李紹洋,許 永,李秀春

(1.六安市中醫(yī)院,安徽 六安 237001;2.六安市食品藥品檢驗中心,安徽 六安 237001)

霍山石斛DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng是蘭科植物屬草本植物,其采收日期為每年11月到次年3月中旬?；羯绞皇蛰d于2020年版《中華人民共和國藥典》一部“石斛”項下,目前其主要的藥用部位為莖［1］?；羯绞钤缭凇侗静菥V目拾遺》中有詳細記載,素有“九大仙草之首”之稱。研究發(fā)現(xiàn),霍山石斛主要含有多糖、氨基酸、聯(lián)芐和黃酮等成分,各成分均具有一定的生物活性,但多糖是其主要有效成分?；谝陨弦蛩?筆者對近年來有關(guān)霍山石斛的化學(xué)成分、有效成分——霍山石斛多糖(DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng polysaccharides,DHP)及DHP藥理作用的研究進行總結(jié),以期為這一藥食同源中藥的進一步綜合開發(fā)及其臨床應(yīng)用提供參考。

1 霍山石斛化學(xué)成分

目前,對霍山石斛的研究主要集中在莖、葉及花上,多糖、氨基酸、聯(lián)芐及黃酮等成分為霍山石斛的主要化學(xué)成分。

1.1 多糖 多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)與藥理活性密切相關(guān),是質(zhì)量評價的重要指標(biāo)。霍山石斛全株均含有多糖成分,其中莖多糖主要是由甘露糖和葡萄糖組成;花多糖主要是由甘露糖、葡萄糖和少量的半乳糖組成;葉多糖主要是由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成;根多糖主要是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖組成;以上各種糖類物質(zhì)組成的摩爾比均明顯不同。

1.2 氨基酸 氨基酸是調(diào)節(jié)人體生理功能,維持正常代謝必不可少的物質(zhì)。從霍山石斛中發(fā)現(xiàn)的游離氨基酸有12種,主要為異絲氨酸、賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸。對霍山石斛中12種氨基酸進行定性定量分析,能得到穩(wěn)定、良好的結(jié)果［3］。

1.3 聯(lián)芐、黃酮等化學(xué)成分 隨著分離及鑒定技術(shù)的發(fā)展,從霍山石斛(主要為莖)中分離的小分子化學(xué)成分共99種,其中聯(lián)芐類29種,黃酮類38種,菲類7種,其他類25種［4-7］。聯(lián)芐類化合物的母核多為1,2-二苯基乙烷,在母核結(jié)構(gòu)上存在的生物活性位點或取代反應(yīng)位點主要為C3位、C4位、C5位、C3′位和C4′位,其取代基主要為酚羥基及甲氧基;多數(shù)黃酮類化合物以4′,5,7-三羥基黃酮為基本母核,糖苷取代基一般在C6、C8位,糖鏈部分組成主要包括氨基葡萄糖、阿拉伯糖、木糖苷等,這些類糖體一般可以用低聚糖苷的結(jié)構(gòu)形式與核苷元蛋白結(jié)合以形成寡糖苷;菲類化合物中的取代基主要為甲氧基與羥基,它們在不同的取代位點上組成各種菲類化合物;其他類化合物主要包括酚酸類、甾類、酰胺類,酚酸類中主要種類有丁香酚酸、綠原酸、二價氫酚阿魏酸等,它們可以與羥基結(jié)合形成酯。

2 霍山石斛有效成分

霍山石斛中的化學(xué)物質(zhì)豐富,研究發(fā)現(xiàn)其在抗炎、提高免疫力、抗腫瘤等方面都表現(xiàn)出較強的生物活性,且其主要有效成分為DHP。蘇雙巧等［5］對霍山石斛的體外抑菌抗炎活性進行多項測試,結(jié)果顯示,聯(lián)芐類化合物3′,4-二羥基-3,5′-二甲氧基聯(lián)芐、山藥素Ⅲ、3,4′-二羥基-5-甲氧基聯(lián)芐具有顯著的抗炎活性。谷仿麗等［8］在比較了霍山石斛水提醇沉物(多糖)與醇溶物的抗炎作用后指出,含量大于17%的多糖是霍山石斛抗急性炎癥的主要有效成分。劉川等［9］觀察霍山石斛多糖對帕金森病模型小鼠腦組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響結(jié)果表明,多糖是霍山石斛的主要活性成分,具有良好的抗氧化和抗炎作用。施青青［10］在總結(jié)霍山石斛抗腫瘤作用時亦指出,多糖是石斛的主要活性成分,其他小分子成分如石斛菲、石斛酚、毛蘭素等則發(fā)揮著輔助性作用。

DHP作為霍山石斛的有效成分,提取純化方法與生物活性密切相關(guān)。DHP的提取方法主要包括水提法、超聲波提取法、酶法輔助提取、超微低溫萃取法、半仿生法提取法、閃式提取法等［11-14］?；羯绞侄嗵侵泻杏坞x蛋白和色素等雜質(zhì)會影響多糖活性以及結(jié)構(gòu)的檢測,所以需先分離除去雜質(zhì),然后進行純化獲得均一多糖后再進行結(jié)構(gòu)特征及藥理作用的研究［15］。多糖的單糖組成或分子量分布以及多糖的糖苷鍵類型、三螺旋結(jié)構(gòu)等是造成不同組分生物活性存在差異的因素［16］。目前,DHP的相對分子質(zhì)量及均一性主要采用高效凝膠色譜法—示差折光檢測器進行檢測,分離得到的均一多糖相對分子質(zhì)量分布范圍為1.08～478 kDa［17-18］。研究［17-18］發(fā)現(xiàn),DHP主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖等單糖組成,提取純化后獲得的均一多糖主要由β構(gòu)型的糖苷鍵連接而成,但其支鏈結(jié)構(gòu)差異較大,且生物活性也各有不同,這可能與其提取、分離、純化方法有關(guān)。

3 DHP的藥理作用

3.1 抗炎 炎癥反應(yīng)是常見的病理反應(yīng)過程,可發(fā)生于人體各個部位,如關(guān)節(jié)、腸道。體外研究［13］顯示,DHP可抑制脂多糖誘導(dǎo)的單核巨噬細胞RAW264.7、一氧化氮(nitric oxide,NO)和白細胞介素(interleukin,IL)1β的釋放,降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和IL-1β mRNA的表達水平,顯著抑制炎癥反應(yīng)。后續(xù)體內(nèi)研究［19］發(fā)現(xiàn),其可以通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路的激活,顯著改善膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)。此外,DHP可對抗葡聚糖硫酸鈉引起的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎,顯著降低疾病活動指數(shù)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1水平,改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的炎癥反應(yīng),其作用機制可能與抑制NF-κB通路,減少炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子-β的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)［20］。進一步研究［9］顯示,DHP可顯著降低1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)的帕金森病小鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng),降低IL-1β和TNF-α水平,起到保護神經(jīng)元的作用。另有學(xué)者指出,DHP可抑制急性炎癥的發(fā)作,其作用機制為減少炎癥因子環(huán)氧化酶-2、前列腺素E2、IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生［8］。上述體內(nèi)外實驗均表明,DHP可以降低炎癥因子的表達水平,發(fā)揮抗炎作用。

3.2 免疫調(diào)節(jié) 研究［21］表明,不同組分、不同連接方式的DHP均能不同程度地促進巨噬細胞分泌NO、TNF-α和IL-1β,增強吞噬中性紅的能力,達到調(diào)節(jié)小鼠腹腔巨噬細胞免疫功能的作用。進一步研究［22］發(fā)現(xiàn),DHP不僅對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞吞噬活性降低、脾淋巴細胞體外增殖能力降低和胸腺指數(shù)降低有改善作用,還對卡介苗誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性亢進、脾淋巴細胞體外增殖能力有緩解作用。此外,體外研究［23］還發(fā)現(xiàn),DHP均質(zhì)多糖可通過Toll樣受體4直接與腸上皮細胞(intestinal epithelial cells,IECs)相互作用,刺激IECs分泌IL-6、單核細胞趨化蛋白-1、中性粒細胞趨化因子-1等細胞因子,調(diào)節(jié)固有層細胞的免疫反應(yīng)。體內(nèi)研究［24］進一步證實了均質(zhì)多糖對腸道免疫屏障的調(diào)節(jié)功能,同時還可以有效調(diào)節(jié)脾臟和外周血的免疫反應(yīng)。實驗研究結(jié)果表明,DHP及均質(zhì)多糖均可以刺激B細胞和T細胞的活性,提高免疫因子的表達水平,起到免疫調(diào)節(jié)作用。

3.3 抗腫瘤 霍山石斛莖的精制多糖能抑制肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等腫瘤細胞的增殖與生長。有學(xué)者［25］發(fā)現(xiàn),精制多糖對非小細胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長具有顯著的抑制作用,其作用機制與降低NF-κB信號通路以及CD36表達有關(guān)。劉冰［18］在研究霍山石斛精制多糖對胃癌的作用中發(fā)現(xiàn),霍山石斛精制多糖可以上調(diào)腫瘤凋亡相關(guān)基因Bax、caspase-9和caspase-3的表達水平,下調(diào)腫瘤凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達水平,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,下調(diào)血管生成相關(guān)基因血管內(nèi)皮生長因子和CD34的表達與分泌、抑制腫瘤血管生成,下調(diào)調(diào)節(jié)性T細胞比例,增強T細胞應(yīng)答,達到抑制胃癌細胞活性的作用。進一步研究［10］證明,霍山石斛精制多糖也可抑制CT26-WT結(jié)腸癌荷瘤小鼠的腫瘤生長,其作用機制與調(diào)節(jié)荷瘤小鼠免疫應(yīng)答響應(yīng)和腸道菌群結(jié)構(gòu)改善,抑制腫瘤細胞增殖和血管生成,促進腫瘤細胞凋亡有關(guān)。此外,霍山石斛精制多糖對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長也有一定的抑制作用,將多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)與其抗肝癌活性特征指標(biāo)進行關(guān)聯(lián),揭示乙酰基、相對分子質(zhì)量及糖苷鍵(→4)-β-D-Glcp-(1→、→4)-β-D-Manp-(1→、→4)-3-O-acetyl-β-D-Manp-(1→)是DHP發(fā)揮抗肝癌活性的關(guān)鍵化學(xué)結(jié)構(gòu)因素［26］。

3.4 其他 DHP具有明顯的抗氧化能力,并呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系,對超氧陰離子自由基、羥自由基、1,1-二苯基-2-苦基肼(diphenylpicrylhydrazyl free radical,DPPH)和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽有較高的清除能力［11,27］。與水提醇沉得到的多糖對比,低濃度鹽溶液浸提獲得的糖蛋白組分的抗氧化活性更強［27］,而超聲處理能夠進一步提高水提醇沉DHP的還原力和對羥自由基、DPPH和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽的清除能力［11］。不同提取方法獲得的多糖的抗氧化活性和對自由基的清除能力有所差別的原因,可能與低鹽浸提、超聲提取等方法對DHP的分子結(jié)構(gòu)進行了一定的修飾,使所得多糖的相對分子質(zhì)量、糖鏈碎片及多糖鏈的構(gòu)象有所不同,從而表現(xiàn)出不同強度的生物活性有關(guān)。

DHP對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型［28］和利用平行流室建立低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)［29］具有顯著的改善作用。研究［30］顯示,DHP能有效提升D-半乳糖所致衰老PC12細胞的活力,抵抗氧化應(yīng)激損傷,防止細胞凋亡,其抗衰老機制與下調(diào)P53/P21信號通路相關(guān)基因P53、P21及細胞周期依賴蛋白激酶調(diào)控關(guān)鍵基因P16的表達有關(guān)。DHP的強抗氧化和抗衰老活性提示DHP有望成為研究抗氧化產(chǎn)品的重要資源。

此外,崔勝文等［14］研究發(fā)現(xiàn),DHP通過提高小鼠血清胰島素含量,降低糖化血清蛋白含量,進一步調(diào)節(jié)激素水平降低糖尿病模型小鼠的血糖水平。

4 結(jié)論

霍山石斛作為藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材,使用歷史悠久。在國家市場監(jiān)督管理總局特殊食品信息平臺能查到具有注冊批準(zhǔn)文號的3個產(chǎn)品均是以霍山石斛為主原材料,且其藥效成分均包含DHP。在藥品領(lǐng)域,霍山石斛以中藥材、中藥飲片、成方制劑等多種形式存在。目前已有多種石斛成方制劑,2020年版《中華人民共和國藥典·一部》收載的胃安膠囊、陰虛胃痛顆粒、石斛夜光丸、脈絡(luò)寧注射液、清睛粉等均含有石斛成分,而霍山石斛收錄于石斛項下,但這些成品制劑中石斛的藥效成分還有待于進一步研究。

多糖作為霍山石斛的主要活性物質(zhì),在提取純化、結(jié)構(gòu)特征、藥理研究等方面都取得了一定的進展,但其開發(fā)深度與藥理作用的匹配度不相適應(yīng),應(yīng)加強其開發(fā)深度,進一步挖掘其利用價值。DHP開發(fā)與應(yīng)用存在的問題主要體現(xiàn)在3個方面。一是其質(zhì)量控制方法和標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)尚不完善,比如《中華人民共和國藥典》僅以霍山石斛粗多糖作為其活性成分之一進行質(zhì)量控制［1］,并未明確其多糖的具體有效分子質(zhì)量及有效結(jié)構(gòu)特征,以致最終得到的多糖結(jié)構(gòu)及活性均存在差異。二是進行DHP結(jié)構(gòu)研究不少,但基本上都處于初步探索階段,其結(jié)構(gòu)特征與活性之間的構(gòu)效關(guān)系尚不明確;關(guān)于DHP的結(jié)構(gòu)修飾在生物學(xué)活性的差異或者新增的生物活性作用方面研究較少,僅史甜甜等［31］提出了對DHP多糖進行硫酸化修飾得到的2種衍生物可以明顯抑制糖基化產(chǎn)物的形成,為DHP對糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供了新的思路。三是DHP的使用方式問題,目前體外研究多選擇對不同受體細胞的作用進行研究;而體內(nèi)研究多采用腹腔注射,這與實際臨床應(yīng)用方法存在一定的差異。

霍山石斛未來研究應(yīng)注重4個方面的工作。一是加強霍山石斛的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,明確DHP的有效提取方法、有效分子質(zhì)量及有效結(jié)構(gòu)特征與藥理作用之間的關(guān)系,建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為DHP的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。二是對多糖的全合成進行研究,DHP具有不均一性,不同的提取純化方法得到的多糖片段均存在一定的差異,全合成作為一種獲得規(guī)模化的結(jié)構(gòu)明確的糖片段的有效手段,對未來推進DHP的臨床應(yīng)用具有重要意義。三是對多糖的結(jié)構(gòu)特征與藥理活性之間的關(guān)系進行深入研究,如多糖的結(jié)構(gòu)修飾對其生物學(xué)活性的改變研究。多糖的結(jié)構(gòu)修飾包括硫酸化、硒化等化學(xué)修飾,超聲降解、輻照等物理修飾;發(fā)酵、酶解等生物修飾。綜合分析文獻可知,目前對DHP的結(jié)構(gòu)修飾研究較少,這或可成為未來DHP新的研究點。四是采用傳統(tǒng)的服藥方法結(jié)合藥物代謝動力學(xué)的方法,進一步研究霍山石斛的藥理活性及其作用機制,促進其在臨床的廣泛應(yīng)用。