鄧宏哲，陳 昆，李 鵬，朱清海*

1.黃淮學(xué)院直屬附屬駐馬店市中心醫(yī)院 普外腹腔鏡、減重與代謝外科，河南 駐馬店 463000

2.黃淮學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河南 駐馬店 463003

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種罕見的呼吸系統(tǒng)疾病，主要特征為肺泡壁及間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞過度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)合成增多、肺結(jié)構(gòu)破壞等，并最終導(dǎo)致進(jìn)行性嚴(yán)重呼吸困難[1]。既往研究顯示，PF 發(fā)病率呈逐年增加趨勢，且患者預(yù)后狀況極差，確診后平均生存時(shí)間僅為2～3 年，嚴(yán)重危害人類健康[2]。目前，對(duì)于PF 除肺移植外尚缺乏理想的藥物治療。因此以PF發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為切入點(diǎn)，研發(fā)有效的治療藥物對(duì)于改善PF 患者預(yù)后具有重要的臨床價(jià)值。

人參皂苷Rg1是三七總皂苷中的主要活性成分，具有抗炎、抗纖維等作用[3]。研究顯示，人參皂苷Rg1能夠上調(diào)小窩蛋白-1 表達(dá)，下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表達(dá)，降低肺組織α-肌動(dòng)球蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量，從而改善PF 大鼠組織形態(tài)[4]，提示人參皂苷Rg1可能是治療PF 的潛在藥物。但是目前有關(guān)人參皂苷Rg1在PF 中的機(jī)制研究仍然較少。細(xì)胞焦亡作為一種新的炎癥性細(xì)胞死亡方式，在PF 進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。研究顯示，博來霉素誘導(dǎo)的大鼠PF模型中焦亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 表達(dá)顯著升高，而抑制Caspase-1 表達(dá)能夠抑制細(xì)胞焦亡過程，從而顯著改善大鼠PF 組織形態(tài)[5]，提示通過調(diào)控Caspase-1 依賴性細(xì)胞焦亡可能為治療PF 的關(guān)鍵機(jī)制之一。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）/NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）是細(xì)胞焦亡調(diào)節(jié)的重要途徑，抑制AMPK表達(dá)能夠激活NLRP3 進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞焦亡[6]，且AMPK 及NLRP3 炎性小體激活在PF 組織損傷中發(fā)揮重要作用[7-8]。本研究擬通過構(gòu)建博來霉素誘導(dǎo)大鼠PF 模型，旨在從AMPK/NLRP3 介導(dǎo)細(xì)胞焦亡途徑探究人參皂苷Rg1抗大鼠PF 的作用機(jī)制，以期為人參皂苷Rg1開發(fā)臨床應(yīng)用治療PF 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量180～200 g，6～8 周齡，購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2018-0007，使用許可證號(hào)SYXK（豫）2019-0013。動(dòng)物飼養(yǎng)于（24±2）℃、相對(duì)濕度（55±5）%的環(huán)境中，晝夜交替光照，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合3R 原則，通過駐馬店市中心醫(yī)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查（批準(zhǔn)號(hào)2021LL020）。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rg1（批號(hào)AF20033002，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%）購自成都埃法生物科技有限公司；博來霉素（批號(hào)20067411）購自瀚暉制藥有限公司；AMPK 激動(dòng)劑 AICAR（批號(hào) S1802）、AMPK 抑制劑Compound C（批號(hào)S7306）購自美國Selleck 公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6、IL-1β、IL-18 檢測試劑盒（批號(hào)分別為20180052IL6M、20165200IL1M、20160645TNF1M、20160648IL18M）購自上海拜力生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、顯影液、β-actin 抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（批號(hào)分別為P0012S、ST023、C0105S、C1091、AF5001、A0412、A0408）購自上海碧云天生物技術(shù)公司；Masson 染色液（批號(hào)G1343）購自北京Bioss 公司；免疫組化檢測試劑盒（批號(hào)SP-9001）購自北京中杉金橋公司；Hyp 檢測試劑盒（批號(hào)A030-2-1）購自南京建成生物工程研究所；collagen I 抗體（批號(hào)ab270993）、α-SMA 抗體（批號(hào)ab265588）購自英國Abcam 公司；AMPK 抗體、p-AMPK 抗體、NLRP3抗體、Caspase-1 抗體、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）抗體、IL-1β 抗體、IL-18 抗體（批號(hào)分別為9158、5759、13158、83383、39754、12703、67775）購自美國CST 公司。

1.3 儀器

LP-5117 型多功能酶標(biāo)儀（長春樂鏷科技有限公司）；CKX53 型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；H3-18KR 型高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；Flexivent fv-fx4 型小動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)（加拿大Scireq 公司）；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；MDF-C8V(N)型-80 ℃冷凍冰箱（日本SANYO 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

參照文獻(xiàn)方法[4,9]構(gòu)建PF 大鼠模型，大鼠ip 1%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉后，取仰臥位固定，行器官插管后單次注射博來霉素（5 mg/kg），模型成功率為100%。造模成功后2 d，動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、人參皂苷Rg1（72 mg/kg）[4,10]組、AMPK 激動(dòng)劑（200 mg/kg）組、人參皂苷Rg1（72 mg/kg）+AMPK 抑制劑（20 mg/kg）[11-12]組，每組各10 只，另取10 只大鼠作為對(duì)照組。人參皂苷Rg1組ig 人參皂苷Rg1，AMPK 激動(dòng)劑組ip AICAR，人參皂苷Rg1+AMPK 抑制劑組ig 人參皂苷Rg1同時(shí)ip Compound C，對(duì)照組和模型組ig 生理鹽水，1 次/d，連續(xù)28 d。

2.2 大鼠呼吸功能指標(biāo)檢測

各組大鼠麻醉后，行氣管插管并利用小動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)檢測大鼠呼吸功能相關(guān)指標(biāo)，測定用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、第0.3 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume，F(xiàn)EV0.3）與FVC 的比值（FEV0.3/FVC）、最大呼氣量（peak expiratory flow，PEF）和最大通氣量（maximal voluntary ventilation，MVV）。以上檢測指標(biāo)均由同一人完成，每只大鼠測量3 次，取平均值。

2.3 肺組織標(biāo)本采集

給藥結(jié)束后，稱定各組大鼠體質(zhì)量，大鼠ip 戊巴比妥鈉麻醉，斷頭處死，取全肺，生理鹽水沖洗肺組織表面血漬，濾紙吸干水平，稱定質(zhì)量，計(jì)算肺指數(shù)。將部分左肺組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定，右肺組織放置于冷凍管內(nèi)放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

肺指數(shù)=肺濕質(zhì)量/體質(zhì)量

2.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取于4%多聚甲醛中固定的左肺組織，脫水、透明石蠟包埋，制備組織切片，切片厚度約3～5 μm，進(jìn)行HE 染色、封片后，于顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化；進(jìn)行Masson 染色，觀察肺組織病理學(xué)變化及膠原沉積情況。

2.5 肺組織Hyp、TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-18 含量檢測

剪取100 mg 各組大鼠右肺組織，充分勻漿，3000 r/min 離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定Hyp、TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-18 含量。

2.6 免疫組化檢測肺組織collagen I 和α-SMA 蛋白表達(dá)

取各組大鼠左肺組織石蠟切片，按照免疫組化檢測試劑盒處理，分別滴加collagen I、α-SMA 抗體（1∶200）孵育后，滴加二抗（1∶1000）孵育，DAB顯色，于顯微鏡下觀察肺組織collagen I、α-SMA 陽性表達(dá)，collagen I、α-SMA 蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒。利用Image Pro Plus 圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，每組取6 張切片，隨機(jī)取6 個(gè)高倍視野，測量每個(gè)視野中蛋白陽性染色區(qū)域面積，計(jì)算得到陽性染色區(qū)域面與總面積比值，即為collagen I、α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 Western blotting 檢測肺組織AMPK/NLRP3通路及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)

取各組大鼠右肺組織，剪碎，液氮碾磨成細(xì)粉狀，加入5 倍量裂解液，4 ℃裂解40 min，提取蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入5% BSA，室溫封閉2 h；分別加入p-AMPK 抗體（1∶1000）、AMPK 抗體（1∶1000）、NLRP3 抗體（1∶1000）、Caspase-1 抗體（1∶1000）、GSDMD 抗體（1∶1000）、IL-1β 抗體（1∶1000）、IL-18 抗體（1∶1000）和β-actin 抗體（1∶2000），4 ℃孵育過夜；加入相應(yīng)二抗（1∶5000），室溫孵育1～2 h；洗膜3 次，每次5 min，滴加顯影液，顯影并拍照。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺功能的影響

如表1 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺功能指標(biāo)FVC、FEV0.3/FVC、PEF 和MVV 均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg1組和AMPK 激動(dòng)劑組FVC、FEV0.3/FVC、PEF 和MVV指標(biāo)均顯著升高（P＜0.05）；與人參皂苷Rg1組比較，人參皂苷Rg1+AMPK 抑制劑組FVC、FEV0.3/FVC、PEF 和MVV 指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05）。

表1 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺功能的影響 (,n=6)Table 1 Effect of ginsenoside Rg1 on pulmonary function of PF rats (,n=6)

表1 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺功能的影響 (,n=6)Table 1 Effect of ginsenoside Rg1 on pulmonary function of PF rats (,n=6)

與對(duì)照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05；與人參皂苷Rg1 組比較：△P＜0.05，下表同#P ＜ 0.05 vs control group;*P ＜ 0.05 vs model group;△P ＜ 0.05 vs ginsenoside Rg1 group,same as below tables

3.2 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織病理變化的影響

HE 染色結(jié)果（圖1）顯示，對(duì)照組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肺泡清晰可見，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁明顯增厚且有部分肺泡已消失，可見大量炎癥細(xì)胞在肺泡和間質(zhì)腔內(nèi)浸潤。與模型組比較，人參皂苷Rg1組及AMPK 激動(dòng)劑組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷減輕，肺泡壁厚度降低，炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象降低。與人參皂苷Rg1組比較，人參皂苷Rg1+AMPK 抑制劑組大鼠肺組織損傷程度較模型相似。

圖1 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織病理變化的影響 (×400)Fig.1 Effect of ginsenoside Rg1 on pathological changes of lung tissue in PF rats (× 400)

Masson 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，無典型的纖維化現(xiàn)象。模型組大鼠肺組織出現(xiàn)大量膠原沉積，纖維化程度嚴(yán)重。與模型組比較，人參皂苷Rg1組及AMPK 激動(dòng)劑組大鼠膠原沉積降低，纖維化程度減輕。與人參皂苷Rg1組比較，人參皂苷Rg1+AMPK 抑制劑組大鼠肺組織膠原沉積增多，纖維化程度加重，與模型組相近。

3.3 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺指數(shù)和肺組織Hyp含量的影響

如表2 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺指數(shù)和肺組織Hyp 含量均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg1組及AMPK 激動(dòng)劑組大鼠肺指數(shù)和肺組織Hyp 含量均顯著降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rg1組比較，人參皂苷Rg1+AMPK 抑制劑組大鼠肺指數(shù)和肺組織Hyp 含量均顯著增加（P＜0.05）。

表2 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺指數(shù)和肺組織Hyp 含量的影響 (,n=6)Table 2 Effect of ginsenoside Rg1 on lung index and Hyp content in lung tissue of PF rats (,n=6)

表2 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺指數(shù)和肺組織Hyp 含量的影響 (,n=6)Table 2 Effect of ginsenoside Rg1 on lung index and Hyp content in lung tissue of PF rats (,n=6)

3.4 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織collagen I 和α-SMA 蛋白表達(dá)的影響

如圖2 和表3 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織collagen I 和α-SMA 蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg1組及AMPK 激動(dòng)劑組大鼠肺組織collagen I 和α-SMA 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rg1組比較，人參皂苷Rg1+AMPK 抑制劑組大鼠肺組織collagen I 和α-SMA 蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）。

圖2 免疫組化檢測各組大鼠肺組織collagen I 和α-SMA 蛋白表達(dá) (×400)Fig.2 Expressions of collagen I and α-SMA protein in lung tissue of rats in each group detected by immunohistochemistry(× 400)

表3 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織collagen I 和α-SMA蛋白表達(dá)的影響 (,n=6)Table 3 Effect of ginsenoside Rg1 on collagen I and α-SMA protein expressions in lung tissue of PF rats (,n=6)

表3 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織collagen I 和α-SMA蛋白表達(dá)的影響 (,n=6)Table 3 Effect of ginsenoside Rg1 on collagen I and α-SMA protein expressions in lung tissue of PF rats (,n=6)

3.5 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織炎癥因子水平的影響

如表4 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-18 水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg1組及AMPK 激動(dòng)劑組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-18 水平均明顯降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rg1組比較，人參皂苷Rg1+AMPK 抑制劑組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-18 水平均明顯升高（P＜0.05）。

表4 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-18 水平的影響 (,n=6)Table 4 Effect of ginsenoside Rg1 on levels of TNF-α,IL-6,IL-1β and IL-18 in lung tissue of PF rats (,n=6)

表4 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-18 水平的影響 (,n=6)Table 4 Effect of ginsenoside Rg1 on levels of TNF-α,IL-6,IL-1β and IL-18 in lung tissue of PF rats (,n=6)

3.6 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織AMPK/NLRP3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織p-AMPK/AMPK 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），NLRP3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg1組及AMPK 激動(dòng)劑組大鼠肺組織p-AMPK/AMPK 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），NLRP3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rg1組比較，人參皂苷Rg1+AMPK 抑制劑組大鼠肺組織p-AMPK/AMPK 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），NLRP3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

圖3 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織AMPK/NLRP3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (,n=6)Fig.3 Effect of ginsenoside Rg1 on expressions of AMPK/NLRP3 pathway related proteins in lung tissue of PF rats (,n=6)

3.7 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織 cleaved Caspase-1/pro Caspase-1、GSDMD-N/GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg1組及AMPK 激動(dòng)劑組cleaved Caspase-1/pro Caspase-1、GSDMD-N/GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rg1組比較，人參皂苷Rg1+AMPK 抑制劑組cleaved Caspase-1/pro Caspase-1、GSDMD-N/GSDMD、IL-1β 和IL-18蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）。

圖4 人參皂苷Rg1 對(duì)PF 大鼠肺組織焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (,n=6)Fig.4 Effect of ginsenoside Rg1 on expressions of scorch-related proteins in lung tissue of PF rats (,n=6)

4 討論

PF 是一種不可逆且致命的肺部疾病，并伴有組織炎癥及肺泡結(jié)構(gòu)破壞等特征?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為炎癥調(diào)節(jié)失衡是PF 主要的發(fā)病機(jī)制之一，PF 前期會(huì)發(fā)生明顯的肺泡炎癥，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞在下呼吸道大量聚集，從而引起肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加，并最終導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)破壞，漸進(jìn)性形成PF[13]。雖然早期診斷和治療對(duì)于PF 臨床癥狀改善至關(guān)重要，但是目前尚未有良好的治療藥物。尼達(dá)尼布和吡非尼酮被推薦為臨床治療PF 的一線用藥，但是由于其誘發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生率高，限制了上述藥物臨床應(yīng)用。因此，尋找安全有效的治療藥物已經(jīng)成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。

中醫(yī)藥替代療法在PF 中逐漸被廣泛接受，人參皂苷Rg1是人參皂苷中的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤[14]等藥理學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1能夠改善PF 肺組織結(jié)構(gòu)破壞，具有潛在的PF 治療價(jià)值[4]。但是目前有關(guān)人參皂苷Rg1對(duì)PF 的作用機(jī)制尚不完全清楚。為此本研究首先通過博來霉素誘導(dǎo)大鼠PF 模型，觀察人參皂苷Rg1對(duì)其作用。結(jié)果顯示，模型組大鼠肺功能FVC、FEV0.3/FVC、PEF 和MVV 指標(biāo)均顯著降低，肺指數(shù)、肺組織膠原沉積現(xiàn)象及纖維化程度增加，肺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯損傷，提示PF 大鼠模型構(gòu)建成功。細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分解的動(dòng)態(tài)平衡是維持肺組織正常結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵。collagen I 作為PF 時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，由成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞合成分泌，而當(dāng)肺組織損傷時(shí)，成纖維細(xì)胞大量增殖并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肺實(shí)質(zhì)性損傷與結(jié)構(gòu)重塑，誘導(dǎo)PF[15]。α-SMA 是成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞時(shí)的標(biāo)志物，PF 時(shí)α-SMA 表達(dá)明顯增加[16]。肺指數(shù)和Hyp是反映肺纖維化的重要指標(biāo)。Hyp 作為膠原中特定氨基酸，其含量高低是評(píng)估膠原含量的重要指標(biāo)[17]。因此，通過檢測肺系數(shù)、肺組織Hyp 含量以及collagen I、α-SMA 蛋白表達(dá)能夠準(zhǔn)確反映肺組織膠原沉積情況，評(píng)價(jià)PF 時(shí)組織損傷程度。研究顯示，在PF 大鼠模型中肺指數(shù)、肺組織Hyp 含量以及collagen I、α-SMA 蛋白表達(dá)均顯著升高，而抑制上述指標(biāo)變化能夠顯著改善PF肺組織損傷程度[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺指數(shù)、肺組織Hyp含量以及collagen I、α-SMA 蛋白表達(dá)升高，給予人參皂苷Rg1干預(yù)后肺指數(shù)、肺組織Hyp 含量以及collagen I、α-SMA 蛋白表達(dá)均顯著降低，表明人參皂苷Rg1能夠有效降低膠原蛋白沉積，減輕PF。PF時(shí)肺泡上皮細(xì)胞釋放大量炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β 等，高炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞過度增殖以及轉(zhuǎn)向肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致膠原合成增加[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-18 水平明顯升高，人參皂苷Rg1能夠顯著降低肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-18 水平，表明人參皂苷Rg1能夠通過抑制炎癥反應(yīng)，改善PF。

細(xì)胞焦亡是一種新的程序性死亡，也被稱為炎癥性調(diào)節(jié)性壞死，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜脹大破裂導(dǎo)致內(nèi)容物釋放，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在PF 中發(fā)揮重要作用。NLRP3 炎性小體是焦亡啟動(dòng)的關(guān)鍵，當(dāng)NLRP3被激活時(shí)會(huì)促進(jìn)NLRP3 炎癥小體組裝形成復(fù)合物，繼而激活pro Caspase-1 形成具有活性的cleaved Caspase-1，誘導(dǎo)焦亡執(zhí)行蛋白GSDMD 形成具有細(xì)胞毒性的GSDMD-N，并使其募集至細(xì)胞膜上形成焦亡小孔，促進(jìn)炎癥因子IL-1β 和IL-18 表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[20]。研究顯示，NLRP3 炎性小體參與PF疾病進(jìn)展的各個(gè)階段，其活化后能夠激活I(lǐng)L-1β 和IL-18，而IL-1β 能夠刺激TGF-β1 合成，誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而加劇PF 形成，抑制NLRP3能夠明顯改善PF[21]，表明NLRP3 炎性小體可能成為治療PF 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。AMPK 被認(rèn)為是細(xì)胞能量和代謝的調(diào)節(jié)劑，參與調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激、自噬等途徑，在PF 肺組織損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[22]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織p-AMPK/AMPK表達(dá)降低，NLRP3 表達(dá)增加，焦亡相關(guān)蛋白（cleaved Caspase-1/pro Caspase-1、GSDMD-N/GSDMD、IL-1β、IL-18）表達(dá)增加，而人參皂苷Rg1能夠上調(diào)p-AMPK/AMPK 表達(dá)，下調(diào)NLRP3 及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)。抑制AMPK 活性可以通過激活NLRP3 炎性小體，促進(jìn)細(xì)胞焦亡，二甲雙胍可以通過AMPK 途徑抑制NLRP3 炎性小體活化，抑制心肌細(xì)胞焦亡，從而發(fā)揮心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，且此保護(hù)作用可顯著被AMPK 抑制劑Compound C 阻斷[23]。本研究結(jié)果顯示，AMPK 激動(dòng)劑組與人參皂苷Rg1發(fā)揮同向抗PF 作用，肺組織NLRP3 及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)均明顯降低，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平降低，提示AMPK/NLRP3 途徑可能是人參皂苷Rg1抗PF 的重要調(diào)節(jié)通路。為進(jìn)一步確證AMPK/NLRP3 在人參皂苷Rg1抗PF 中保護(hù)機(jī)制（圖5），同時(shí)給予人參皂苷Rg1和AMPK 抑制劑Compound C，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的大鼠PF 保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)，炎癥因子及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)均明顯升高，提示人參皂苷Rg1可以通過促進(jìn)AMPK 表達(dá)，抑制NLRP3 介導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)揮PF肺組織損傷的保護(hù)作用。

圖5 人參皂苷Rg1通過調(diào)控AMPK/NLRP3 通路抑制細(xì)胞焦亡減輕博來霉素誘導(dǎo)的PFFig.5 Ginsenoside Rg1 inhibits pyroptosis by regulating AMPK/NLRP3 pathway to reduce bleomycin-induced PF

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能夠改善博來霉素誘導(dǎo)的PF，其作用機(jī)制與抑制AMPK/NLRP3 通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突