王 彤，楊國(guó)穎，趙凱紅，邢 燁，田 勃

(唐山市婦幼保健院新生兒科，河北 唐山 063000)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)主要因圍產(chǎn)期窒息所致，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，既往研究指出其可能與炎性細(xì)胞因子有關(guān)，同時(shí)氧自由基增加、脂質(zhì)過(guò)氧化等可能共同參與了HIE進(jìn)展，能誘發(fā)腦水腫、神經(jīng)元壞死等病理改變，促進(jìn)神經(jīng)纖維性質(zhì)改變[1]。HIE癥狀包括抽搐、意識(shí)狀態(tài)改變、原始反射異常等，患兒死亡率較高，預(yù)后欠佳，部分患兒還會(huì)出現(xiàn)不同程度的后遺癥，例如智力低下、癲癇、腦癱等[2]。因此，臨床需進(jìn)一步探究HIE的發(fā)生與進(jìn)展機(jī)制，以期為該病治療提供依據(jù)。

目前，有學(xué)者指出微小分子核糖核酸(microRNA，miR)與多臟器損傷有關(guān)，當(dāng)臟器處于缺氧、缺血狀態(tài)時(shí)能促進(jìn)炎癥因子分泌，將特定信號(hào)路徑激活，上調(diào)相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞壞死，miR可能參與了相關(guān)基因的調(diào)控過(guò)程[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-384-5p(從miR-384前體的5′端臂加工而成)表達(dá)與大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，在大鼠皮質(zhì)受損后可見(jiàn)miR-384-5p表達(dá)下調(diào)[4]，提示miR-384可能在腦神經(jīng)病變中有調(diào)節(jié)作用。另有研究認(rèn)為miR-384表達(dá)下調(diào)可能通過(guò)敲除環(huán)狀RNA染色質(zhì)重塑因子(Circular RNA bromodomain PHD finger transcription factor，circBPTF)對(duì)機(jī)體炎癥免疫進(jìn)行調(diào)節(jié)，使高糖誘導(dǎo)的免疫炎癥紊亂改善，緩解應(yīng)激反應(yīng)[5]。而炎癥與HIE進(jìn)展密切相關(guān)，當(dāng)腦中樞組織受到損害時(shí)，可引起固有免疫系統(tǒng)受損，致大量炎癥介質(zhì)釋放，加重HIE患兒的腦組織損害[6]，但目前針對(duì)miR-384是否通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥免疫影響HIE患兒的病情尚無(wú)定論。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示HIE與免疫功能異常有關(guān)，窒息缺氧能引起T細(xì)胞亞群異常，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡加速及輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(helper T cell 17/regulatory T cell，Th17/Treg)失衡，誘發(fā)免疫功能紊亂，提示Th17/Treg失衡可能在HIE中發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用[7]。而目前尚不明確miR-384與Th17/Treg平衡及HIE之間的關(guān)系，基于此，本次研究納入106例HIE新生兒進(jìn)行研究，分析其miR-384表達(dá)水平與炎癥反應(yīng)、Th17/Treg失衡、神經(jīng)行為的相關(guān)性，以期為HIE臨床治療提供思路，報(bào)道如下。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選擇2015年10月至2020年10月唐山市婦幼保健院收治的106例HIE患兒為HIE組，另選取同期同院產(chǎn)科分娩的90例健康新生兒為對(duì)照組。HIE診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《新生兒缺氧缺血性腦病.第2版》[8]：①孕婦既往有可能引起胎兒宮內(nèi)窘迫的產(chǎn)科病史，且伴有胎兒宮內(nèi)窘迫癥狀(例如羊水Ⅲ度污染，胎心<100次/min，且持續(xù)時(shí)間≥5min)或者在分娩過(guò)程中有明顯窒息史；②出生時(shí)存在重度窒息，即1min Apgar評(píng)分≤3分，延續(xù)至5min Apgar評(píng)分仍≤5分，或者臍動(dòng)脈血?dú)釶H≤7.00；③新生兒出生后發(fā)生意識(shí)改變、原始反射異常、肌張力改變等神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)，持續(xù)時(shí)間>24h；④排除其他原因(如產(chǎn)傷、顱內(nèi)出血等)所致的抽搐及宮內(nèi)感染、遺傳代謝性疾病和其他先天性疾病所引起的腦損傷，滿足上述4條則可確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HIE組：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；未見(jiàn)先天遺傳性疾病者；胎齡37～42周者；患兒監(jiān)護(hù)人對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意。②對(duì)照組：同期于我院產(chǎn)科分娩的健康新生兒；胎齡37～42周者；孕婦孕期健康；Apgar評(píng)分為8～10分者；患兒監(jiān)護(hù)人對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：因遺傳代謝性疾病或其他先天疾病所致的腦損傷者；先天畸形者；顱內(nèi)出血者；孕婦有妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓等合并癥；機(jī)體嚴(yán)重感染者；腦結(jié)構(gòu)發(fā)育異常者。研究方案獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1炎癥因子、Treg、Th17及其他細(xì)胞因子檢測(cè)

兩組新生兒采集4mL外周血，分裝于兩管。其中一管血樣離心10min，轉(zhuǎn)速3 000r/min，分離血清，存至-70℃環(huán)境待測(cè)。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清白介素-6(interleukin-6，IL-6)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，經(jīng)霍爾德HED-SY96S自動(dòng)酶標(biāo)儀(山東霍爾德電子科技有限公司)測(cè)定；另一管血樣加入抗凝劑，存至-70℃環(huán)境待測(cè)，經(jīng)貝克曼庫(kù)爾特DxFLEX流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)測(cè)定Treg、Th17水平，計(jì)算Th17/Treg值。

1.2.2血清miR-384檢測(cè)

另取2mL外周血，離心方式同上，取血清存至-70℃環(huán)境待測(cè)。經(jīng)實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)miR-384。主要試劑為總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、qPCR試劑、異丙醇、氯仿，均由賽默飛世爾科技公司提供。主要儀器為T(mén)G-16W高速離心機(jī)[愛(ài)來(lái)寶(濟(jì)南)醫(yī)療科技有限公司]、KS48+型PCR擴(kuò)增儀[冠森生物科技(上海)有限公司]、F3微量移液器(賽默飛世爾科技公司)。具體如下：嚴(yán)格根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，待提取完畢，取RNA液體2μL測(cè)定純度，分析A260/A280值，若二者比值在1.6～1.9之間，則提示純度滿足檢測(cè)要求。針對(duì)總RNA液體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使其合成cDNA，將cDNA產(chǎn)物冷卻，并行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30s；95℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。引物序列為①miR-384：上游5′-GCCGAGATTCCTAGAAATTG-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；②內(nèi)參引物U6：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。利用2-△△CT表示miR-384表達(dá)水平，取3次試驗(yàn)均值為最終結(jié)果。

1.3 HIE分組與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)HIE分度標(biāo)準(zhǔn)將患兒分成輕度組(n=37)、中度組(n=44)、重度組(n=25)。HIE分度標(biāo)準(zhǔn)[8]①輕度：意識(shí)處于興奮與抑制交替的狀態(tài)，肌張力稍微增高或者正常，擁抱反射良好，吸吮反射正常，可能伴有肌陣痙攣，未見(jiàn)中樞性呼吸衰竭，瞳孔擴(kuò)大或正常；②中度：嗜睡，肌張力有所下降，擁抱、吸吮反射減弱，常有驚厥，伴有中樞性呼吸衰竭，瞳孔?？s小；③重度：昏迷，肌張力松軟，擁抱、吸吮反射消失，持續(xù)驚厥，伴明顯中樞性呼吸衰竭，瞳孔擴(kuò)大，對(duì)光反射延遲。

新生兒神經(jīng)行為量表(neonatal behavioral neurological assessment，NBNA)評(píng)分[9]：包括原始反射(3項(xiàng))、行為能力(6項(xiàng))、一般反應(yīng)(3項(xiàng))、主動(dòng)肌張力(4項(xiàng))與被動(dòng)肌張力(4項(xiàng))5個(gè)維度，共20個(gè)條目，每項(xiàng)計(jì)0～2分，總分范圍為0～40分，總分35分以下提示神經(jīng)功能異常，分值越高表明神經(jīng)功能越好。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組基線資料比較

兩組性別、胎齡、新生兒出生體重及分娩方式比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組基線資料比較

2.2兩組血清miR-384、炎癥因子及NBNA評(píng)分比較

HIE組血清miR-384水平及NBNA評(píng)分低于對(duì)照組，IL-6、CRP、TNF-α水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值介于-21.533～30.802之間，P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組血清miR-384、炎癥因子及NBNA評(píng)分比較

2.3兩組Th17、Treg及Th17/Treg比較

HIE組Treg水平低于對(duì)照組，Th17、Th17/Treg水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值介于-6.166～8.390之間，P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組Th17、Treg及Th17/Treg比較

2.4不同臨床分度HIE患兒血清miR-384、炎癥因子及NBNA評(píng)分比較

HIE輕、中、重度組血清miR-384水平及NBNA評(píng)分均依次降低，IL-6、CRP、TNF-α水平均依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值介于82.368～225.418之間，P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同臨床分度HIE患兒血清miR-384、炎癥因子及NBNA評(píng)分比較

2.5不同臨床分度HIE患兒Th17、Treg及Th17/Treg比較

HIE輕、中、重度組Treg依次降低，Th17、Th17/Treg均依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值介于135.487～513.891之間，P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 不同臨床分度HIE患兒Th17、Treg及Th17/Treg比較

2.6 HIE患兒miR-384與炎癥因子、Th17、Treg、NBNA評(píng)分的相關(guān)性

經(jīng)Pearson線性相關(guān)分析提示，HIE患兒血清miR-384與IL-6、CRP、TNF-α、Th17、Th17/Treg呈負(fù)相關(guān)(r值介于-0.867～-0.406之間，P<0.05)，與Treg、NBNA評(píng)分呈正相關(guān)(r值分別為0.671、0.776，P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 HIE患兒miR-384與炎癥因子、Th17、Treg、NBNA評(píng)分的相關(guān)性

3討論

3.1 HIE發(fā)病現(xiàn)狀及基礎(chǔ)機(jī)制分析

研究表明在我國(guó)活產(chǎn)兒中，約3‰～6‰出現(xiàn)HIE，死亡率約為15%～20%，即便患兒存活，仍有約25%～30%發(fā)生不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[10]。盡早對(duì)患兒進(jìn)行治療，可以改善其預(yù)后。研究指出免疫炎癥反應(yīng)參與了HIE發(fā)病與進(jìn)展過(guò)程，炎癥因子可通過(guò)炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞功能有調(diào)節(jié)作用；促炎因子的過(guò)度釋放能啟動(dòng)炎癥機(jī)制，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，加重HIE所致的神經(jīng)損害[11]。Th17/Treg失衡也與HIE有關(guān)，二者失衡通常表現(xiàn)為與之相關(guān)的促炎因子釋放增加，而抗炎因子釋放減少，引起炎癥免疫紊亂，促使腦組織功能損害[12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)某些miRNA在組織處于缺氧、缺血時(shí)存在異常表達(dá)，miRNA的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)蛋白功能有一定影響，參與其凋亡、生長(zhǎng)等過(guò)程，它通過(guò)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后沉默進(jìn)行介導(dǎo)，從而在HIE中發(fā)揮作用[13]。臨床通過(guò)分析相關(guān)的miRNA在HIE中的作用，可能對(duì)該病治療具有一定指導(dǎo)意義。

3.2 HIE與炎癥因子、miR-384表達(dá)、Th17/Treg失衡的關(guān)系

本研究提示與健康新生兒相比，HIE患兒的血清IL-6、CRP、TNF-α水平明顯增高，而NBNA評(píng)分下降，表明患兒存在炎癥反應(yīng)，且神經(jīng)行為能力相對(duì)較差。IL-6是一種促炎因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)防御、損害過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，在出現(xiàn)HIE后可導(dǎo)致IL-6水平迅速上調(diào)，它能促使炎癥細(xì)胞在病變部位大量聚集，促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放大量的毒性氧基，加重HIE損害[14]。CRP、TNF-α對(duì)炎癥介質(zhì)釋放有激活作用，能促進(jìn)局部炎癥損害，且對(duì)黏附因子釋放、合成存在誘導(dǎo)作用，致腦損害加重[15-16]。

本研究結(jié)果顯示HIE患兒的血清miR-384表達(dá)量較正常新生兒明顯降低。目前，動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)功能損傷后，海馬體中miR-384-5p存在異常表達(dá)[17]，表明其可能參與了中樞神經(jīng)毒性進(jìn)展，與腦損害發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。Liu等[18]認(rèn)為miR-384對(duì)腦中樞神經(jīng)元的調(diào)節(jié)機(jī)制比較復(fù)雜，可能通過(guò)Snhg8/miR-384/Hoxa13/FAM3A軸發(fā)揮作用，其中Snhg8過(guò)表達(dá)能調(diào)控miR-384發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，而miR-384表達(dá)能靶向其3′UTR影響Hoxa13表達(dá)，Hoxa13則能與FAM3A啟動(dòng)子結(jié)合，對(duì)神經(jīng)元凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，但在該調(diào)節(jié)軸中，miR-384過(guò)表達(dá)反而促進(jìn)神經(jīng)元凋亡，加重腦損害，與本次結(jié)論相悖。分析原因可能為上述研究以小鼠為模型，而本研究以新生兒為研究對(duì)象。miR-384還可能通過(guò)減少腦組織內(nèi)炎性巨噬細(xì)胞，從而減少腦內(nèi)丙二醛、過(guò)氧化氫酶和超氧陰離子陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，減輕局部炎癥，對(duì)腦組織進(jìn)行保護(hù)[19]。而炎癥與HIE發(fā)生密切相關(guān)，大量炎癥介質(zhì)的釋放會(huì)加重HIE嚴(yán)重程度，miR-384低表達(dá)則可能通過(guò)促炎作用，加速HIE發(fā)生與進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)HIE患兒的血清Treg下降，Th17、Th17/Treg增高，表明Th17/Treg參與了該病發(fā)生過(guò)程。Treg具有抗炎功能，能對(duì)自身免疫反應(yīng)進(jìn)行抑制，在限制炎癥、維持免疫穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。Th17則具有促炎作用，它能通過(guò)調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-kB(nuclear factor kappaB，NF-kB)信號(hào)路徑，促進(jìn)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生。腦損傷患者可見(jiàn)Th17/Treg失衡，具體表現(xiàn)為T(mén)h17及其細(xì)胞因子含量上升，而Treg及其細(xì)胞因子含量下降，Th17/Treg失衡可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)的炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)腦損傷[20]。

3.3 miR-38表達(dá)與HIE患兒炎癥、Th17/Treg失衡、NBNA評(píng)分的關(guān)系

本研究顯示隨著HIE臨床分度增加，患兒的促炎因子表達(dá)水平逐漸升高，而血清miR-384水平、抗炎因子表達(dá)水平逐漸下降，且NBNA評(píng)分逐漸降低。這表明HIE患兒病情加重與炎癥反應(yīng)程度及神經(jīng)行為能力水平有關(guān)。患兒機(jī)體組織中的炎癥程度越重，則可導(dǎo)致腦損害進(jìn)一步加劇，進(jìn)而影響神經(jīng)行為功能，經(jīng)之前的分析提示血清miR-384在腦損傷中能發(fā)揮抗炎作用，而低表達(dá)的miR-384可能無(wú)法對(duì)腦內(nèi)炎性巨噬細(xì)胞進(jìn)行充分調(diào)節(jié)，促進(jìn)神經(jīng)炎癥，加重中樞神經(jīng)毒性，致腦損害進(jìn)展，上述作用可能共同導(dǎo)致HIE病情加重。本研究提示HIE患兒血清miR-384與炎癥因子、Th17、Treg、NBNA評(píng)分均有相關(guān)性，這進(jìn)一步提示miR-384可能通過(guò)與炎癥因子、Th17、Treg相互作用，參與HIE進(jìn)展。miR-384可能通過(guò)減少炎性巨噬細(xì)胞、下調(diào)促炎介質(zhì)水平發(fā)揮抗炎功能，對(duì)腦組織功能進(jìn)行保護(hù)，而一旦miR-384表達(dá)下調(diào)，則可能致炎性巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，促炎介質(zhì)釋放增多，導(dǎo)致與Th17相關(guān)的促炎因子大量釋放，機(jī)體抗炎作用減弱，Treg相關(guān)抗炎因子水平下調(diào)，促使Th17/Treg失衡。

綜上所述，HIE患兒血清miR-384水平下調(diào)，且其可能與炎癥因子、Th17、Treg共同影響HIE患兒病情有關(guān)，臨床有望通過(guò)檢測(cè)血清miR-384水平輔助評(píng)估HIE患兒病情。本研究局限性為受研究時(shí)間限制，未進(jìn)一步隨訪觀察miR-384對(duì)HIE患兒遠(yuǎn)期腦發(fā)育是否有影響，日后將增設(shè)隨訪對(duì)此予以探討。