(jìn)宮頸鱗癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并呈現(xiàn)濃度依賴性，將宮頸癌SiHa及CaSKi細(xì)胞阻滯于S期。造成阻滯于細(xì)胞周期不同階段的原因可能與二甲雙胍濃度、作用時(shí)間以及細(xì)胞膜上決定二甲雙胍分布和吸收的有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因多樣性有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。二甲雙胍抑制腫瘤細(xì)胞增殖的另一個(gè)重要機(jī)制是激活A(yù)MPK-mTOR信號(hào)通路。mTOR mRNA及其蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)升高，這為二甲雙胍可能通過(guò)激活A(yù)MPK-mTOR信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖提供了理論依據(jù)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理組通過(guò)p-AMPK表達(dá)量增加，進(jìn)而抑制其下游蛋白S6K、4E-BP1的磷酸化。

綜上所述，二甲雙胍可以抑制宮頸鱗癌SiHa及CaSKi細(xì)胞系增殖，并且這種抑制作用呈現(xiàn)一定的時(shí)間劑量依賴性。二甲雙胍對(duì)宮頸鱗癌細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、將細(xì)胞周期阻滯于S期、激活A(yù)MPK-mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。