湯書婉，李新亮，馬 莉，鄭云楓*，李存玉，成小蘭，曹 鵬,，彭國(guó)平*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000

2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210000

加味黃芪桂枝五物湯（Jiawei Huangqi Guizhi Wuwu Decoction，JHD）是由經(jīng)典名方黃芪桂枝五物湯與芍藥甘草湯衍化而來，由黃芪、桂枝、生姜、大棗、白芍、甘草6 味藥組成。具有益氣溫經(jīng)、和血通痹之功效，主治血痹陰陽俱微、寸口關(guān)上微、尺中小緊、外證身體不仁，如風(fēng)痹狀[1]。現(xiàn)代研究表明，該方能顯著預(yù)防化療藥物奧沙利鉑引起的外周神經(jīng)病變，有效保護(hù)外周神經(jīng)元線粒體穩(wěn)態(tài)，降低化療引起的神經(jīng)元損傷[2-3]，減輕腫瘤患者在臨床治療時(shí)的疼痛，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

JHD 組方中涉及的藥味較多，成分復(fù)雜[4-5]，增加了質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)建立的難度。物質(zhì)基礎(chǔ)是制劑質(zhì)量控制的關(guān)鍵[6]，通過指標(biāo)成分的含量檢測(cè)或特征圖譜的單一手段，難以體現(xiàn)復(fù)方制劑質(zhì)量控制體系的科學(xué)性和全面性[7-8]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有高效、高分辨率、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的化學(xué)成分分析。本研究基于HPLC 建立了JHD 的指紋圖譜，同時(shí)采用LC-Q-TOF/MS 技術(shù)，結(jié)合對(duì)照品指認(rèn)與文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)指紋圖譜中的共有峰進(jìn)行定性鑒別，進(jìn)一步對(duì)各共有成分的歸屬進(jìn)行了解析，以期為JHD 的新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀、2998 PDA 檢測(cè)器（美國(guó)Waters 公司）；AB SCIEX Triple TOFTM5600 型高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX 公司）；SCIENTZ-10ND 型真空冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；梅特勒MS-105DU 1/10 萬電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TG16 A-WS型離心機(jī)（南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司）；DW-0.25K 型智能數(shù)顯恒溫電熱套（南通市通州暢通電熱器廠）。

1.2 材料

對(duì)照品毛蕊異黃酮苷（批號(hào)111920-201606，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.6%）、芒柄花素（批號(hào)111703-201504，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.5%）、黃芪甲苷（批號(hào)110781-201717，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.9%）、桂皮醛（批號(hào)110710-201821，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、甘草苷（批號(hào)111610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、甘草酸銨（批號(hào)110731-201619，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.0%）、6-姜辣素（批號(hào)111833-201806，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、8-姜酚（批號(hào)111993-201601）、10-姜酚（批號(hào)111994-201501）、芍藥苷（批號(hào)110736-201943，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.1%）均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品毛蕊異黃酮（批號(hào)JBZ-0786）、芒柄花苷（批號(hào)JBZ-0778）、黃芪皂苷I（批號(hào)JBZ-0501）、異甘草苷（批號(hào)JBZ-1503）、芹糖甘草苷（批號(hào)JBZ-1725）、芹糖異甘草苷（批號(hào)JBZ-0996）均購自南京金益柏生物科技有限公司（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；丙二酰毛蕊異黃酮苷、丙二酰芒柄花苷、丙二酰黃芪皂苷I、烏拉爾皂苷B、甘草皂苷G2 均由實(shí)驗(yàn)室前期分離純化獲得[9-10]，經(jīng)HPLC 分析，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia 公司）；甲酸（色譜純，德國(guó)Merck公司）；超純水（Milli-Q超純水系統(tǒng)制備）；其余試劑均為分析純。

6 種飲片均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝副教授鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus (Bge.)Hsiao 的干燥根；桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥嫩枝；白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根；生姜為姜科植物姜Zingiber officinaleRose.的新鮮根莖；大棗為鼠李科植物棗Ziziphus jujubeMill.的干燥成熟果實(shí)；甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。并依照《中國(guó)藥典》2020 年版各項(xiàng)下方法檢測(cè)，飲片質(zhì)量均符合規(guī)定，樣品信息見表1。

表1 藥材產(chǎn)地及批號(hào)Table 1 Batch number of origin of medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 采用Hypersil ODS 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.2%甲酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫程序?yàn)椋?～25 min，15%～32%A；25～60 min，32%～70% A；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源（ESI），采用正、負(fù)離子模式檢測(cè)；掃描范圍m/z50～1500；噴霧電壓5500 V；離子噴霧空載電壓5500 V；解簇電壓100 V；碰撞能量10 V；離子源溫度550 ℃；霧化器壓力413 kPa；輔助加熱器壓力413 kPa；氣簾氣壓力275 kPa。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、芒柄花苷、丙二酰毛蕊異黃酮苷、丙二酰芒柄花苷、丙二酰黃芪皂苷I、黃芪皂苷I、黃芪甲苷、桂皮醛、甘草苷、甘草酸銨、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、芍藥苷、異甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、烏拉爾皂苷B、甘草皂苷G2 適量，精密稱定，加甲醇適量，混勻，配制成混合對(duì)照品母液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取黃芪90 g、生姜45 g、桂枝45 g、白芍45 g、大棗45 g、甘草30 g，回流提取2 次，第1 次加入10 倍量水，提取2 h，濾過；第2 次加入8 倍量水，提取1 h，濾過，合并濾液。60 ℃減壓濃縮至含生藥2 g/mL，真空冷凍干燥12 h，粉碎成中粉。精密稱取凍干粉末1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率240 W、頻率45 kHz）15 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取S1 號(hào)樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以19號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積作為參考，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。20 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 小于1%，相對(duì)峰面積的RSD 小于3%，表明儀器和試驗(yàn)方法精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1 號(hào)樣品6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，以19 號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積作為參考，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。20 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 小于1%，相對(duì)峰面積的RSD 小于5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1 號(hào)樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 內(nèi)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以19 號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積作為參考，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。20 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 小于1%，相對(duì)峰面積的RSD 小于3%，說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 共有峰標(biāo)記 以“2.3”項(xiàng)下方法制備的10批JHD 供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2012 版軟件進(jìn)行分析，共選取20 個(gè)共有峰，對(duì)照?qǐng)D譜采用“中位數(shù)”法生成，使用多點(diǎn)校正對(duì)色譜峰進(jìn)行匹配。JHD 的HPLC 對(duì)照指紋圖譜見圖1，10 批供試品溶液的指紋圖譜見圖2。

圖1 JHD 的HPLC 對(duì)照指紋圖譜Fig.1 Reference HPLC fingerprint of JHD

圖2 10 批JHD 的HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 10 batches of JHD

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 10 批JHD 與對(duì)照指紋圖譜相似度分別為0.920～0.990，具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 10 批JHD 的指紋圖譜相似度Table 2 HPLC fingerprints of 10 batches of JHD

2.5.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 按“2.3”項(xiàng)下方法制備的各單味藥供試品溶液，以及缺少各單味藥的陰性供試品溶液（S1 中各批次單味藥及陰性樣品），以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，見圖3，通過比對(duì)其保留時(shí)間、陰性樣品色譜圖，確定JHD 指紋圖譜中的20 個(gè)特征峰在6 味藥材中的歸屬，并與混合對(duì)照品溶液比對(duì)，確定了其中11 個(gè)成分，其中3（毛蕊異黃酮苷）、7（丙二酰毛蕊異黃酮苷）、11（芒柄花苷）號(hào)峰來源于黃芪；9、12、13、14（桂皮醛）、17 號(hào)峰來源于桂枝；1、2（芍藥苷）、6、8號(hào)峰來源于白芍；4（芹糖甘草苷）、5（甘草苷）、10（芹糖異甘草苷）、15、16、18（甘草皂苷G2）、19（甘草酸）、20（烏拉爾甘草B）號(hào)峰來源于甘草。

圖3 單味藥與JHD 的HPLC 指紋圖譜對(duì)比Fig.3 Comparison of HPLC fingerprints of single herb and JHD

2.6 質(zhì)譜定性分析

為了更為全面地解析JHD中化學(xué)成分的組成，采用LC-Q-TOF/MS 正、負(fù)離子模式獲得JHD 指紋圖譜中化合物的質(zhì)譜信息見圖4，并采用對(duì)照品對(duì)色譜峰進(jìn)行確認(rèn)，同時(shí)結(jié)合處方中各藥材化學(xué)成分研究相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[11-17]，建立了各單味藥成分的化合物數(shù)據(jù)庫，共鑒定了70 個(gè)化合物，見表3。

圖4 JHD 的正離子 (A) 和負(fù)離子 (B) BPI 圖Fig.4 Base peak intensity (BPI) diagram of positive (A) and negative (B) of JHD

表3 JHD 中化學(xué)成分定性分析Table 3 Qualitative analysis of chemical constituents of JHD

續(xù)表3

續(xù)表3

選擇代表性化合物對(duì)成分結(jié)構(gòu)鑒定過程進(jìn)行解析。其中，黃酮類化合物在正離子模式下響應(yīng)較高，同時(shí)可以檢測(cè)到豐富二級(jí)碎片離子峰，進(jìn)一步依據(jù)它們的準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。以15 號(hào)峰（tR=10.744 min）毛蕊異黃酮苷為例，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z447.130 3 [M+H]+，在誤差范圍內(nèi)計(jì)算得到的分子式為C22H22O10，在二級(jí)質(zhì)譜圖中，可見碎片離子m/z285.070 6 [M+H-Glc]+，再失去B 環(huán)上CH3得到m/z270.052 1[M+H-Glc-CH3]+，或失去1 分子 -CH3OH 得到m/z253.048 7 [M+H-Glc-CH3OH]+，其裂解規(guī)律如圖5 所示。

圖5 毛蕊異黃酮苷在正離子模式下裂解規(guī)律圖Fig.5 Fragmentation of mass spectra of calycosin-7-glucoside in positive ion mode

三萜皂苷類化合物具有多氫蒎的五環(huán)母核，以峰46 甘草皂苷G2 為例，在正離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z839.407 4 [M+H]+，確定其分子式為C42H62O17，進(jìn)一步在其二級(jí)質(zhì)譜圖中，從分子離子峰失去1 分子葡萄糖醛酸基及同時(shí)失去2 分子葡萄糖醛酸基，形成m/z663.377 6 [M+H-GlcA]+及苷元碎片離子m/z487.341 9 [M+H-2GlcA]+，苷元碎片離子m/z487.341 9 由于結(jié)構(gòu)中3-OH 的性質(zhì)活潑，很容易失去H2O 形成基峰 [B]+，相對(duì)分子質(zhì)量為m/z469.330 9 [aglycone+H-H2O]+，進(jìn)一步同時(shí)或連繼丟失中性分子H2O 及CH2O，形成碎片離子m/z451.321 6 [B-H2O]+及m/z439.321 9 [BCH2O]+，其裂解規(guī)律見圖6。

圖6 甘草皂苷G2 在正離子模式下裂解規(guī)律Fig.6 Fragmentation of mass spectra of licorice saponin G2 in positive ion mode

芍藥苷（峰14）是白芍中一類蒎烷單萜苷，在JHD 中含量相對(duì)較高，其在負(fù)離子模式下，呈現(xiàn)加甲酸的準(zhǔn)分子離子峰m/z525.159 1 [M+HCOO]-，二級(jí)質(zhì)譜圖中見m/z479.154 2 [M-H]-，以及失去1 分子甲醛形成的碎片離子m/z449.142 8 [M-HCH2O]-，進(jìn)一步可分別形成苯甲酸碎片離子峰m/z121.030 0 及失去苯甲酸的m/z327.108 2 [M-HCH2O-C7H6O2]-碎片離子；而m/z165.054 6 碎片離子則為蒎烷結(jié)構(gòu)所形成的特征碎片離子，其裂解規(guī)律見圖7。

圖7 芍藥苷在負(fù)離子模式下裂解規(guī)律Fig.7 Fragmentation of mass spectra of paeoniflorin in negative ion mode

3 討論

10 批JHD 指紋圖譜中，不同批次樣品之間的相似度波動(dòng)范圍較大，從各樣品的指紋圖譜中，可以發(fā)現(xiàn)峰12、13 具有明顯差異，成分歸屬結(jié)果顯示峰12 與峰13 來源于桂枝。進(jìn)一步分析樣品來源發(fā)現(xiàn)，S1～S3 號(hào)樣品中所用的桂枝來自廣西省貴港市，其余樣品中的桂枝均來自廣西省北海市。除產(chǎn)地差異外，桂枝藥材商品規(guī)格等級(jí)也不同，貴港市的為桂枝中粒，北海市的為桂枝小粒，而不同規(guī)格等級(jí)的藥材，其活性成分的含量存在差異[18-19]。因此，在中藥方劑以及中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中，需要保證所用的原藥材的質(zhì)量穩(wěn)定可靠[20]，嚴(yán)格控制藥材的來源以及所采用的規(guī)格等級(jí)，從而能夠提高中藥方劑與中成藥藥效的穩(wěn)定性。

JHD 指紋圖譜研究中標(biāo)定出20 個(gè)共有峰，均明確了其相應(yīng)藥味的歸屬，其中源于桂枝的共有峰9、12、13、14（桂皮醛）、17 在質(zhì)譜中未被檢測(cè)到。這可能是因?yàn)楣鹌と┑瘸煞志哂休^強(qiáng)的揮發(fā)性，成分在進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)經(jīng)電噴霧離子化加熱過程中因揮發(fā)而損失，因此未能體現(xiàn)在質(zhì)譜信息中，相關(guān)文獻(xiàn)也報(bào)道了類似的結(jié)果[21]。

在JHD 質(zhì)譜鑒定的70 個(gè)成分中，來自黃芪和甘草飲片中的成分多為黃酮類（28 個(gè)）及三萜類（23個(gè)）化合物，白芍中以單萜苷類（5 個(gè)）及有機(jī)酸類化合物（5 個(gè)）為主，生姜中主要以姜辣素類（5個(gè)）成分為主，而大棗中鑒定出的化合物相對(duì)較少，可能是由于大棗中主要功效物質(zhì)為大極性的糖類組分，質(zhì)譜鑒定存在一定困難。此外，質(zhì)譜圖中一些響應(yīng)較好的成分如黃芪甲苷由于結(jié)構(gòu)中沒有共軛體系，紫外吸光系數(shù)低，因而在HPLC-UV 指紋圖譜中未能體現(xiàn)。黃芪為方中的君藥，其皂苷類化合物具有抗菌、強(qiáng)心、免疫調(diào)節(jié)等作用[22]，因此可針對(duì)這些皂苷類成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，建立HPLC-ELSD 指紋圖譜或多成分含量測(cè)定，完善對(duì)JHD 的質(zhì)量控制。

本研究中采用的質(zhì)譜檢測(cè)方法其靈敏度高，依據(jù)豐富的質(zhì)譜信息結(jié)合對(duì)照品及文獻(xiàn)，能夠鑒定出較多的化學(xué)成分，可以較為全面地反映JHD 中的化學(xué)成分信息；而HPLC 指紋圖譜是目前控制中藥復(fù)方整體質(zhì)量的常用方法，儀器設(shè)備相對(duì)于質(zhì)譜來說可及性較好，比較適用于常規(guī)分析與檢驗(yàn)，二者相結(jié)合，既可從總體上反映JHD 中所含化學(xué)成分的信息，又體現(xiàn)了處方中各藥味在方中的貢獻(xiàn)，為其質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突