徐 欣, 吳玉嬌, 于 濱, 孟憲志, 陳 杰,劉中文, 張永君, 潘國慶,*

(1.西南大學(xué), 微孢子蟲感染與防控重慶市重點實驗室, 重慶 400715; 2. 河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院, 鄭州 450008)

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases, GSTs)廣泛分布于哺乳動物、植物、鳥類、昆蟲、寄生蟲及微生物體內(nèi),不僅能催化生物體內(nèi)有害的極性化合物與谷胱甘肽(glutathione, GSH)相結(jié)合,而且也可促使體內(nèi)各種具有潛在毒性的化學(xué)藥物、染料及某些致癌物排出體外(Ketterer, 2001; Sheehanetal., 2001)。GSTs表達增加可能有2種機制:mRNA水平的提高和基因擴增,但基因擴增僅有少量報道(Wangetal., 1991; Zhou and Syvanen, 1997; Vontasetal., 2002)。目前已有少量確切的證據(jù)可證明GSTs的過量表達與抗性有關(guān)。如小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaPxGST3基因所編碼的酶可以降解有機磷殺蟲劑,它的表達量增加與抗性有關(guān)(Huangetal., 1998)。MdGST6A在家蠅Muscadomestica的有機磷殺蟲劑抗性品系中過量表達,重組酶可以與甲基對硫磷和林丹共軛(Weietal., 2001)。果蠅Drosophila的GSTd1基因在DDT抗性品系中表達量增加,重組GSTd1有DDT脫氯化氫酶活性(Tangetal., 1995)。Ranson等(2001)研究發(fā)現(xiàn)在岡比亞按蚊Anophelesgambiae抗性品系中Ⅲ類 GST aggst322過量表達5倍,表達的重組酶可以降解DDT。

目前哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了8類細胞質(zhì)GSTs 亞基(alpha, mu, pi, theta, sigma, zeta, kappa和omega)和1類微粒體GSTs亞基(馬曉英等, 2007)。omega家族GST具有谷胱甘肽過氧化物酶以及巰基氧化還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶活力,參與昆蟲體內(nèi)氧化脅迫修復(fù)過程,是昆蟲抗氧化酶系統(tǒng)中的重要成員(張學(xué)堯等, 2012)。Yamamoto等(2005, 2009)對家蠶Bombyxmoriomega家族GST的分子及生化特性進行了研究,發(fā)現(xiàn)其參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng),并與家蠶對有機磷殺蟲劑殺螟松的抗性相關(guān),在家蠶完成外源物質(zhì)解毒過程中起重要作用。

維生素C(vitamin C, VC),又稱為抗壞血酸(L-ascorbic acid, AsA),在抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase, AAO)和抗壞血酸過氧化酶(ascorbate peroxidase, APX)作用下脫氫被氧化成單脫氫抗壞血酸(monodehydroascorbate, MDHA)和脫氫抗壞血酸(dehydroascorbate, DHA),又分別在單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase, MDAR)和脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase, DHAR)作用下重新被還原成VC,使得VC得以再生(劉永立等, 2006)。其中,DHAR與MDAR一樣是使抗壞血酸再生的酶,DHAR在家蠶中的預(yù)測同源基因是GST基因(楊洋等, 2016),在家蠶中的已有研究認為此基因是noppera-bo,參與家蠶蛻皮激素的合成和幼蟲的發(fā)育,當此基因缺失時會導(dǎo)致幼蟲的生長發(fā)育抑制以及角質(zhì)層為光滑的表現(xiàn)(Enyaetal., 2015; Waltersetal., 2009)。

結(jié)合本團隊感病后柞蠶Antheraeapernyi卵的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),柞蠶GST基因是作為感病后柞蠶體內(nèi)表達差異較大的一種基因,同時其作為VC代謝通路的關(guān)鍵酶,在柞蠶研究中尚未被克隆。因此,本研究在家蠶GST各基因及編碼的蛋白質(zhì)的研究基礎(chǔ)上,在柞蠶中克隆GST基因,并進行生物信息學(xué)分析,分析其結(jié)構(gòu)和其他昆蟲GSTs的進化關(guān)系,同時檢測柞蠶GST基因在柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶產(chǎn)卵0-10 d時卵中的表達量變化,獲得柞蠶GST基因的基本特性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

柞蠶品種為豫大一號,由河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院繁育提供。

1.2 主要試劑和儀器

動物組織總RNA提取試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit,FastQuant cDNA第1鏈合成試劑盒FastQuant RT Kit(with gDNase),質(zhì)粒提取試劑盒,凝膠回收試劑盒,2×Taq PCR MasterMix,FastFire 快速熒光定量 PCR 預(yù)混試劑(SYBR Green),瓊脂糖,GeneGreen核酸染料均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。試驗中所需的限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶、高保真酶、大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細胞DH5α、載體 pMD-18T、pET28a等均購自TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。引物合成與基因測序工作委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。大腸桿菌用培養(yǎng)基及其他常用試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

TGL16M高速冷凍離心機,購自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司;PCR儀(9200型),購自Applied Biosystems公司;超微量分光光度計,購自美國Thermo Scientific公司;1600凝膠成像儀,購自上海天能科技有限公司;超聲波破碎儀,購自寧波新芝生物科技股份有限公司;電泳電源、電泳槽、水平搖床,購自北京市六一儀器廠。

1.3 感染柞蠶微孢子蟲后柞蠶卵轉(zhuǎn)錄組及數(shù)據(jù)分析

取同一批柞蠶蛹,隨機選取鏡檢攜帶柞蠶微孢子蟲的母蛾10頭,未感染柞蠶微孢子蟲正常母蛾10頭作為對照,待產(chǎn)卵后,將柞蠶卵進行表面消毒,從中各隨機選取柞蠶卵200粒作為1個重復(fù),每組3個重復(fù),放入液氮中保存?zhèn)溆?。用DEPC水把研缽、剪刀、鑷子等用具洗干凈,放在恒溫干燥箱內(nèi),160 ℃烘烤4 h備用。再使用動物組織總RNA提取試劑盒,按照其說明書方法從正常對照柞蠶卵和感染柞蠶卵中分別提取總RNA,置于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

用mRNA富集法或rRNA去除法對總RNA進行處理(mRNA富集:用帶有OligodT的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA;rRNA去除:用DNA探針雜交rRNA),RNaseH選擇性消化DNA/RNA雜交鏈,再用DNaseⅠ消化掉DNA探針,純化后即得到所需RNA;用打斷Buffer把獲得的RNA片段化,隨機的N6引物進行反轉(zhuǎn)錄,再合成cDNA二鏈形成雙鏈DNA;把合成的雙鏈DNA末端補平并5′端磷酸化,3′端形成突出一個“A”的粘末端,再連接一個3′端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭;連接產(chǎn)物通過特異的引物進行PCR擴增;PCR產(chǎn)物熱變性成單鏈,再用一段橋式引物將單鏈DNA環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA文庫;上機測序。

過濾掉低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的原始讀段,過濾后獲得有效讀段。然后將有效讀段比對到柞蠶參考基因組上進行新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測、SNP &InDel和差異剪接基因檢測。得到新轉(zhuǎn)錄本之后,將具有蛋白編碼潛力的新轉(zhuǎn)錄本加入到柞蠶參考基因組序列中構(gòu)成一個完整的參考序列,然后計算基因表達量。最后,對于多個樣品根據(jù)需求檢測不同樣品之間的差異表達基因,并對差異表達基因做深入的聚類分析和功能富集分析。

根據(jù)GO功能注釋結(jié)果以及官方分類,將差異表達基因進行功能分類,同時使用R軟件中的phyper函數(shù)進行富集分析,計算P值,然后對P值進行 FDR校正, 校正后的P值又稱Q值,通常Q≤0.05的功能視為顯著富集,以Q值最小的前20個GO功能條目作圖。富集氣泡圖從3個維度展示GO功能條目的富集程度,默認以Q值最小的前20個GO功能條目或按照選擇的GO功能條目(按Q值排序,最多60個)作圖。

根據(jù)KEGG注釋結(jié)果以及官方分類,將差異表達基因進行生物通路分類,其余處理同GO功能注釋。

1.4 免疫相關(guān)基因ApGSTo1的克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)1.3節(jié)轉(zhuǎn)錄組中差異表達基因分析結(jié)果,選擇保守結(jié)構(gòu)區(qū)域,結(jié)合PCR引物設(shè)計原則,用Primer Premier 5.0設(shè)計ApGSTo1特異引物(表1),并選擇ApA(AntheraeapernyiActin)為內(nèi)參基因(表1),其退火溫度為50 ℃,循環(huán)數(shù)為30。

表1 引物信息Table 1 Primer information

使用動物組織總RNA提取試劑盒,按照其說明書方法從感染柞蠶微孢子蟲的柞蠶蛹中提取總RNA,按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書的步驟將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA, PCR反應(yīng)體系: 2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL, 正反向引物(10 μmol/L) 各1 μL, cDNA 1 μL, ddH2O加至25 μL。反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性10 min; 94 ℃變性30 s, 50 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共35個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,回收目的片段,回收產(chǎn)物與pMD18-T載體在16 ℃過夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選,隨機挑取白色菌落進行菌落鑒定,篩選出陽性克隆,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序鑒定。

柞蠶ApGSTo1信號肽及跨膜區(qū)分析使用在線軟件SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/),并運用PSIPRED網(wǎng)站(http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipre.html)進行二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測。蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測利用在線軟件SWISS-MODEL(https: ∥swissmodel.expasy.org/)。為研究柞蠶ApGSTo1蛋白與在鱗翅目不同昆蟲omega家族GST之間的進化關(guān)系,本研究利用果蠅基因組數(shù)據(jù)庫(FlyBase)、家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(Silkworm Genome Database),運用SnapGene軟件和NCBI等數(shù)據(jù)庫,選取已報道的鱗翅目不同昆蟲GSTo1的氨基酸序列,與柞蠶ApGSTo1氨基酸序列用SnapGene軟件進行多序列比對,并用MEGA 11.0軟件分析系統(tǒng)進化關(guān)系。

1.5 感染柞蠶微孢子蟲柞蠶卵不同發(fā)育階段ApGSTo1表達量的RT-qPCR檢測

隨機選取鏡檢感染柞蠶微孢子蟲母蛾20頭,未感染的正常母蛾20頭,待產(chǎn)卵后分成感染組和正常對照組兩組,置于室溫25 ℃的柞蠶卵孵化室進行正常孵化發(fā)育,在柞蠶卵從母蛾體內(nèi)產(chǎn)出的0-10 d的時間內(nèi),每天從兩個組中隨機選取蠶卵50粒,將蠶卵進行表面消毒,放入液氮中保存?zhèn)溆?。?0 d兩個組的樣品取完后,提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,方法同1.3節(jié)。

根據(jù)克隆測序得到的ApGSTo1序列,選擇保守結(jié)構(gòu)區(qū)域,結(jié)合RT-qPCR引物設(shè)計原則,用Primer Premier 5.0設(shè)計ApGSTo1的RT-qPCR特異引物(表1),目的片段長度為223 bp;ApA為內(nèi)參基因,設(shè)計其qRT-PCR特異引物(表1),目的片段長度為134 bp。根據(jù)FastFire 快速熒光定量 PCR 預(yù)混試劑(SYBR Green)的實驗方法進行qRT-PCR。反應(yīng)程序: 95 ℃ 1 min; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 10 s, 72 ℃ 15 s, 循環(huán)數(shù)為40。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用 2-ΔΔCt法進行基因相對表達量分析。采用 GraphPad Prism 軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖,并用SPSS 26.0數(shù)據(jù)分析軟件單因素方差分析(one-way ANOVA)進行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 感染柞蠶微孢子蟲后柞蠶卵轉(zhuǎn)錄組差異表達基因的GO功能注釋

將感染柞蠶微孢子蟲與未感染的正常對照組的柞蠶卵進行對比,每組3個重復(fù),在6個樣品的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中,預(yù)測的新基因為3 400個;共檢測到的表達基因數(shù)為17 453,其中已知的基因為 14 152個,預(yù)測的新基因為3 301個。其中,在轉(zhuǎn)錄本的長度分布分析中發(fā)現(xiàn)超過3 000 nt序列長度的基因數(shù)量最多,將近3 500個,其他長度區(qū)間的基因數(shù)量在1 000以下,分布較均勻。同時,根據(jù)各個樣品基因表達水平,檢測到的顯著差異表達基因數(shù)目為89個。對每個比較組差異基因的FPKM值進行聚類,用熱圖顯示如圖1。

圖1 感染柞蠶微孢子蟲后柞蠶卵轉(zhuǎn)錄組中差異表達基因表達聚類熱圖Fig. 1 Expression clustering heatmap of differentiallyexpressed genes in the transcriptome of Antheraea pernyieggs after infection with Nosema pernyiLW1A, LW2A, LW3B: 感染柞蠶微孢子蟲后柞蠶卵組The groups of A. pernyi eggs infected with N. pernyi.

將感染柞蠶微孢子蟲后的柞蠶卵與正常對照組的柞蠶卵差異表達基因進行GO功能注釋,在生物學(xué)過程(biological process)類別中注釋到細胞過程(cellular process)和代謝過程(metabolic process)的基因數(shù)量最多;細胞組分(cellular component) 類別中注釋到細胞解剖實體(cellular anatomical entity)的基因數(shù)量最多;分子功能(molecular function) 類別中注釋到催化活性(catalytic activity)的基因數(shù)量最多,而且是所有分類中基因數(shù)量最多的一項,約19個(圖2)。

圖2 感染柞蠶微孢子蟲后柞蠶卵轉(zhuǎn)錄組中差異表達基因的GO功能注釋Fig. 2 GO functional annotation of differentially expressed genes in the transcriptome of Antheraea pernyi eggs after infection with Nosema pernyi

從差異表達基因GO富集氣泡圖(圖3)中看出,顯著性較高的差異表達基因大多數(shù)屬于各種代謝過程(metabolic process),但是富集因子數(shù)值小,說明在通路中富集顯著性的可靠度較低。富集到細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分(extracellular matrix structural constituent)和膠原三聚體(collagen trimer)的基因數(shù)量也較多,顯著性和富集因子數(shù)值也較高。

圖3 感染柞蠶微孢子蟲后柞蠶卵轉(zhuǎn)錄組中差異表達基因GO富集氣泡Fig. 3 GO enrichment bubble diagram of differentially expressed genes in the transcriptome of Antheraea pernyi eggs after infection with Nosema pernyi

2.2 感染柞蠶微孢子蟲后柞蠶卵轉(zhuǎn)錄組差異表達基因的KEGG注釋

根據(jù)KEGG注釋結(jié)果以及官方分類,將感染柞蠶微孢子蟲后的柞蠶卵與正常對照組的柞蠶卵轉(zhuǎn)錄組中差異表達的基因進行生物通路分類,分為細胞過程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、代謝(metabolism)和生物體系統(tǒng)(organismal systems)共5個分支。細胞過程的通路中參與運輸和分解代謝(transport and catabolism)的基因數(shù)量最多,環(huán)境信息處理的通路中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)的基因最多,遺傳信息處理的通路中參與翻譯(translation)的基因最多,代謝中參與全局和概述圖譜(global and overview maps)的基因數(shù)量最多,生物體系統(tǒng)中參與消化系統(tǒng)(digestive system)的基因最多。與GO側(cè)重于單個基因的功能分析相比,KEGG分析則側(cè)重于尋找和分析生物體系統(tǒng)中基因之間的相互作用,在感染柞蠶微孢子蟲后差異基因的KEGG分析中,參與運輸和分解代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和消化系統(tǒng)這3個通路的基因數(shù)量都達到12個,都是后期重點篩選的通路。

KEGG通路的富集氣泡圖(圖5)中,生熱作用(thermogenesis)、蛋白質(zhì)消化和吸收(protein digestion and absorption)兩個通路聚集的基因數(shù)目較多,顯著性也高。結(jié)合差異基因表達量的結(jié)果,log2FC值為7.501,根據(jù)KEGG的id號,匹配到的為Tudor結(jié)構(gòu)域蛋白;根據(jù)表達量差異值的排序,依次匹配的為:MFS轉(zhuǎn)運蛋白、RB1誘導(dǎo)型卷曲螺旋蛋白、溶質(zhì)載體PCFT/HCP系列蛋白、醛脫氫酶、溶酶體酸性脂肪酶/膽固醇酯水解酶、WD重復(fù)和FYVE結(jié)構(gòu)域蛋白、BRG1相關(guān)因子、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶,其中GSTs排第12位,log2FC值為3.979,主要參與谷胱甘肽代謝過程。然后,在差異最顯著的基因中尋找與昆蟲抗逆相關(guān)的目標基因,發(fā)現(xiàn)GST基因在昆蟲和家蠶中均有參與氧化脅迫修復(fù)過程、抗性相關(guān)、完成外源物質(zhì)解毒作用過程等相關(guān)研究結(jié)果,因此將GST基因作為目標基因進行下一步試驗。

圖5 感染柞蠶微孢子蟲后柞蠶卵轉(zhuǎn)錄組中差異表達基因 KEGG通路富集氣泡Fig. 5 Enrichment bubble diagram of KEGG pathways of differentially expressed genes in the transcriptome of Antheraea pernyi eggs infected with Nosema pernyi

2.3 ApGSTo1的克隆與序列

PCR獲得ApGSTo1的cDNA序列(GenBank登錄號: OP661169.1),編碼區(qū)全長767 bp,編碼254個氨基酸。在SMART程序中搜索到ApGSTo1的5個蛋白結(jié)構(gòu)域(GST_N, GST_N_3, GST_N_2, GST_C_3和GST_C_2),這5種組合形成6種柞蠶ApGSTo1的預(yù)測結(jié)構(gòu),其中2種蛋白結(jié)構(gòu)域組成為:GST_N(第17-90位氨基酸)和GST_C_2(第121-205位氨基酸)。還有GST_N_3, GST_N_2, GST_C_3這3種蛋白結(jié)構(gòu)域。同時還有未顯示的其他6種蛋白結(jié)構(gòu)域(Glutaredoxin, Tom37, GST_N_4, GST_C, GST_C_6和Tom37),以及3種SMART區(qū)域(Amelogenin, GIT和MHC_II_alpha)。

在PSIPRED網(wǎng)站上柞蠶GSTo1的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示,該序列中存在12個α螺旋和4個β折疊,在 N 端存在1個β-α-β-α-β-β-α的結(jié)構(gòu)基元,如圖6所示。

圖6 柞蠶ApGSTo1的氨基酸序列及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 6 Prediction of amino acid sequence and secondary structure of ApGSTo1 of Antheraea pernyi

將柞蠶ApGSTo1序列提交到SWISS-MODEL服務(wù)器構(gòu)建模擬結(jié)構(gòu),系統(tǒng)對該模型的QMEANscore4評分值為為0.78,如圖7(A)。模擬結(jié)構(gòu)中柞蠶GSTo1與家蠶omega家族GST晶體結(jié)構(gòu)(圖7: A, B)相似性為41.95%, 與人omega家族GST晶體結(jié)構(gòu)(圖7: A, C)相似性為33.77%,結(jié)果顯示其擁有典型的omega家族GST特征,N端結(jié)構(gòu)域由4個β折疊和3個α螺旋組成,C端結(jié)構(gòu)域由8個α螺旋組成,二級結(jié)構(gòu)元件相互之間以轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲相互連接,這表明柞蠶GSTo1在蛋白整體結(jié)構(gòu)上與omega家族GST結(jié)構(gòu)類似。

圖7 柞蠶ApGSTo1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 7 Protein structure prediction of ApGSTo1 of Antheraea pernyiA: 柞蠶GSTo1晶體結(jié)構(gòu)GSTo1 crystal structure of A. pernyi; B: 家蠶omega家族的GST晶體結(jié)構(gòu)Omega-class GST crystal structure of Bombyx mori; C: 人omega 家族的GST晶體結(jié)構(gòu)Omega-class GST crystal structure of Homo sapiens.

由圖8可知,所有序列聚為3個大類,柞蠶ApGSTo1(GenBank登錄號: OP661169.1)聚類在GSTo1一組,證明ApGSTo1屬于omega 1家族GST,并與家蠶GSTo1被聚到一個分支中,表明親緣關(guān)系最近;在GSTo1分組中,從遺傳距離來看,鱗翅目夜蛾科的甜菜夜蛾Spodopteraexigua、斜紋夜蛾S.litura和草地貪夜蛾S.frugiperda的 GSTo1遺傳聚類最遠;其他兩個Omega家族的序列分別聚類為GSTo2和GSTo3組,且GSTo2與GSTo1組分為一個支,GSTo3單獨分支,說明GSTo1與GSTo2家族的親緣關(guān)系較近。

圖8 基于氨基酸序列構(gòu)建的柞蠶ApGSTo1與不同鱗翅目昆蟲omega家族的GSTs的系統(tǒng)進化樹Fig. 8 Phylogenetic tree of Antheraea pernyi ApGSTo1 and omega-class GSTs of different lepidopteran insects based on amino acid sequence

2.4 ApGSTo1在柞蠶卵不同發(fā)育時期的表達變化

在柞蠶卵從母蛾體內(nèi)產(chǎn)出的0-10 d內(nèi),ApGSTo1的表達量在正常對照組和感染柞蠶微孢子蟲組內(nèi)的整體變化趨勢都是先升高再降低(圖9),都是在產(chǎn)卵后3 d時達到最高值,這應(yīng)該與胚胎的發(fā)育規(guī)律有關(guān);在產(chǎn)卵后2-6 d時,感染柞蠶微孢子蟲組的基因表達量比正常對照組的都高,而且在產(chǎn)卵后2 d時與正常對照組差異極顯著(P<0.01),在產(chǎn)卵后6 d時顯著高于正常對照組的(P<0.05),這應(yīng)該與ApGSTo1作為巰基轉(zhuǎn)移酶和抗壞血酸氧化還原酶參與柞蠶卵內(nèi)的抗逆脅迫反應(yīng)有關(guān),產(chǎn)卵后2 d時也是柞蠶卵發(fā)育與抗逆的關(guān)鍵時期。

3 討論

柞蠶微粒子病是生產(chǎn)上的重要病害,威脅種質(zhì)資源的保育及生產(chǎn)的安全,因此對于柞蠶微孢子蟲分離檢測、宿主應(yīng)答、傳播途徑、綜合防治等方面的研究一直是熱門方向,轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究,為探究柞蠶微孢子蟲的免疫應(yīng)答模式、柞蠶微粒子病的發(fā)病機理和開發(fā)防治藥劑提供直接依據(jù)。本研究首次獲得了柞蠶微孢子蟲感染柞蠶卵與未感染柞蠶卵的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),檢測到的表達基因數(shù)為17 453,其中已知的基因為 14 152個,預(yù)測的新基因為3 301個,補充了柞蠶在分子水平上的抗病性研究的空白,再結(jié)合柞蠶放養(yǎng)習性和家蠶的室內(nèi)飼養(yǎng)的差別,柞蠶在抗病性研究領(lǐng)域?qū)⑹歉硐氲哪Ｊ嚼ハx,因此后續(xù)除了對已知基因的挖掘外,還將對新基因進行結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測,以期發(fā)現(xiàn)更多的抗病性相關(guān)通路或蛋白。

昆蟲的解毒酶系主要包括: 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶系、細胞色素P450 酶系和酯酶(如羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶)等(Kerkut and Gilbert, 1985)。其中,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是廣泛分布于動物、植物、酵母和細菌等生物體中的一類由多基因編碼的、具有多種功能的重要酶系。在轉(zhuǎn)錄組GO功能注釋中發(fā)現(xiàn)分子功能類別中的差異表達基因數(shù)量最多,其中參與催化活性的基因數(shù)量達19個(圖2),再結(jié)合KEGG分析中差異基因數(shù)量最多的3個通路(運輸和分解代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和消化系統(tǒng))的結(jié)果(圖4)可知,感染柞蠶微孢子蟲后的柞蠶卵發(fā)生的主要變化集中在物質(zhì)代謝上,與免疫或者抗逆性直接相關(guān)的應(yīng)該是重要代謝通路的酶的表達量變化。同時根據(jù)差異表達基因log2FC值大小順序,差異最顯著的一些基因參與的KEGG通路也多數(shù)為轉(zhuǎn)運蛋白、代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白等,如MFS轉(zhuǎn)運蛋白、醛脫氫酶、溶酶體酸性脂肪酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶;再結(jié)合前人關(guān)于昆蟲的解毒酶系的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),最可能參與柞蠶免疫相關(guān)的候選基因為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因,而且有研究證明了在昆蟲中,GSTs的主要功能是催化谷胱甘肽的巰基與一些親電子類有毒物質(zhì)進行軛合反應(yīng),從而保護一些蛋白質(zhì)免受損傷,達到解毒目的(趙國棟等, 2010; 張婷等, 2011)。

家蠶微孢子蟲發(fā)育分為感染期、裂殖增殖期和孢子形成期3個階段(Ishiharaetal., 1969)。前人猜測卵齡20 h的帶毒蠶卵內(nèi)病原體主要以裂殖體為主,王璐等(2019)采用實時熒光定量 PCR分別對陽性對照、常規(guī)即時浸酸和高溫即時浸酸處理后卵齡 24-240 h蠶卵中的病原數(shù)量逐日檢測,發(fā)現(xiàn)陽性對照組卵齡48 h蠶卵中的病原量出現(xiàn)急劇增長,推測產(chǎn)卵后 24-48 h 是家蠶微孢子蟲的增殖高峰期,此后每日病原數(shù)量無顯著變化,可能與蠶卵逐漸進入滯育狀態(tài),病原生長發(fā)育同樣受到抑制有關(guān)。這與本研究中ApGSTo1的表達量在正常對照組和感染柞蠶微孢子蟲組內(nèi)的整體變化趨勢(圖9)一致,同時發(fā)現(xiàn)在柞蠶卵從母蛾體內(nèi)產(chǎn)出的0-10 d內(nèi),基因表達量在2 d時極顯著高于正常對照組,在6 d時顯著高于正常對照組(圖9),推測產(chǎn)卵后2 d也是柞蠶卵發(fā)育與抗逆的關(guān)鍵時期,這也與家蠶微孢子蟲增殖高峰期的時間一致。尋找和培育抗微粒子病新品種一直是柞蠶育種上的一大難關(guān),由于缺乏靶標檢測基因,無法實現(xiàn)從分子育種角度對現(xiàn)有柞蠶品種進行篩選,因此ApGSTo1可以作為柞蠶幼蟲免疫柞蠶微孢子蟲的靶標基因,為后續(xù)尋找和培育抗微粒子病新品種提供幫助。