趙冬曉, 張志春, 牛洪濤, 郭慧芳

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 南京 210014)

昆蟲是地球上種類最多的生物類群,為自然生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。極高的物種多樣性得益于昆蟲長期進化中形成的獨特防御機制。當遭受病原物侵染時,昆蟲可以通過先天免疫系統(tǒng)(innate immune system)的細胞免疫或體液免疫來吞噬病原物或激活胞內(nèi)信號通路產(chǎn)生溶菌酶、抗菌肽、凝集素等物質(zhì)抵抗病原物(劉小民和袁明龍, 2018)。此外,昆蟲體內(nèi)普遍存在豐富的共生菌,它們對宿主具有重要作用,包括提高宿主適合度、提升對病原菌的防御能力等(Himleretal., 2011; King, 2020)。研究表明,共生菌能通過調(diào)控宿主免疫、分泌毒素、競爭宿主資源等方式抑制病原菌侵染,被譽為昆蟲的“外源免疫”(King, 2020)。因此,天然免疫系統(tǒng)提供的內(nèi)源防御(intrinsic defense)與共生菌提供的外源防御(extrinsic defense)形成了昆蟲抵抗病原物的雙重防線(Hooperetal., 2012)。

研究發(fā)現(xiàn),共生菌對宿主昆蟲的天然免疫系統(tǒng)具有一定的調(diào)控作用,且調(diào)控方式在不同昆蟲-共生菌互作體系中差異較大。有些共生菌通過激活昆蟲天然免疫來提高宿主對外源微生物的抵抗能力。例如,Wolbachia會導(dǎo)致宿主埃及伊蚊Aedesaegypti體內(nèi)NADPH氧化酶和活性氧(reactive oxygen species, ROS)簇的高表達而激活免疫應(yīng)答中的Toll信號通路,產(chǎn)生抗菌肽(antimicrobial peptide)和防御素(defensis),抑制登革熱病毒(dengue virus, DENV)對埃及伊蚊的侵染(Xietal., 2008; Kambrisetal., 2009; Moreiraetal., 2009)。然而,有些具有保護功能的共生菌表現(xiàn)為削弱昆蟲自身的免疫功能。因為宿主將抵抗病原物的任務(wù)“外包”給這類保護性共生菌來承擔,進而節(jié)省了宿主在免疫上的能量投入(King and Bonsall, 2017)。例如,攜帶具有抗寄生蜂、病原菌等功能的共生菌Hamiltonelladefense和Serratiasymbiotica能分擔豌豆蚜Acyrthosiphonpisum先天免疫功能,因為蚜蟲基因組缺少部分免疫相關(guān)基因和肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)基因等一些天然免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子(Gerardoetal., 2010)。另外,從宿主的整個生命過程看,免疫功能的狀態(tài)與機體衰老呈現(xiàn)平行關(guān)系(Yousefzadehetal., 2021),但共生菌對宿主免疫的調(diào)控作用是否會隨宿主生命周期而發(fā)生波動卻鮮有報道。

溶菌酶與防御素是昆蟲先天免疫過程中的廣譜的抗菌效應(yīng)分子(劉小民和袁明龍, 2018)。昆蟲在受到病原微生物侵染時,溶菌酶通過水解細菌細胞壁內(nèi)的肽聚糖來殺死入侵的病原體,防御素在血淋巴及消化道中產(chǎn)生抗菌肽,在昆蟲的天然免疫中扮演重要角色(Beck and Habicht, 1996)。已有研究鑒定出煙粉虱Bemisiatabaci的溶菌酶基因和防御素相關(guān)基因,它們在煙粉虱抵抗細菌、真菌侵染中起重要作用(Wangetal., 2013; 于潔等, 2016)。

煙粉虱是世界性害蟲,傳播危害性極大的番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)等植物病毒(Wangetal., 2017; 褚棟和張友軍, 2018)。煙粉虱體內(nèi)攜帶多種共生菌,它們能為宿主補充植物汁液中缺少的營養(yǎng),也能提高宿主適合度及抗逆能力等,對煙粉虱種群擴張與傳播植物病毒等起到了促進作用(Himleretal., 2011; Guoetal., 2014; Luanetal., 2018; Zhaoetal., 2018; Wangetal., 2020)。連續(xù)多年的調(diào)查結(jié)果表明,共生菌Rickettsia在我國煙粉虱自然種群中快速擴散,且其感染量在共生菌群落中占絕對優(yōu)勢(Zhaoetal., 2021, 2022, 2023)。研究發(fā)現(xiàn),Rickettsia對宿主煙粉虱具有保護功能,能夠延緩殺蟲真菌、環(huán)境致病菌等對煙粉虱的致死作用(Hendryetal., 2014; Zhaoetal., 2023),并有效防御麗蚜小蜂Encarsiaformosa的寄生(劉媛等, 2019)。然而,共生菌Rickettsia會對煙粉虱先天免疫產(chǎn)生怎樣的影響尚未見報道?；赗ickettsia對提高煙粉虱適合度、抵御病原物等生態(tài)功能,以及溶菌酶、防御素等相關(guān)基因在害蟲免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵地位,本研究通過比較感染和不感染Rickettsia煙粉虱不同日齡成蟲體內(nèi)溶菌酶與防御素相關(guān)免疫基因表達量,跟蹤了煙粉虱不同日齡成蟲體內(nèi)Rickettsia相對含量與免疫基因表達量的動態(tài),并分析了二者的相關(guān)性。研究結(jié)果將明確共生菌Rickettsia對宿主煙粉虱免疫基因的調(diào)控作用,并探明煙粉虱成蟲日齡對Rickettsia調(diào)控宿主免疫基因的影響,有助于深入認識基于共生菌與宿主先天免疫協(xié)同的煙粉虱免疫防御機制,并為進一步解析共生菌與宿主協(xié)同進化的生理與生態(tài)機理提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙粉虱品系的建立

煙粉虱于2019年3月采集于南京田間茄子,采回后在人工氣候室內(nèi)棉花苗上飼養(yǎng)[溫度(27±1) ℃,相對濕度60%±5%,光周期14L∶10D]。將新羽化煙粉虱雌雄成蟲放在自制的微型籠里(直徑6 cm,高8 cm),并夾在棉花葉片上進行單對飼養(yǎng),產(chǎn)卵后7 d,PCR檢測母代共生菌感染類型,待子代羽化為成蟲,抽5～10頭檢測共生菌,檢查是否與母代相符(Zhaoetal., 2018)。以上步驟重復(fù)進行,并把相同感染類型放在同一養(yǎng)蟲籠飼養(yǎng),建立100%感染共生菌Rickettsia的煙粉虱品系(R+)、 100%不感染Rickettsia的煙粉虱品系(R-)和45.83%感染Rickettsia的煙粉虱混合品系(mixture)。

1.2 樣品收集與cDNA合成

收集R+品系、R-品系以及mixture混合品系煙粉虱成蟲(對其發(fā)育期不作控制Rickettsia感染率為收集樣品實測感染率),每個樣品50～100頭煙粉虱成蟲,每個品系設(shè)置3～5個生物學(xué)重復(fù)。另外,收集初羽化24 h內(nèi)、3-7日齡以及大于15日齡R+煙粉虱成蟲,每個樣品50～100頭煙粉虱成蟲,每個日齡設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)。所有樣品用動物組織RNA提取試劑盒(Promega,美國)提取總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega,美國)合成cDNA后置于-20 ℃保存。

1.3 qRT-PCR檢測

qRT-PCR檢測以煙粉虱Btβ-actin為內(nèi)參基因,以1.2節(jié)合成的cDNA為模板,擴增R+品系、R-品系以及感染率為45.83%的二者混合品系mixture煙粉虱成蟲中免疫關(guān)鍵因子溶菌酶基因BtLyz1和防御素基因Btdef。鑒于昆蟲日齡增長帶來的機體衰老是影響機體免疫水平的重要因素,以1.2節(jié)不同日齡的R+品系煙粉虱成蟲cDNA為模板擴增細胞凋亡基因BtCaspase,以精確反映出不同日齡煙粉虱成蟲的衰老程度(Bulletal., 2012)。在此基礎(chǔ)上,對1.2節(jié)不同日齡的R+品系煙粉虱成蟲cDNA進行共生菌Rickttsia16S rRNA基因、BtLyz1和Btdef的擴增。反應(yīng)體系(20 μL): DNA模板2 μL, SYBR Premix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)使用SYBR?Premix Ex TagTM(Yeason,上海),在Roche LightCycler?480II實時熒光定量PCR儀進行擴增。反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性30 s; 95 ℃變性5 s, 60 ℃退火 31 s, 40 個循環(huán); 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。定量PCR的引物見表1。每個樣品5個生物學(xué)重復(fù),3個技術(shù)重復(fù),采用2-ΔΔCt法計算各樣本目的基因的相對表達量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 數(shù)據(jù)分析

感染和不感染共生菌Rickettsia煙粉虱成蟲中BtLyz1和Btdef表達量比較采用單因素方差分析。感染共生菌Rickettsia煙粉虱不同日齡成蟲中BtLyz1,Btdef,BtCaspase和Rickettsia16S rRNA基因表達量比較采用單因素方差分析。為進一步揭示Rickettsia對煙粉虱免疫基因的調(diào)控作用及規(guī)律, 利用Pearson法對R+煙粉虱不同日齡成蟲Rickettsia16S rRNA基因表達量與BtLyz1和Btdef表達量進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 Rickettsia提高煙粉虱免疫基因表達量

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,感染Rickettsia的煙粉虱(R+) 成蟲中BtLyz1相對表達量顯著高于不感染Rickettsia的煙粉虱(R-)以及混合品系(mixture)煙粉虱成蟲中的(F2,6=390.288,P<0.001)(圖1: A)。Btdef在R+品系成蟲的相對表達量最高,其次是mixture品系成蟲中的,在R-品系成蟲中的相對表達量最低(F2,6=7.039,P=0.027)(圖1: B)。

圖1 煙粉虱成蟲中溶菌酶基因BtLyz1(A)和防御素基因Btdef(B)的相對表達量Fig. 1 Relative expression levels of lysozyme gene BtLyz1 (A) and defensin gene Btdef (B) in adult Bemisia tabaciR+: 100%感染Rickettsia的品系100% Rickettsia-infected line; R-: 100%不感染Rickettsia的品系 100% Rickettsia-free line; Mixture: 感染率為45.83%的R+/R-混合品系R+/R- mixed line with the infection rate of 45.83%. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差;柱上不同小寫字母表示經(jīng)單因素方差分析在P<0.05水平差異顯著。Data in the figure are mean±SD. Different small letters above bars indicate significant difference at P<0.05 level by one-way ANOVA. 圖2同。The same for Fig. 2.

2.2 不同日齡煙粉虱成蟲免疫基因表達量和Rickettsia相對含量

結(jié)果顯示,煙粉虱初羽化24 h內(nèi)、3-7日齡以及大于15日齡成蟲中BtCaspase的相對表達量具有顯著差異,其中從初羽化24 h內(nèi)到3-7日齡再到大于15日齡,煙粉虱成蟲的BtCaspase相對表達量呈現(xiàn)顯著上升趨勢(F2,12=52.156,P<0.001)(圖2)。該結(jié)果在分子水平上證明了煙粉虱的生理狀態(tài)隨日齡增加而逐漸衰退,且本研究對煙粉虱成蟲生命周期階段的劃分具有較高的合理性。

圖2 感染Rickettsia煙粉虱不同日齡成蟲中細胞凋亡基因BtCaspase的相對表達量Fig. 2 Relative expression levels of apoptotic gene BtCaspasein different day-old adults of Bemisia tabaciinfected with Rickettsia0: 初羽化24 h內(nèi)Newly emerged within 24 h.

在此基礎(chǔ)上,分別測定了初羽化24 h內(nèi)、3-7日齡以及大于15日齡煙粉虱成蟲體內(nèi)Rickettsia16S rRNA基因及BtLyz1和Btdef的相對表達量。結(jié)果顯示, 3個時期的煙粉虱成蟲體內(nèi)Rickettsia16S rRNA基因、BtLyz1和Btdef相對表達量差異顯著,且波動規(guī)律相似(圖3)。其中3-7日齡煙粉虱成蟲的Rickettsia16S rRNA基因相對表達量顯著高于初羽化24 h內(nèi)以及大于15日齡的(F2,12=18.758,P<0.001)(圖3)。與之類似,3-7日齡煙粉虱成蟲的BtLyz1與Btdef相對表達量顯著高于初羽化24 h內(nèi)以及大于15日齡成蟲的(BtLyz1:F2,12=8.259,P=0.006;Btdef:F2,12=5.414,P=0.021)(圖3)。

圖3 感染Rickettsia不同日齡煙粉虱成蟲中Rickettsia16S rRNA基因、BtLyz1和Btdef的相對表達量Fig. 3 Relative expression levels of Rickettsia 16S rRNAgene, BtLyz1 and Btdef in different day-old adults of Bemisia tabaci infected with Rickettsia圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差;柱上不同字母表示經(jīng)單因素方差分析在P<0.001 水平差異顯著。Data in the figure are mean±SD. Different cetters above bars indicate significant difference at P<0.001 level by one-way ANOVA.

2.3 不同日齡煙粉虱成蟲體內(nèi)Rickettsia 16S rRNA基因表達量和免疫基因表達量的相關(guān)性

結(jié)果顯示,在初羽化24 h內(nèi)和3-7日齡煙粉虱成蟲中Rickettsia16S rRNA基因相對表達量與BtLyz1相對表達量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(初羽化24 h內(nèi):P=0.001; 3-7日齡:P=0.0113)(圖4: A, B),且與Btdef相對表達量同樣呈顯著正相關(guān)(初羽化24 h內(nèi):P=0.0379; 3-7日齡:P=0.0229)(圖4: D, E)。但是在處于衰老期(>15日齡)的煙粉虱成蟲中,Rickettsia16S rRNA基因相對表達量與BtLyz1和Btdef相對表達量均不具有相關(guān)性(BtLyz1:P=0.9097;Btdef:P=0.9972)(圖4: C, F)。

圖4 感染Rickettsia煙粉虱不同日齡成蟲中Rickettsia 16S rRNA 基因相對表達量與BtLyz1(A-C)和Btdef(D-F)相對表達量的相關(guān)性Fig. 4 Correlations between the relative expression level of Rickettsia 16S rRNA gene and relative expression levels of BtLyz1 (A-C) and Btdef (D-F) in different day-old adults of Bemisia tabaci infected with RickettsiaA, D: 初羽化24 h內(nèi)Newly emerged within 24 h; B, E: 3-7日齡3-7-day-old; C, F: >15日齡>15-day-old.

3 討論

與宿主共生的細菌群落是影響宿主健康的重要因素。共生菌調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)是影響宿主健康的途徑之一(Hooperetal., 2012)。本研究中,共生菌Rickettsia能夠提高宿主煙粉虱免疫關(guān)鍵因子溶菌酶、防御素基因的表達量(圖1)。在細胞凋亡基因低表達的初羽化24 h內(nèi)和3-7日齡煙粉虱成蟲中,Rickettsia菌量(Rickettsia16S rRNA基因表達量)的上升引起免疫基因表達量上升,而在細胞凋亡基因高表達的衰老(大于15日齡)煙粉虱成蟲體內(nèi)Rickettsia菌量與宿主免疫基因表達不再相關(guān)(圖4)。這表明,宿主衰老等關(guān)鍵生理過程是維持共生菌與宿主免疫互作關(guān)系的重要基礎(chǔ)。

進化和生態(tài)背景下,生物體免疫功能的變化被研究者定義為“生態(tài)免疫(ecological immunology)”(Rolff and Siva-Jothy, 2003)。隨著“生態(tài)免疫”概念的提出,昆蟲與其體內(nèi)共生菌等微生物協(xié)同進化背景下的天然免疫功能變化越來越受到關(guān)注(Kwongetal., 2017)。研究表明,共生菌通過調(diào)控宿主免疫水平而保護宿主抵抗病原物。另外,共生菌對宿主免疫的調(diào)控有利于維持宿主共生菌的高密度,進而增強共生菌對宿主的生態(tài)功能(Nicholsetal., 2021; Goldsteinetal., 2023)。最新研究發(fā)現(xiàn),共生菌Hamiltonella和Regiella抑制宿主豌豆蚜A.pisum酚氧化酶和血細胞色素等免疫基因表達是它們能在宿主體內(nèi)高密度存在的重要原因(Kaechetal., 2021; Nicholsetal., 2021)。本研究發(fā)現(xiàn),共生菌Rickettsia引起宿主煙粉虱體內(nèi)溶菌酶與防御素相關(guān)免疫基因表達量顯著提高。由此推測,Rickettsia的存在對其他微生物的入侵與增殖具有抑制作用,這為解析Rickettsia在煙粉虱共生菌群落中的主導(dǎo)地位以及抑制病原真菌在煙粉虱體內(nèi)的增殖速度等生態(tài)現(xiàn)象提供了一定的分子依據(jù)(Zhaoetal., 2021, 2022, 2023)。

衰老是生命發(fā)生、發(fā)展過程中機體從組織結(jié)構(gòu)到生理功能的喪失和退化的過程(Nishiuraetal., 2022)。在整個生命過程中,機體衰老和免疫功能的狀態(tài)呈現(xiàn)平行關(guān)系,即在機體衰老的過程中,免疫細胞受到內(nèi)源性DNA損傷導(dǎo)致免疫功能下降即免疫衰老(Yousefzadehetal., 2021)。本研究中,以細胞凋亡基因表達量上升為標志的煙粉虱機體衰老(圖2),引起了其免疫基因表達量的顯著下降以及共生菌Rickettsia量的顯著下降(圖3)。在衰老期,低量的Rickettsia與低表達量的溶菌酶、防御素基因之間不再有相關(guān)性,表明這個階段中Rickettsia對宿主免疫不再具有調(diào)控功能。前期研究表明,伴隨宿主衰老的細胞凋亡水平上升是導(dǎo)致宿主體內(nèi)共生菌損失的重要生理級聯(lián)反應(yīng)(Roberty and Plumier, 2022);而共生菌對宿主產(chǎn)生生態(tài)功能往往是建立在一定量基礎(chǔ)上,共生菌量低于閾值是對宿主功能強度的直接影響因素(Nicholsetal., 2023)。由此推測,宿主機體衰老和免疫功能下降以及共生菌無法從宿主獲取大量增殖所需能量的雙重作用,導(dǎo)致了共生菌對衰老宿主免疫調(diào)控作用的變化與擾動。

本研究結(jié)果表明,宿主體內(nèi)共生菌量以及宿主生理狀態(tài)對確定共生體或宿主免疫系統(tǒng)是否為宿主提供最佳保護策略至關(guān)重要。由此推測,共生菌Rickettsia與煙粉虱免疫基因表達的動態(tài)互作,為衰老水平較低的中、低日齡煙粉虱成蟲提供防御病原物等保護功能,而對高日齡的衰老煙粉虱成蟲保護功能弱,但這一推測有待后續(xù)研究進一步證實。未來對共生菌與宿主昆蟲互作的研究要考慮宿主衰老等影響共生菌量的關(guān)鍵生理因素,多角度、多維度探索共生菌與宿主互作的動態(tài)規(guī)律,以更科學(xué)、更全面地理解共生菌與宿主的協(xié)同進化機制。