王 卉，蘇 憲，張贏贏，褚戰(zhàn)亞，孫朝暉，張金玲，張倩倩

石家莊市人民醫(yī)院 1.眼科； 2.門診部，河北 石家莊 050030

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是常見糖尿病并發(fā)癥，導(dǎo)致視力損害，DR發(fā)病的重要原因?yàn)橐暰W(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞不可逆凋亡[1]。研究顯示，氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等多種因素參與了DR病理生理過程，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)等炎性因子參與血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞炎性反應(yīng)和新血管生成，MAPK/NF-κB信號(hào)通路為炎性通路，在DR發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。異鼠李素(isorhamnetin,ISO)是從沙棘、銀杏等植物中提取的黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，研究顯示[3]，異鼠李素可通過抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，減輕高糖高脂誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷。本研究旨在觀察異鼠李素對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜病變的影響，從MAPK/NF-κB信號(hào)通路探究異鼠李素對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：SPF級(jí)SD雄性大鼠(8～9周齡)，體質(zhì)量180～220 g[中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0011]，飼養(yǎng)條件：溫度22～25 ℃，濕度45%～55%。

1.1.2 藥物和試劑：異鼠李素(純度≥98%，脈鉑醫(yī)藥科技有限公司)；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ,Sigma-Aldrich公司)；羥苯磺酸鈣(依比威藥品有限公司)；蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(索萊寶生物科技公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6和ELISA檢測(cè)試劑盒(Abcam公司)；兔抗鼠VEGF、Bax和caspase-3抗體(碧云天生物科技有限公司)；p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，腹腔內(nèi)注射STZ(60 mg/kg)進(jìn)行造模[4]，每天1次，連續(xù)給藥3 d，對(duì)照組(control組)注射等量的檸檬酸緩沖液，給藥3 d后，尾靜脈取血檢測(cè)大鼠空腹血糖，此后每周檢測(cè)1次，連續(xù)24周空腹血糖>16.7 mmol/L則為造模成功[5]。將大鼠分為對(duì)照組(control)、模型組(model)、異鼠李素低(ISO-L)組、高劑量(ISO-H)組(每日分別口服50、150 mg/kg異鼠李素)、陽性藥物(positive drug)組(每日口服150 mg/kg羥苯磺酸鈣)，model組與control組口服等量0.9%氯化鈉溶液，每天1次，連續(xù)給藥14 d。

1.2.2 HE染色檢測(cè)視網(wǎng)膜組織：將包埋視網(wǎng)膜的石蠟切成4 μm的切片，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，自來水沖洗，經(jīng)蘇木精初染5 min和伊紅復(fù)染4 min，顯微鏡觀察各組大鼠視網(wǎng)膜病理變化。

1.2.3 TUNEL染色檢測(cè)視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡：取各組大鼠視網(wǎng)膜組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，PBS洗滌2次，用蛋白酶K工作液處理15 min，按照TUNEL試劑盒說明進(jìn)行染色，顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)血清炎性因子水平：按照試劑盒說明書，對(duì)血清進(jìn)行稀釋，根據(jù)說明操作步驟檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織VEGF、Bax、caspase-3、p-p38MAPK、p38MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)：研磨視網(wǎng)膜組織后加入RIPA裂解液，離心提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入VEGF、Bax、caspase-3、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65一抗稀釋液，孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影液顯色。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算VEGF、Bax、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平，以p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65比值表示p38MAPK、NF-κB p65蛋白磷酸化水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 異鼠李素對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)的影響

Model組大鼠視網(wǎng)膜排列紊亂，分界不清，內(nèi)、外核層水腫，細(xì)胞數(shù)量減少，視網(wǎng)膜厚度變??；ISO-L組、ISO-H組、陽性藥物組大鼠視網(wǎng)膜組織各層界限較清晰，結(jié)構(gòu)稍顯疏松，視網(wǎng)膜厚度較model組增加(圖1)。

2.2 異鼠李素對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響

凋亡細(xì)胞呈紅色，model組較對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與model組比較，ISO-L組、ISO-H組、陽性藥物組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，且ISO-H組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率顯著低于ISO-L組(P<0.05)(圖2，3)。

2.3 異鼠李素對(duì)DR大鼠血清炎性因子的影響

model組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；與model組比較，ISO-L組、ISO-H組、陽性藥物組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)(圖4)。

2.4 異鼠李素對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，model組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與model組比較，ISO-L組、ISO-H組、陽性藥物組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(圖5，6)。

圖1 異鼠李素對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)的影響Fig 1 Effect of isorhamnetin on histopathological changes of rat retina

圖2 異鼠李素對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Effect of isorhamnetin on retinal cell apoptosis in DR rats

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率比較Fig 3 Compared of apoptosis rate of retinal cells in each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group圖4 各組大鼠血清炎性因子水平比較Fig 4 Compared of serum inflammatory factor levels in each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)Fig 5 Expression of VEGF, Bax and caspase-3 protein in retina of each group

2.5 異鼠李素對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜組織p38 MAPK、NF-κB p65磷酸化蛋白表達(dá)的影響

Model組DR大鼠視網(wǎng)膜組織p38 MAPK、NF-κB p65的磷酸化水平較control顯著升高(P<0.05)；與model組比較，ISO-L組、ISO-H組、陽性藥物組大鼠視網(wǎng)膜組織p38 MAPK、NF-κB p65的磷酸化水平顯著降低(P<0.05)(圖6)。

3 討論

DR是糖尿病常見微血管并發(fā)癥，主要損傷視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能，造成視力損傷甚至失明[6]。研究顯示，DR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與視網(wǎng)膜微血管病變、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等有關(guān)[7]。DR的損傷程度與VEGF密切相關(guān)，VEGF在視網(wǎng)膜新生血管形成中發(fā)揮重要作用[8]。本研究建立DR模型，結(jié)果表明DR大鼠中炎性反應(yīng)及視網(wǎng)膜VEGF和細(xì)胞凋亡水平升高，與以往報(bào)道[9]類似，提示造模成功。

異鼠李素具有抗炎、抗氧化的作用，具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用。研究顯示[10]，異鼠李素可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞活性氧產(chǎn)生和caspase-3活化，保護(hù)人RPE細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。另有研究顯示[11]，異鼠李素可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α、IL-1β等炎性因子的釋放，且與抑制NF-κB信號(hào)通路、阻斷TLR4通路、減少活性氧產(chǎn)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與model組比較，ISO-L組、ISO-H組大鼠視網(wǎng)膜組織各層界限較清晰，結(jié)構(gòu)稍顯疏松，視網(wǎng)膜厚度增加，視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率、血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平、VEGF、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低， 與口服陽性藥物羥苯磺酸鈣的作用類似，表明異鼠李素可改善DR大鼠視網(wǎng)膜組織損傷及細(xì)胞凋亡。

p38 MAPK信號(hào)通路與機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)密切相關(guān)；NF-κB是p38 MAPK的下游通路分子，p38 MAPK磷酸化后可激活NF-κB通路，并激活VEGF，調(diào)節(jié)新血管生成，加重組織損傷；抑制p38 MAPK信號(hào)通路，可保護(hù)DR大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷[12]。研究顯示，褪黑素可以通過抑制p38/NF-κB通路上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)來維持DR中血-視網(wǎng)膜屏障的完整性，從而減少炎性因子的產(chǎn)生[13]。本研究結(jié)果表明異鼠李素可能有抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路的作用，提示異鼠李素可能通過抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路而改善DR大鼠視網(wǎng)膜損傷及細(xì)胞凋亡。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group圖6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)Fig 6 The protein expressions of p-p38 MAPK, p38 MAPK, p-NF-κB p65 and NF-κB p65 in retina tissue of each group