周夢(mèng)杰，孫倩倩，于 洋

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005

近年來(lái)，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多未知的蛋白結(jié)構(gòu)域被預(yù)測(cè)出來(lái)。BEN結(jié)構(gòu)域[1]是2008年首次預(yù)測(cè)出的一個(gè)新的蛋白結(jié)構(gòu)域。在該結(jié)構(gòu)域被預(yù)測(cè)后不久，果蠅INSV蛋白的BEN結(jié)構(gòu)域被發(fā)現(xiàn)能夠直接與DNA結(jié)合，并抑制其結(jié)合基因的表達(dá)[2]。近年來(lái)對(duì)BEN-solo蛋白[3-5]和其他含有BEN結(jié)構(gòu)域的相關(guān)蛋白[6-11]的研究表明，該類蛋白具有抑制或隔離基因表達(dá)以及調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能，但是目前該類蛋白中許多成員的生物學(xué)功能及其發(fā)揮功能的分子機(jī)制尚未闡明。BEND6蛋白與INSV蛋白類似，因其只含有一個(gè)BEN結(jié)構(gòu)域而不含有其它可識(shí)別結(jié)構(gòu)域，又被叫做BEN-solo蛋白。小鼠的BEND6蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)，并且具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞在小鼠大腦皮層中向上遷移的功能[3]，但BEND6可能發(fā)揮的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究旨在通過(guò)對(duì)BEND6過(guò)表達(dá)的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并分析BEND6對(duì)其基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響，從而推測(cè)BEND6在小鼠發(fā)育中的潛在功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒：pCMV-mScarlet，pFRT-FH-BEND6(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，于洋實(shí)驗(yàn)室)。

1.1.2 小鼠神經(jīng)干細(xì)胞：取自P14小鼠(C57)側(cè)腦室周圍組織。實(shí)驗(yàn)小鼠來(lái)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院動(dòng)物中心。

1.1.3 試劑和試劑盒：NeuroCultTMProliferation Kit (Mouse & Rat)(Stem Cell公司)；PCR引物合成與質(zhì)粒測(cè)序(北京諾賽基因組研究中心有限公司)；Trizol(Thermo Fisher公司)； SYBR(YESEN公司)；全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(北京諾禾致源生物技術(shù)有限公司)；Poly-D-Lysine (PDL)和Laminin(Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine Stem Reagent(Invitrogen公司)；mCherry抗體(Abbkine公司)；熒光二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建：從pFRT-FH-BEND6質(zhì)粒中克隆BEND6片段并將其插入EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切的pCMV-mScarlet載體中。將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行克隆，用卡那霉素進(jìn)行篩選，測(cè)序確認(rèn)pCMV-mScarlet-BEND6質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。獲取BEND6片段的上游引物：5′-CGAGCTCAAGCT TCGAATTCTATGCAGAAGATCTTGCAGAC-3′,下游引物：5′- TATCTAGATCCGGTGGATCC TTTTAAGAT ACCATCCTGAGAGTTC-3′。

1.2.2 小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)的獲取與培養(yǎng)：參照NeuroCultTMProliferation Kit中描述的方法。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光染色驗(yàn)證蛋白表達(dá)：將pCMV-mScarlet和pCMV-mScarlet-BEND6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中，24 h后使用4% PFA溶液將細(xì)胞固定，然后依次用mCherry抗體和熒光二抗進(jìn)行孵育，封片后在萊卡倒置顯微鏡下成像。

1.2.4 RNA樣品的制備：分別收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞于1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol吹打混勻，室溫靜置10 min，然后加入200 μL氯仿充分混勻后于4 ℃離心10 min。吸取上層液體于新的RNase-free的1.5 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置5 min后4 ℃離心10 min。棄上清，用700 μL 75%乙醇清洗RNA沉淀2次，用適量RNAase-free的水溶解室溫干燥的RNA沉淀。

1.2.5 q-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因轉(zhuǎn)錄水平：反轉(zhuǎn)錄對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的RNA得到相應(yīng)的cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行q-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分別檢測(cè)兩組細(xì)胞中目標(biāo)基因的Ct值，反應(yīng)體系為20 μL，每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，內(nèi)參基因?yàn)閙18srRNA，采用2-△△Ct法得到兩組細(xì)胞中目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 測(cè)序數(shù)據(jù)分析：使用HISAT2軟件對(duì)質(zhì)控后的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，然后通過(guò)基因表達(dá)定量分析獲得實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本的基因表達(dá)矩陣。采用DESeq2軟件獲得實(shí)驗(yàn)組中有差異表達(dá)的基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行生物功能富集分析。差異表達(dá)基因的篩選條件為P≤0.05, |log2fold change|≥1。

表1 q-PCR引物序列Table 1 Sequences of q-PCR primers

2 結(jié)果

2.1 小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的獲取

成功獲得小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(圖1B)，并將其在細(xì)胞培養(yǎng)板中貼壁培養(yǎng)(圖1A)。

2.2 在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)mScarlet和mScarlet-BEND6

分別將pCMV-mScarlet和pCMV-mScarlet-BEND6質(zhì)粒(圖1C)轉(zhuǎn)染到貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中(圖1A)。轉(zhuǎn)染24 h后，mScarlet在兩組細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平相差不大(圖2C)，而BEND6在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于在對(duì)照組中的表達(dá)(圖2D)。此外，mScarlet在神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)(圖2A)，而mScarlet-BEND6僅在細(xì)胞核中有明顯表達(dá)(圖2B)。

2.3 BEND6過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的影響

與過(guò)表達(dá)mScarlet的神經(jīng)干細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)mScarlet-BEND6的細(xì)胞中共有165個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了變化。其中上調(diào)的基因有102個(gè)，如Mx1、Mx2、Socs1、Map1b、Kcnq3、Ppp1r13l、Stmn4、Cd274、Tgtp1等；下調(diào)的基因有63個(gè)，如Timp1、Cd68、Otx2、Casp12、Fn1、Gxylt2、Cryab、Acta2等(圖3A,B)。

2.4 差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能富集分析

在過(guò)表達(dá)mScarlet-BEND6的神經(jīng)干細(xì)胞中篩選出的差異表達(dá)基因主要與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，生物代謝過(guò)程、免疫過(guò)程、細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)過(guò)程及種間互相作用等多種生物學(xué)過(guò)程相關(guān)(圖4A)。這些生物學(xué)過(guò)程主要包括膜電位的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)干擾素-的反應(yīng)、肽基絲氨酸磷酸化的正調(diào)控、炎性反應(yīng)、內(nèi)肽酶活性的調(diào)節(jié)、化學(xué)突觸傳遞、多巴胺能神經(jīng)發(fā)生、正向調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化、2型免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程的調(diào)節(jié)、胰島素受體信號(hào)通路的調(diào)控、微管聚合或解聚的調(diào)節(jié)等(圖4B)。

A.flow chart of culture and transfection of mouse neural stem cells; B.neural stem cells in suspension culture(×100);C.schematic of mScarlet and mScarlet-BEND6 proteins

A.mScarlet was expressed in the nucleus and cytoplasm of mouse neural stem cells; B.mScarlet-BEND6 was restricted in the nucleus of mouse neural stem cells; C.there was no significant difference in the expression of mScarlet between control and experimental group; D.the expression of mScarlet-BEND6 in the experimental group was significantly higher than that in the control group;*P<0.001 compared with mScarlet

A.the volcano plot showing differentially expressed genes upon BEND6 overexpression; B.heatmap showing differentially expressed genes regulated by BEND6

A.funcitonal annotation of differentially expressed genes upon BEND6 over-expression; B.biological relationship between the enriched terms

3 討論

在本研究中，與過(guò)表達(dá)mScarlet的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)mScarlet-BEND6的細(xì)胞中有165個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化。這些差異表達(dá)基因與神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和多種生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)mScarlet-BEND6的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中S100a6基因下調(diào)，該蛋白可能是成年小鼠海馬體亞顆粒區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的新型標(biāo)志物[12]。有趣的是，實(shí)驗(yàn)組中Fn1基因的轉(zhuǎn)錄水平也呈現(xiàn)下調(diào)，該基因參與軸突延伸的正向調(diào)節(jié)，而對(duì)神經(jīng)分化有負(fù)向調(diào)節(jié)作用的Zfp536基因的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了上調(diào)。此外，與調(diào)節(jié)微管聚合和神經(jīng)元投射發(fā)展相關(guān)的Slc39a12基因呈現(xiàn)下調(diào)，而同樣參與調(diào)節(jié)微管聚合或解聚及神經(jīng)元投射發(fā)育的Stmn4基因確呈現(xiàn)上調(diào)。這表明，小鼠神經(jīng)元的成熟和軸突形成是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，BEND6在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元發(fā)育的過(guò)程中可能并不是起到單向促進(jìn)作用，而是促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)入某個(gè)神經(jīng)元分化成熟過(guò)程中的特殊狀態(tài)。值得注意的是，差異表達(dá)基因中下調(diào)的Prrx2具有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，上調(diào)的Zfp57具有結(jié)合染色質(zhì)和雙鏈甲基化DNA的活性。這提示BEND6在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他具有轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)節(jié)神經(jīng)分化過(guò)程。

BEND6過(guò)表達(dá)除了對(duì)神經(jīng)分化調(diào)節(jié)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響，也導(dǎo)致很多參與其他生物學(xué)過(guò)程的基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化。例如與突觸膜電位調(diào)節(jié)及神經(jīng)遞質(zhì)分泌相關(guān)的基因中Kcnc4、Gabra4呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄下調(diào)，Kcnq3和Insyn2a基因呈現(xiàn)上調(diào)；下調(diào)的Timp1、Cd68、Il33、Cryab基因和上調(diào)的Tgtp1、Gbp5、Cd274、Gpr17、Mx2、Mx1基因主要與免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)和傷口愈合等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。

本研究通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)BEND6的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析發(fā)現(xiàn)，BEND6過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致參與神經(jīng)分化和多種生物學(xué)過(guò)程的基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，為BEND6生物學(xué)功能的探究提供方向。但BEND6具體的生物學(xué)功能及其發(fā)揮作用的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究去探索。