徐資怡，陳佳美，鐘雪梅，吳億晗，章津銘

成都中醫(yī)藥大學藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137

雷公藤甲素（triptolide，Tr）是從衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook f.中提取出的環(huán)氧二萜內酯化合物，具有廣譜、高效的抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用機制包括誘導細胞凋亡、干擾細胞周期、抑制血管生成、抑制端粒酶活性、誘導腫瘤細胞自噬等[1-2]。尤其對于在我國具有高發(fā)病率和高死亡率的肝癌，Tr 具有顯著療效，其抗肝癌活性在細胞模型和動物模型上甚至強于阿霉素、索拉非尼等臨床一線藥物，是目前極具潛力的候選藥物[3-4]。然而，Tr 水溶性差、治療窗窄，對腫瘤組織/細胞分布缺乏專屬性，容易造成對肝腎組織、血液系統的毒副作用[5-7]。

納米載體具有較強的載藥能力、體內長循環(huán)、腫瘤組織被動/主動靶向、減少藥物不良反應等優(yōu)勢[8]。課題組前期構建了多種納米載體用于Tr 抗腫瘤的高效遞送[9-11]。脂質體是目前應用最成熟和廣泛的抗腫瘤藥物遞送載體，膽固醇是其重要組成部分，具有維持脂質體磷脂雙分子層膜穩(wěn)定性的作用，但膽固醇易受氧、光、金屬等外界條件的影響，在加工儲存過程中產生膽固醇氧化產物，具有一定的細胞毒性、致突變性和潛在致癌性[12-14]；此外，攝入過量膽固醇可能引起高脂血癥、動脈粥樣硬化等疾病[15-16]。高膽固醇水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展也有相關性，膽固醇還可能誘發(fā)“補體介導的假過敏反應”，導致肺動脈高壓等心肺副作用[17-18]。

篩選與膽固醇結構相似，用以構建不含膽固醇的脂質納米體系是目前研究熱點之一，具有良好的研究和應用前景。植物中的甾醇和皂苷，如類胡蘿卜素、大豆甾醇、人參皂苷等，已被證明具有類似于膽固醇的類固醇結構、熱致相行為和抗脂質體氧化的作用，將其替代膽固醇構建脂質納米載體，可以有效改善含膽固醇的磷脂雙層理化性質[19]。研究者發(fā)現，部分中藥三萜皂苷成分與膽固醇結構相似，且具有良好藥理活性，用以替換膽固醇，既能保持脂質體載藥性能，又賦予脂質體新的藥效或靶向性能，體現出“藥輔合一”的特點[14]。復旦大學王建新教授團隊[18]將人參皂苷Rh2代替膽固醇作為脂質體關鍵膜材，制備遞送紫杉醇的脂質納米粒，藥輔兩用，利用人參皂苷Rh2與葡萄糖轉運體結合提高納米粒腫瘤靶向性，而且發(fā)揮其自身抗腫瘤和免疫調節(jié)作用，從而賦予納米載體高穩(wěn)定性、長循環(huán)、主動靶向和免疫調節(jié)等多種功能。

甘草酸是豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的主要活性成分之一，屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷，具有較好的抗腫瘤活性[20]。甘草酸具有兩親性類似于表面活性劑的結構特點[21]，可與細胞膜上的膽固醇或磷脂相互作用，改變脂質流動性，增加細胞膜通透性和藥物跨膜能力[22-23]。此外，研究證實肝癌細胞表面存在大量甘草酸特異性結合位點[24-25]，經甘草酸修飾的納米載體具有更強的肝癌靶向能力。

因此，本實驗擬采用甘草酸替代膽固醇作為脂質膜材，將其用于Tr 的包載和抗腫瘤遞送，制備一種新型載雷公藤甲素的甘草酸脂質納米粒（glycyrrhizic acid lipid nanoparticles loaded with triptolide，Tr@GLN）。通過對比考察Tr@GLN 與膽固醇為膜材的載雷公藤甲素脂質體（cholesterol lipid nanoparticles loaded with triptolide，Tr@CLN）的理化性質、載藥性能、體外細胞攝取能力、荷瘤肝癌小鼠模型抗腫瘤作用等方面，從而揭示甘草酸替代膽固醇構建脂質納米粒并作為Tr 遞藥載體的適宜性，為其抗腫瘤遞送提供了新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000 型高效液相色譜（HPLC）儀，美國Thermo Fisher 公司；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海邦西儀器科技有限公司；Litesizer 500 納米粒度及ζ 電位分析儀，上海安東帕商貿有限公司；YMNL-1000Y 超聲波細胞粉碎機，南京以馬利儀器設備有限公司；JEM-1230 透射電子顯微鏡，日本JEOL 公司；TSC SP8 STED 激光掃描共聚焦顯微鏡，德國Leica 公司。

1.2 藥品與試劑

Tr，質量分數≥98%，批號DSTDL003401，成都德思特生物技術有限公司；甘草酸，質量分數＞98%，批號D1213A，天津美倫醫(yī)藥有限公司；蛋黃卵磷脂，批號AL20002，上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司；膽固醇，批號C104028，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM 培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液，美國Gibco 公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青公司；激光共聚焦皿，北京碩華佰奧生物科技有限公司；乙腈，色譜純，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司；磷酸，色譜純，成都市諾爾施科技有限責任公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 細胞株及實驗動物

人肝癌HepG2 細胞、小鼠肝癌H22 細胞均購自中科院上海細胞生物學研究所。ICR（institute of cancer research）小鼠，SPF 級，體質量20～25 g，雄性，購于北京斯貝福生物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)條件：溫度為20～26 ℃，濕度為40%～70%。實驗期間動物自由進食、飲水，晝夜節(jié)律正常。動物實驗獲得成都中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會的批準，批準號2020DL-126。

2 方法與結果

2.1 Tr@GLN 和Tr@CLN 的制備

采用乙醇注入法分別制備 Tr@GLN、Tr@CLN[26-29]。稱取6 mg 甘草酸或膽固醇、30 mg 蛋黃卵磷脂以及1 mg Tr 完全溶解于2 mL 乙醇中，作為有機相。將有機相緩慢勻速滴入10 mL 水相（純水）中，邊滴加邊攪拌，滴加完畢后于在磁力攪拌器上37 ℃恒溫400 r/min 攪拌1 h。待有機溶劑揮盡后，用超聲波細胞破碎儀冰浴探超5 min，超聲破碎3 s，間歇2 s。最后用0.45 μm 微孔濾膜濾過，得到白色乳光的Tr@GLN 和Tr@CLN 溶液。

2.2 Tr@GLN 和Tr@CLN 的表征

2.2.1 粒徑、多分散指數（polydispersity，PDI）與ζ 電位考察 分別取一定體積的樣品溶液于粒徑池和電位池中，利用納米粒度及ζ 電位分析儀測定其粒徑、PDI 及ζ 電位值。結果顯示，采用乙醇注入法制備得到Tr@GLN 和Tr@CLN 均為帶乳白色乳光的透明液體，如圖1-IA、IIA 所示；其粒徑相差不大，分別為（115.59±1.23）、（97.28±0.95）nm，PDI 分別為0.18±0.03、0.22±0.02，均小于0.3，制備的Tr@GLN 粒徑均勻度、分散性較好，見圖1-IB、IIB。ζ 電位分別為（-19.63±3.14）、（-7.77±0.12）mV，表明Tr@GLN 各微粒之間帶有一定程度的負電性，這對脂質納米粒的相互聚集有一定的抑制作用，有助于增強脂質體體系的穩(wěn)定性。

2.2.2 形態(tài)學考察 取10 μL 樣品溶液于碳膜銅網上，靜置1 min 后將多余液體從銅網邊緣除去。再將3%磷鎢酸水溶液滴加1 滴至銅網表面，負染2 min 后用濾紙吸附多余染料，待液體揮干后在TEM下拍攝其形態(tài)，結果見圖1-IC、IIC。通過TEM 拍攝顯示，Tr@CLN 呈類橢圓形的多層結構；相比Tr@CLN，Tr@GLN 的形貌呈更加均勻圓整球形，具有多層結構，分散性適中。

圖1 Tr@GLN (I) 和Tr@CLN (II) 的外觀 (A)、粒徑分布 (B)、TEM 形態(tài) (C,比例尺為100 nm)Fig.1 Appearance (A),particle size distribution (B),TEM morphology (C,scale bar is 100 nm) of Tr@GLN (I) and Tr@CLN(II)

2.2.3 儲存穩(wěn)定性考察 將Tr@CLN、Tr@GLN 密封放置于4 ℃冰箱保存，連續(xù)7 d 測量其粒徑、ζ 電位值變化，結果如表1 所示，兩者粒徑在低溫儲存條件下具有穩(wěn)定的粒徑和ζ 電位，表明甘草酸代替膽固醇后可以得到穩(wěn)定的脂質體。

表1 Tr@GLN 和Tr@CLN 的存儲穩(wěn)定性 (,n=3)Table 1 Storage stability of Tr@GLN and Tr@CLN(,n=3)

表1 Tr@GLN 和Tr@CLN 的存儲穩(wěn)定性 (,n=3)Table 1 Storage stability of Tr@GLN and Tr@CLN(,n=3)

2.3 Tr@GLN 和Tr@CLN 的包封率及載藥量測定

2.3.1 HPLC 色譜條件

（1）TP 測定條件[11]：色譜柱為Welch Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為純水-甲醇（54∶46）；檢測波長220 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

（2）甘草酸測定條件[30]：色譜柱為 Welch Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%磷酸水溶液-甲醇（25∶75）；檢測波長250 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.3.2 供試品溶液和對照品溶液的制備 取2 mL甲醇于1 mL Tr@CLN 或Tr@GLN 溶液中，渦旋、超聲破乳，使得制備的脂質體完全破壞，過0.22 μm有機濾膜，即得供試品溶液。

分別精密稱取Tr 對照品、甘草酸對照品于10 mL量瓶中，用甲醇溶液定容，得到1 mg/mL Tr 對照品母液和2.06 mg/mL 甘草酸對照品母液。

2.3.3 專屬性考察 取“2.3.2”項供試品溶液和對照品溶液，分別按照“2.3.1”項下色譜條件進樣。結果如圖2、3 所示，可知Tr 和甘草酸的保留時間分別為10.77、8.53 min，供試品溶液和對照品溶液出峰時間相同，供試品溶液中的溶劑和輔料對Tr 和甘草酸的測定無干擾。

圖2 Tr 對照品 (A)、Tr@GLN 樣品 (B) 和Tr@CLN 樣品 (C) 的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC of triptolide reference substance (A),Tr@GLN sample (B) and Tr@CLN sample (C)

圖3 甘草酸對照品 (A) 和Tr@GLN 樣品 (B) 的HPLC 圖Fig.3 HPLC of glycyrrhizic acid reference substance (A)and Tr@GLN sample (B)

2.3.4 線性關系考察 分別取“2.3.2”項Tr、甘草酸對照品溶液，用甲醇分別稀釋成500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL Tr 對照品溶液和1 030、515、257.5、128.75、64.375、32.187 5 μg/mL 甘草酸對照品溶液，過0.22 μm 濾膜，進樣。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程分別為TrY=17 537X+134 487，r=0.999 0，線性范圍500～15.625 μg/mL；甘草酸Y=5 822.6X+79 001，r=0.999 0，線性范圍1 030～32.187 5 μg/mL，表明在定量范圍內各質量濃度與峰面積線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗 取“2.3.2”項下Tr@GLN 和Tr@CLN 供試品溶液，分別連續(xù)進樣6 次，計算Tr@GLN 樣品中的Tr 和甘草酸峰面積的RSD 分別為0.51%、0.58%，Tr@CLN 樣品中的Tr 和甘草酸峰面積的RSD 分別為0.48%、0.63%，說明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.2”項下Tr@GLN 和Tr@CLN 供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，計算Tr@GLN 樣品中的Tr 和甘草酸峰面積的RSD 分別為0.23%、0.41%，Tr@CLN 樣品中的Tr 和甘草酸峰面積的RSD 分別為0.59%、0.62%，說明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

2.3.7 重復性試驗 按照“2.3.2”項方法配制Tr@GLN 和Tr@CLN 供試品溶液，平行6 份，進樣，計算Tr@GLN 樣品中的Tr 和甘草酸質量濃度的RSD 分別為1.28%、1.07%，Tr@CLN 樣品中的Tr和甘草酸質量濃度的RSD 分別為1.23%、1.04%，說明該方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取6 份已測定Tr 和甘草酸含量的Tr@GLN 溶液各500 μL，分別加入Tr 對照品溶液（1 mg/mL）500 μL，甘草酸對照品溶液（2.06 mg/mL）500 μL，隨后渦旋、超聲處理，過0.22 μm 微孔濾膜。平行6 份，進樣，計算Tr 和甘草酸的平均加樣回收率分別為100.07%、99.43%，RSD分別為1.84%、1.50%，表明該方法回收率良好。

另取6 份已測定Tr 含量的Tr@CLN 溶液各500 μL，分別加入Tr 對照品溶液（1 mg/mL）500 μL，隨后渦旋、超聲處理，過0.22 μm 微孔濾膜。平行6 份，進樣，計算得Tr 的平均加樣回收率為99.48%，RSD 為1.83%，表明該方法回收率良好。

2.3.9 包封率和載藥量的測定 取2 mL 甲醇分別于1 mL Tr@GLN 和Tr@CLN 樣品溶液中，渦旋、超聲破乳，使得制備的脂質體完全破壞，過0.22 μm有機濾膜，用高效液相測定樣品中甘草酸與Tr 含量，根據公式分別計算包封率和載藥量。

W0為脂質納米?；蛑|體中藥物含量，W1為藥物投加量，W2為脂質納米粒或脂質體材料量

計算得到Tr@GLN 和Tr@CLN 中Tr 的包封率分別為（89.70±0.39）%、（87.39±0.37）%，載藥量分別為（2.25±0.01）%、（2.31±0.01）%；Tr@GLN中的甘草酸包封率為（87.46±0.65）%，載藥量為（13.41±0.09）%。

2.4 Tr@GLN 和Tr@CLN 的體外釋放行為考察

分別將3 mL Tr@CLN、Tr@GLN 溶液置于透析袋（截留相對分子質量3500）中，將透析袋浸入到30 mL 含有0.1%聚山梨酯80 的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，放入搖床，37 ℃、100 r/min 條件下振搖。分別于0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h 取1 mL 釋放介質，并補充相同體積的新鮮釋放介質。加入2 mL 甲醇到所取釋放介質中，渦旋、超聲破乳后，過0.22 μm 有機濾膜，采用HPLC 測得Tr含量，并計算累積釋放率。結果如圖4 所示，Tr@GLN 和Tr@CLN 都在8 h 內達到飽和，累積釋放率分別為52.92%、73.38%。Tr@GLN 中Tr 在24 h 內釋放較Tr@CLN 緩慢，說明甘草酸作為膜材料替代膽固醇可以使脂質體更加穩(wěn)定，具有一定緩釋作用。

圖4 Tr@CLN 和Tr@GLN 的體外釋藥情況Fig.4 In vitro release of Tr@CLN and Tr@GLN

2.5 Tr@GLN 和Tr@CLN 在HepG2 細胞攝取能力考察

考慮到Tr 無熒光，本研究采用帶綠色熒光的香豆素6（coumarin 6，C6）作為表征藥物，按照“2.1”項方法制備得到C6@CLN、C6@GLN。將HepG2細胞以1×105個細胞/孔的密度接種到激光共聚焦培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，將培養(yǎng)基分別更換為含有等量C6 質量濃度（100 ng/mL）的游離C6、C6@CLN、C6@GLN 的低血清新鮮培養(yǎng)基。于37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h 后，棄去培養(yǎng)基，用冷PBS洗滌2 次。加入4%多聚甲醛固定15 min，用冷PBS洗滌2 次，再加入Hoechst 33342 染細胞核10 min，用PBS 清洗后加入1 滴防熒光猝滅劑，采用激光共聚焦顯微鏡觀察HepG2 細胞對C6@GLN 的攝取情況。結果如圖5 所示，C6 呈綠色熒光，C6/GLLNP的熒光強度顯著高于游離C6 和C6@CLN，表明GLN 可以增加HepG2 細胞對游離藥物的攝取，并且HepG2 細胞對其攝取優(yōu)于C6@CLN，這可能與肝癌細胞膜表面具有甘草酸受體相關[31]。

圖5 游離熒光探針C6、C6@CLN、C6@GLN (C6 質量濃度均為100 ng·mL-1) 孵育4 h 后HepG2 細胞攝取情況 (藍色熒光為細胞核染色，綠色熒光為攝取進細胞的C6，比例尺為25 μm)Fig.5 Uptake of HepG2 cells with free fluorescent probes C6,C6@CLN and C6@GLN (mass concentration of C6 was 100 ng·mL-1) after incubation for 4 h (blue fluorescence is nuclear staining,green fluorescence is C6 absorbed into cells,scale bar is 25 μm)

2.6 Tr@GLN 和Tr@CLN 的體內抗腫瘤活性研究

取對數生長期的H22 細胞用0.25%胰蛋白酶消化后離心，用PBS 洗滌2 次并重懸后調整其密度為1×107個/mL，取100 μL 于小鼠皮下接種。當腫瘤體積達到100 mm3左右時，將小鼠隨機分為6 組，分別給予生理鹽水（對照）、Tr@GLN、Tr@CLN、游離Tr、游離甘草酸、游離Tr+游離甘草酸，其中Tr 給藥劑量為0.35 mg/kg，甘草酸給藥劑量為2.38 mg/kg。每2 天給藥1 次，給藥當天測量體質量和腫瘤體積，第12 天處死小鼠[10,32]。使用游標卡尺測量腫瘤體積，分別按公式計算腫瘤體積以及抑制率。

L為腫瘤最長直徑，D為腫瘤最短直徑，Vt為腫瘤體積，Wc和Wt分別代表對照組和各治療組的腫瘤質量

采用t檢驗分析比較各組數據，P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

結果如表2 所示，與對照組相比，游離Tr 組、游離甘草酸組、游離Tr+游離甘草酸組的腫瘤體積均有不同程度的減小，抑瘤率分別為18.26%、56.80%、49.70%，說明Tr 與甘草酸均具有一定的抗腫瘤活性。游離Tr+游離甘草酸組對腫瘤的抑制作用甚至強于Tr@CLN 組，這可能是由于甘草酸具有調節(jié)腫瘤相關巨噬細胞極化以及減少腫瘤新生血管生成作用，使得游離Tr 與甘草酸聯用抗腫瘤效果優(yōu)于單用Tr 的Tr@CLN 組。

表2 治療期間各組皮下荷瘤肝癌小鼠腫瘤體積變化Table 2 Changes in tumor volume of subcutaneous hepatocellular carcinoma mice in each group during treatment

Tr@GLN 組對腫瘤生長的抑制作用顯著強于游離Tr 組（P＜0.05），進一步證明所制備得到的Tr@GLN 由于滲透滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）以及主動靶向性使得其抗腫瘤作用明顯優(yōu)于游離Tr。此外，Tr@GLN 組與對照組相比，對腫瘤生長有顯著抑制效果（P＜0.05），抑瘤率為78.9%，高于Tr@CLN 組（抑瘤率為42.4%），這可能是由于GLN 本身具有調節(jié)腫瘤相關巨噬細胞極化作用，將Tr 包載于GLN 中，使得Tr 與甘草酸共達腫瘤部位對抗腫瘤。

實驗結束后，小鼠腫瘤拍照結果和腫瘤質量同樣表明，Tr@GLN 具有最佳抗腫瘤效果（圖6 和表3）。在整個治療期間，各組小鼠體質量均有相應增加，表明在Tr 安全給藥劑量下，Tr@GLN 并未表現出毒性，在體內安全性良好（表4）。

表3 第12 天各組小鼠離體腫瘤組織質量Table 3 Weight of tumor tissue in vitro of mice in each group on day 12

表4 治療期間各組皮下荷瘤肝癌小鼠體質量變化Table 4 Body weight changes of subcutaneous tumor-bearing hepatoma mice in each group during treatment

圖6 皮下荷瘤肝癌小鼠的離體腫瘤組織圖Fig.6 In vitro tumor tissue diagram of subcutaneous tumorbearing hepatoma mice

2.7 Tr@GLN 和Tr@CLN 的體內抗腫瘤機制研究

為了進一步證實組織學水平的抗腫瘤作用，在第12 天治療結束后，將所有小鼠處死，切取腫瘤組織進行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE 染色）、重組Ki-67 蛋白（recombinant Ki-67 protein，Ki-67，腫瘤細胞增殖標志物）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF，腫瘤新生血管標志物）免疫組織化學分析并對腫瘤組織進行分化群86（cluster of differentiation 86，CD86，M1 型巨噬細胞標志物）、分化群206（cluster of differentiation 206，CD206，M2 型巨噬細胞標志物）和小鼠含生長因子樣模體黏液樣激素樣受體（mouse EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1，F4/80，總巨噬細胞標志物）免疫熒光染色。結果如圖7 所示，對照組的腫瘤細胞很少觀察到凋亡或壞死，而其他各治療組均能觀察到腫瘤細胞的細胞核呈現不同程度的皺縮和數量減少。其中Tr@GLN 組的腫瘤細胞出現嚴重的凋亡損傷甚至壞死，說明Tr@GLN 具有最強的腫瘤細胞殺傷能力，抗腫瘤效果優(yōu)于Tr@CLN，這與上述動物實驗結果相同。

圖7 小鼠腫瘤組織中Ki-67 和VEGF 的HE 染色和免疫組化染色 (比例尺為100 μm)Fig.7 HE staining and immunohistochemical staining of Ki-67 and VEGF in tumor tissues of mice (scale bar is 100 μm)

課題組前期研究已經證實甘草次酸通過抑制腫瘤血管新生，協同化療藥物抗腫瘤[33]。甘草酸作為甘草中另一主要成分，研究發(fā)現其同樣具有抗腫瘤血管新生作用[34-36]，為了證實Tr@GLN 可以促進腫瘤細胞凋亡和抗腫瘤血管新生，通過Ki67 和VEGF的免疫組織化學進行了評估。

結果顯示，Tr@GLN 處理組Ki67 陽性細胞數遠低于對照組。游離Tr 組和Tr@CLN 組VEGF 表達相比于對照組沒有明顯減少，而游離甘草酸組、游離Tr+游離甘草酸組與Tr@GLN 組腫瘤新生血管均有相應的減少，且Tr@GLN 組VEGF 的表達水平顯著降低，表明甘草酸具有一定抑制腫瘤新血管形成能力且Tr@GLN 具有更加優(yōu)異的抗腫瘤新血管生成能力，這可能是由于Tr@GLN 具有更加強烈的腫瘤靶向性。研究發(fā)現甘草酸具有多種活性，尤其對腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAM）極化調節(jié)作用，可能為其抗腫瘤免疫調節(jié)角度提供思路。采用免疫熒光染色對小鼠腫瘤組織進行CD86、CD206 和F4/80 免疫熒光染色探究Tr@GLN 對腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞調節(jié)作用。結果如圖8 所示，綠色熒光表示總巨噬細胞，紅色熒光表示M1 型巨噬細胞（M1 TAM）或M2 型巨噬細胞（M2 TAM）。結果顯示，對照組中標記M1 TAM（F4/80+/CD86+）的紅色熒光最少，標記M2 TAM（F4/80+/CD206+）的紅色熒光最多，經過治療后，在給予甘草酸治療的組中，M1 TAM 增加和M2 TAM 減少較為明顯，同時可以明顯觀察到Tr@GLN組的M1 TAM 最多，M2 TAM 最少。上述結果提示甘草酸可以誘導腫瘤巨噬細胞向M1 型極化，改善腫瘤免疫抑制，通過將甘草酸代替膽固醇制備為GLLNP，不僅可以增加甘草酸在腫瘤部位的累積，同時使得載體自身具有藥效，進一步逆轉腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中的免疫抑制環(huán)境。

圖8 小鼠腫瘤組織中CD206 和CD86 的免疫熒光染色 (比例尺為100 μm)Fig.8 Immunofluorescence staining for CD206 and CD86 in tumor tissues of mice (scale bar is 100 μm)

2.8 Tr@GLN 和Tr@CLN 的體內生物安全性考察

考慮到Tr 具有嚴重毒性，治療結束后，收集各組小鼠主要組織器官（心、肝、脾、肺、腎），經多聚甲醛固定后制成石蠟切片，進行HE 染色，檢測器官毒性。結果如圖9 所示，結果顯示，游離Tr 組肝臟組織病理學病變較對照組更嚴重，表現為肝細胞變性，細胞腫脹，胞質疏松淡染，淋巴細胞呈灶性浸潤。然而，Tr@GLN 組的病變較輕，這表明肝損傷是由游離Tr 給藥引起的，所制備的制劑減少了Tr 毒性，體內安全性較好。

圖9 各組小鼠心、肝、脾、肺、腎的HE 染色 (比例尺為100 μm)Fig.9 HE staining of heart,liver,spleen,lung,and kidney of mice in each group (scale bar is 100 μm)

3 討論

納米藥物遞送系統近年來在癌癥治療方面取得了顯著成果。藥物經納米粒遞送，可有效改善藥物自身性質，增加藥物在腫瘤組織的分布，延長藥物在生物體內的滯留時間。然而，當2 種藥物共遞送時存在基質效應和競爭關系，物理包載方式很難實現2 種藥物高包封率，藥物比例難以穩(wěn)定，而化學鍵合的方式，制備工藝復雜，難以實現轉化。因此，亟需探索一種新的藥物共載納米遞藥體系的構建方式和思路。

“藥輔合一”是中藥制劑學中獨特的用藥理念、制藥經驗與哲學智慧。將藥物作為納米材料或替代原有材料的一部分，開發(fā)“藥輔合一”的新型納米遞藥系統有望解決這一難題。例如將中藥活性成分白及多糖進行改性得到兩親性結構，在水中自組裝形成負載多西紫杉醇的納米粒，與人工合成的聚合物相比，天然多糖顯示出許多有益的生物特性，包括無毒、生物降解性和非免疫原性同時通過抑制腫瘤細胞增殖抗腫瘤[37]。除多糖外，生物大分子核酸因其尺寸小、結構穩(wěn)定而靈活、編碼性強、易于操作等優(yōu)勢，使其既可以作為納米載體又可以作為核酸藥物來解決生命科學中的重要問題[38]。

本研究立足于目前研究最深入、產業(yè)化最成熟的納米遞藥載體脂質體[39]，利用甘草酸替代傳統脂質體的膜穩(wěn)定劑膽固醇，制備“藥輔合一”的新型脂質納米粒，解決了傳統脂質體靶向效率低、難以完全治療復雜的TME、膽固醇帶來的不良反應等問題[40-42]。然而本研究所制備的GLN 仍然可能存在一些不足：（1）甘草酸作為一種皂苷類成分，存在一定溶血性，將其制備為脂質體是否能減少其帶來的溶血性亟需實驗證明。（2）研究發(fā)現，脂質體的快速清除與網狀內皮系統（reticuloendothelial system，RES）的不可逆攝取有關[43]。脂質體進入生物介質后，脂質體迅速與各種蛋白質結合形成蛋白冠，被RES 識別和捕獲，使得到達腫瘤部位的藥物減少[44-45]。因此，GLN 相比普通脂質體是否能減少蛋白冠的形成，需要進一步驗證。（3）Tr@GLN 還需要進一步研究在體外的抗腫瘤作用及機制。（4）GLN 能夠增加肝癌HepG2 細胞對藥物的攝取，但對于其體內的靶向能力還需后續(xù)實驗證明。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突