高 震，侯瑞凱，宋索成，4，阮建平

鈣是人體的必需元素之一。牙釉質(zhì)中，由鈣離子組成的納米磷酸鈣含量高達(dá)90%[1]。鈣離子不但可以作為第二信使調(diào)控細(xì)胞的正常功能，而且是釉質(zhì)基質(zhì)能夠健康形成及礦化的保證。

鈣離子可以促進(jìn)成釉細(xì)胞的分化，減輕成釉細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的影響，可以很好地介導(dǎo)成釉細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持[2]。目前有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)鈉鈣交換體廣泛分布于細(xì)胞中，其雙向轉(zhuǎn)運(yùn)作用可使細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子快速精準(zhǔn)調(diào)控，從而保證細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[3]。李玲等[4]發(fā)現(xiàn)，成釉細(xì)胞中的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)是釉質(zhì)形成不可或缺的條件，同樣細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)定和礦化前沿鈣離子的供應(yīng)也離不開鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，人體鈣攝入不足是導(dǎo)致釉質(zhì)發(fā)育異常的重要原因之一，同時(shí)動物實(shí)驗(yàn)證明，血漿中長期的高濃度鈣可以減輕大鼠氟中毒的表現(xiàn)，低鈣攝入可導(dǎo)致大鼠的釉質(zhì)礦化顯著降低并導(dǎo)致氟中毒的進(jìn)一步加重[5-6]。殷黎靜等[7]發(fā)現(xiàn)，對于慢性氟中毒的大鼠，加鈣拮抗組與對照組相比，大鼠的體重增長速度明顯加快，中毒癥狀明顯改善。Al-Ansari等[8-9]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)增加局部鈣離子的質(zhì)量濃度后，成釉細(xì)胞的功能發(fā)生了改善，同時(shí)可見鈣離子促進(jìn)了氟化基質(zhì)的礦化。此外Wu等[10]研究發(fā)現(xiàn)納米級的磷酸鈣對革蘭氏陽性菌可發(fā)揮有效抗菌作用，在pH>5.5的環(huán)境下，隨pH的上升，鈣離子可作為再礦化劑促進(jìn)已發(fā)生脫礦的牙釉質(zhì)再礦化[11]。然而，目前的大多數(shù)研究側(cè)重于鈣離子介導(dǎo)的理化改變對氟牙癥的影響，但關(guān)于鈣對成釉細(xì)胞分子生物學(xué)影響的研究鮮有報(bào)道，補(bǔ)鈣對成釉細(xì)胞的安全性還有待研究。

本研究擬通過改變鈣濃度來培養(yǎng)成釉細(xì)胞系A(chǔ)LC細(xì)胞，觀察鈣對成釉細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡及細(xì)胞周期蛋白變化的影響，對未來進(jìn)一步探究鈣對拮抗氟牙癥的作用有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用的成釉細(xì)胞樣細(xì)胞系A(chǔ)LC細(xì)胞由西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院黃瑞哲教授課題組惠贈。其他實(shí)驗(yàn)用品如下：液氮罐(IKA，德國)，電子天平(Thermo Fisher Scientific，美國)，DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗(青霉素、鏈霉素)、胰蛋白酶(Hyclone，美國)，細(xì)胞培養(yǎng)皿、6孔板/96孔板、離心管(Corning，美國)，微量加液器(Haier，中國)，MDF-1156超低溫冰箱(Sanyo，日本)，熒光倒置顯微鏡(Nikon，日本)，流式細(xì)胞儀(BD，中國)，半干轉(zhuǎn)印槽、垂直電泳槽(Bio-Rad，美國)，水平電泳槽(北京六一儀器廠，中國)，分析純NaF、分析純CaCl2(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，中國)，CCK-8(Biosharp生物科技有限公司，中國)，胎牛血清(Gibco， 美國)，PBS、無水乙醇(Heart，中國)，碘化丙啶PI、Hoechst33342(Sigma，中國)，兔抗兔Cyclin A多克隆抗體、兔抗兔Cyclin B多克隆抗體、兔抗兔Cyclin D多克隆抗體(CST，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在維生素D3、甲狀旁腺激素、降鈣素、雌激素與睪酮等數(shù)種激素的聯(lián)合調(diào)節(jié)作用下，人體內(nèi)的血鈣水平恒定地維持在約2.50 mmol/L(2.25～2.75 mmol/L)[12-14]。故本研究選擇的鈣濃度分別為0、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L。

ALC細(xì)胞系是由Akira Nakata從新生小鼠牙胚中分離培養(yǎng)建立的成釉細(xì)胞系，調(diào)節(jié)成釉細(xì)胞特異性基因釉原蛋白、釉叢蛋白、釉蛋白的表達(dá)，用于體外研究成釉上皮細(xì)胞的分化和功能[15-16]。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

配制成釉細(xì)胞培養(yǎng)基(50 mL含10% FBS的高糖培養(yǎng)基)：44 mL培養(yǎng)基中加入5 mL胎牛血清及1 mL雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)，-20 ℃保存。氯化鈣藥品：分別稱取0.022 0 g、0.027 5 g、0.033 0 g、0.038 5 g的無水氯化鈣，在超凈臺中分別加入10 mL已配制好的培養(yǎng)基中，得到濃度分別為2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L的CaCl2藥品，-20 ℃保存。

細(xì)胞復(fù)蘇：37 ℃水浴復(fù)蘇液氮凍存細(xì)胞，在超凈臺中將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的離心管，10 mL含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基稀釋凍存細(xì)胞中的DMSO，吹打混勻，按大約1×108個(gè)/L的密度接種細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：顯微鏡下判斷是否進(jìn)行下一步傳代培養(yǎng)，確定需要傳代后在超凈臺中吸棄培養(yǎng)液，加入胰酶，待細(xì)胞呈點(diǎn)狀后終止消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的離心管，離心棄上清液，重新加入培養(yǎng)基，均分至3個(gè)新的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)。如此細(xì)胞至少傳3代，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，分別用不同濃度鈣離子培養(yǎng)基分別處理培養(yǎng)24和48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并在標(biāo)記好的培養(yǎng)皿的固定位置拍照記錄。

1.2.2 鈣對ALC細(xì)胞生長周期的影響

1.2.2.1 CCK-8檢測細(xì)胞生存率 在96孔板中分別接種ALC細(xì)胞，接種的密度為每孔1.0×103～1.5×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后吸出原培養(yǎng)基，在各個(gè)孔中加入含不同濃度鈣離子的培養(yǎng)液100 μL(0、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L)分別培養(yǎng)ALC細(xì)胞24和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，輕微振蕩混勻后把培養(yǎng)板放培養(yǎng)箱內(nèi)4 h后取出，放入酶標(biāo)儀測定每孔的OD值。

1.2.2.2 Hoechst33342染色 將成釉細(xì)胞消化后分別接種于六孔板中，細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，吸棄培養(yǎng)基加入含有不同藥物濃度鈣離子的新培養(yǎng)基每孔2 mL后放入37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在24和48 h時(shí)吸棄培養(yǎng)基，加入濃度為10 μg/L的熒光染料1 mL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光染色，吸棄染料用4%多聚甲醛固定，15 min后吸棄固定液，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2.3 ALC細(xì)胞周期的檢測 將本實(shí)驗(yàn)ALC成釉細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)并用相應(yīng)濃度的鈣離子處理24 h和48 h后，消化離心并重懸于1 mL固定液(0.2 mL PBS+0.8 mL 70%乙醇)，振蕩混勻后封口膜封口4 ℃過夜。使用流式細(xì)胞儀檢測前1 000 r/min離心10 min后棄乙醇上清并用預(yù)冷PBS洗兩次后加入200 μL PBS將細(xì)胞吹散，加20 μL RNA酶(50 μg/mL)和20 μL PI染料(50 μg/mL)混合后室溫避光染色30 min后離心并棄上清液，加200 μL PBS重懸，經(jīng)過濾后流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞的DNA含量變化，記錄細(xì)胞周期各時(shí)相的比例。

1.2.2.4 細(xì)胞周期蛋白的檢測 (1)細(xì)胞蛋白提?。篈LC細(xì)胞處理培養(yǎng)24和48 h時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)所需的蛋白提取。首先吸棄培養(yǎng)基，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，向6孔板每孔加200 μL RIPA全蛋白裂解液后將六孔板置于冰上并輕輕轉(zhuǎn)動，直至細(xì)胞裂解。將裂解物移入1.5 mL的EP管，置于冰上裂解至少10 min，反復(fù)振蕩，加速細(xì)胞裂解。低溫離心機(jī)13 000 r/min下離心25 min。根據(jù)液體體積加入稀釋后的Loading-Buffer。最后將蛋白在100 ℃的金屬加熱器中煮15 min使其變性后在-80 ℃冰箱保存。(2)蛋白加樣電泳：用微量上樣器上完樣品和蛋白Marker后，恒壓80 V持續(xù)電泳。(3)轉(zhuǎn)膜：根據(jù)Marker指示，當(dāng)判斷出現(xiàn)所需要的目標(biāo)條帶后停止電泳跑膠。隨后取出凝膠，去掉不需要的分離膠部分，然后制作濾紙-膜-膠-濾紙的類似“三明治”轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)，用玻璃棒趕盡氣泡。恒流80 mA，半干轉(zhuǎn)膜1.5 h，轉(zhuǎn)膜完成后用濃度5%牛奶封閉2 h。(4)抗體的孵育及顯色：由實(shí)驗(yàn)所需目的蛋白的分子質(zhì)量及Marker來切膜。將膜放入抗體孵育盒后加入各蛋白相應(yīng)的抗體(一抗1∶500稀釋)即抗兔Cyclin A多克隆抗體、抗兔Cyclin B多克隆抗體、抗兔Cyclin D多克隆抗體、抗鼠GAPDH抗體，4 ℃緩慢搖動孵育過夜。次日TBST洗膜3次，每次15 min，根據(jù)不同種屬的一抗加入相對應(yīng)二抗，室溫條件下在搖床緩慢搖動孵育1.5 h。然后TBST洗膜3次，每次10 min。最后用濾紙吸干PVDF膜上殘余的TBST，然后將膜放入ECL顯色液中顯色，并用化學(xué)發(fā)光顯色儀(天能，中國上海)檢測蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件，方差分析，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度鈣離子干預(yù)下的細(xì)胞形態(tài)變化

利用倒置顯微鏡下分別觀察24和48 h后發(fā)現(xiàn)0 mmol/L CaCl2組ALC細(xì)胞形態(tài)呈卵圓或多邊形，細(xì)胞間連接緊密呈鋪路石樣生長(圖1a、f)。隨著時(shí)間增加，細(xì)胞密度增加，細(xì)胞相互交織，當(dāng)細(xì)胞相互接觸后形態(tài)稍變圓。加藥24和48 h在倒置顯微鏡下觀察，各實(shí)驗(yàn)組ALC細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變(圖1b、c、d、e、g、h、i、j)。24和48 h組相比較，48 h組細(xì)胞數(shù)目增加，但細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，半定量光譜分析后，各實(shí)驗(yàn)組間的變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1～2)。

a：0 mmol/L CaCl2；b：2.0 mmol/L CaCl2；c：2.5 mmol/L CaCl2；d：3.0 mmol/L CaCl2；e：3.5 mmol/L CaCl2；f：0 mmol/L CaCl2；g：2.0 mmol/L CaCl2；h：2.5 mmol/L CaCl2；i：3.0 mmol/L CaCl2；j：3.5 mmol/L CaCl2

2.2 CCK-8結(jié)果

鈣分別干預(yù)ALC細(xì)胞24 h和48 h后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組ALC細(xì)胞的生存率略呈下降趨勢，但此趨勢無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

2.3 Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡

在熒光顯微鏡下觀察，已發(fā)生凋亡的細(xì)胞由于染料進(jìn)入了細(xì)胞核，與DNA相結(jié)合被染為藍(lán)綠色，在熒光下這種藍(lán)綠色呈明顯高亮狀態(tài)。觀察熒光染色發(fā)現(xiàn)，ALC細(xì)胞加鈣分別干預(yù)24 h和48 h后，半定量光譜分析發(fā)現(xiàn)，與對照組(圖4a、f)相比，干預(yù)24 h實(shí)驗(yàn)組(圖4b、c、d、e、g、h、i、j)各組間ALC細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞差異有顯著性，干預(yù)48 h，除2.0 mmol/L組，其余各組無顯著性差異(圖5)。

與0 mmol/L Ca2+濃度相比， ns：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

a：0 mmol/L CaCl2；b：2.0 mmol/L CaCl2；c：2.5 mmol/L CaCl2；d：3.0 mmol/L CaCl2；e：3.5 mmol/L CaCl2；f：0 mmol/L CaCl2；g：2.0 mmol/L CaCl2；h：2.5 mmol/L CaCl2；i：3.0 mmol/L CaCl2；j：3.5 mmol/L CaCl2；箭頭：凋亡細(xì)胞

與0 mmol/L Ca2+濃度相比，*：P<0.01， ns：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.4 細(xì)胞周期的檢測分析

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：鈣離子分別干預(yù)ALC細(xì)胞24 h和48 h后，隨著鈣濃度的增加，S期的細(xì)胞比例增加，G1期，G2期的細(xì)胞比例有所下降(圖6～7)。

a：0 mmol/L CaCl2；b：2.0 mmol/L CaCl2；c：2.5 mmol/L CaCl2；d：3.0 mmol/L CaCl2；e：3.5 mmol/L CaCl2；f：定量分析；與0 mmol/L Ca2+濃度相比，*：P<0.01， **：P<0.001， ***：P<0.000 1， ns：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

a：0 mmol/L CaCl2；b：2.0 mmol/L CaCl2；c：2.5 mmol/L CaCl2；d：3.0 mmol/L CaCl2；e：3.5 mmol/L CaCl2；f：定量分析；與0 mmol/L Ca2+濃度相比，*：P<0.01， **：P<0.001，ns：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.5 與細(xì)胞生長周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

本研究Western blot檢測加鈣干預(yù)ALC細(xì)胞24 h和48 h后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期蛋白Cyclin A與Cyclin B表達(dá)下調(diào)，Cyclin D的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)(圖8～9)。

與0 mmol/L Ca2+濃度相比，*：P<0.01， **：P<0.001， ***：P<0.000 1， ns：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討 論

ALC細(xì)胞在不同的鈣離子濃度分別干預(yù)24和48 h后，細(xì)胞增殖未受明顯影響，細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化。不同濃度的鈣離子組間細(xì)胞生長速度及細(xì)胞形態(tài)肉眼未見明顯的差異，表明本實(shí)驗(yàn)所選的鈣離子濃度對ALC細(xì)胞的增殖及形態(tài)無明顯影響?；诖耍瑸橄乱徊降膶?shí)驗(yàn)繼續(xù)使用該實(shí)驗(yàn)組鈣離子濃度提供了基礎(chǔ)。

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著鈣離子濃度的升高和作用時(shí)間的增長，ALC細(xì)胞的生存率略呈下降趨勢，但下降趨勢微弱，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Chen等[17]對原代人成釉細(xì)胞進(jìn)行鈣干預(yù)，發(fā)現(xiàn)鈣濃度從0.05 mmol/L增加到0.30 mmol/L時(shí)細(xì)胞的排列和細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化。本研究中細(xì)胞形態(tài)和排列未見明顯改變，這可能是由于Chen所研究的是人的原代成釉細(xì)胞，而本研究應(yīng)用的是永生化的成釉細(xì)胞，永生化細(xì)胞對環(huán)境變化耐受更高所致。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖較多時(shí)可見死細(xì)胞數(shù)略增加，這符合細(xì)胞凋亡的一般規(guī)律。

通過熒光染色凋亡細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著鈣離子對ALC成釉細(xì)胞作用時(shí)間的延長以及鈣離子的濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡略呈增加。這與前期的CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。說明隨著鈣離子濃度的升高，鈣離子可能對成釉細(xì)胞有一定的促凋亡作用，但鈣對成釉細(xì)胞促凋亡的檢測罕見文獻(xiàn)報(bào)道。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞凋亡趨勢微弱，無明確實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明鈣離子對成釉細(xì)胞有促凋亡作用，下一步動物實(shí)驗(yàn)可繼續(xù)驗(yàn)證鈣離子是否在機(jī)體內(nèi)會發(fā)生成釉細(xì)胞的促凋亡作用。

與0 mmol/L Ca2+濃度相比，*：P<0.01，**：P<0.001，***：P<0.000 1，ns：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期可見，隨著實(shí)驗(yàn)組鈣離子的濃度升高和鈣離子作用時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的S期增加，可見鈣離子能夠促進(jìn)細(xì)胞的DNA合成增加，但同時(shí)細(xì)胞G1、G2期下降，反饋細(xì)胞的RNA及蛋白質(zhì)減少，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示由于鈣離子的作用可將成釉細(xì)胞阻滯在S期，進(jìn)入G2期的細(xì)胞減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)鈣離子干擾了成釉細(xì)胞的細(xì)胞生長周期。

Cyclin家族存在于細(xì)胞周期的各時(shí)相，Cyclin家族與CDK家族共同促進(jìn)細(xì)胞周期的完成。在Cyclin家族中最常見的蛋白有Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D[18-20]。Cyclin A為細(xì)胞周期的正調(diào)控因子，它與CDK2結(jié)合可形成活性激酶復(fù)合物，釋放出轉(zhuǎn)錄因子，促使細(xì)胞由S期進(jìn)入到G2期。本研究中Western blot結(jié)果顯示鈣干預(yù)組較對照組Cyclin A蛋白表達(dá)下調(diào)，提示細(xì)胞增殖時(shí)由S期進(jìn)入G2期受阻，這與流式檢測細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。Cyclin B在從G2期進(jìn)入到M期的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用，在本研究中鈣干預(yù)組中細(xì)胞周期蛋白Cyclin B表達(dá)下調(diào)，提示由G2期進(jìn)入M期的細(xì)胞減少，細(xì)胞分裂受影響。Cyclin D蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，使細(xì)胞周期通過G1期進(jìn)入S期，本實(shí)驗(yàn)鈣干預(yù)組中Cyclin D的表達(dá)上調(diào)，提示由G1期進(jìn)入S期的成釉細(xì)胞增加。

目前鈣對氟牙癥的拮抗作用成為新的研究熱點(diǎn)，但是關(guān)于鈣對成釉細(xì)胞的干預(yù)方式以及鈣是通過何種方式預(yù)防氟牙癥的發(fā)生目前尚不完全清楚。研究證明，本實(shí)驗(yàn)所選取的鈣離子濃度對成釉細(xì)胞的增殖及凋亡未見明顯改變，提示鈣對成釉細(xì)胞無明顯毒副作用，對鈣拮抗氟牙癥提供了安全性保證。同時(shí)鈣對成釉細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生影響，提示鈣可能干擾了成釉細(xì)胞的分化，這為進(jìn)一步研究鈣對氟牙癥的拮抗提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。