張 莉,吳 歡,尹艷艷

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,安徽 合肥 230032;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230038)

復(fù)方苦參注射液(Compound Kushen Injection,CKI)又稱“巖舒注射液”,是由苦參及白土苓飲片提取精制而成的滅菌水溶性制劑［1］,具有清熱解毒、涼血利濕、散結(jié)止痛之功效。CKI臨床主要用于抑制腫瘤并緩解癌性疼痛,療效確切［2-3］。近年來有研究［4-5］表明,生物堿是CKI的主要活性成分,其抑制腫瘤的作用及機(jī)制也逐漸被揭示。中藥制劑的體內(nèi)外物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥現(xiàn)代化、國際化的核心問題,能從本質(zhì)上揭示中藥作用的科學(xué)內(nèi)涵,同時(shí)也為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。馬悅［6］利用液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合核磁共振技術(shù)識別了CKI中11種化學(xué)成分,然后利用高效液相色譜建立了27批CKI的指紋圖譜并指認(rèn)了8個(gè)色譜共有峰,研究取得一定進(jìn)展。但CKI中生物堿類成分仍需系統(tǒng)研究,尤其是其血中移行成分。

超高效液相色譜—電噴霧離子化—四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultra-high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UHPLC-ESI-QTOF/MS)具有分離性能好、靈敏度高、分辨率高、動(dòng)態(tài)掃描范圍寬等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于中藥體內(nèi)外物質(zhì)基礎(chǔ)的研究［7-9］。本研究采用UHPLC-ESI-QTOF/MS的全信息串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(full information tandem mass spectrometry,MSE)采集樣品信息,然后基于UNIFI構(gòu)建靶向篩查策略識別CKI中生物堿類成分及血中移行成分,以期為CKI的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)研究提供參考。

1 儀器與材料

UHPLC-ESI-QTOF/MS配有ACQUITY I-Class UHPLC系統(tǒng)(包括在線脫氣器、恒溫控制柱室、自動(dòng)取樣器和四聯(lián)泵)和Xevo G2-XS QTOF系統(tǒng):美國Waters公司;Masslynx 4.1工作站和UNIFI軟件:美國Waters公司;Milli-Q超純水凈化系統(tǒng):美國Millipore公司;CKI(總生物堿含量為20.8 mg/mL):山西振東制藥股份有限公司;色譜級乙腈:德國Merck公司;甲酸:上海Aladdin有限公司。

2 方法

2.1 CKI樣品溶液及空白溶液的制備 取CKI 10 mL,減壓離心揮干溶劑。加入2 mL甲醇,渦旋振蕩30 s使殘?jiān)芙?12 000 r/min離心10 min。取上清1 mL至100 mL量瓶中,甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻,0.22 μm微孔濾膜濾過,即得CKI樣品溶液。取生理鹽水10 mL同法制備即得空白樣品。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 12只SPF級健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量約200 g,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2017-001。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d(溫度和濕度分別為25 ℃±2 ℃和50%±10%,晝夜交替時(shí)間為12 h)。大鼠禁食12 h后,隨機(jī)分為CKI組和空白組,每組6只。CKI組大鼠腹腔注射CKI 2 mL,隔日1次,連續(xù)2次?？瞻捉M給予等量生理鹽水。末次給藥后,分別于0.5、1、2、4、8、12、24 h從眼下靜脈采集0.5 mL血液,置于肝素化EP管中。4 ℃ 、3 000 r/min離心5 min后,取上清,即得血漿樣品。將不同時(shí)間點(diǎn)所取血漿合并后,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 CKI血漿樣品及空白血漿的制備 取1 mL血漿,平均分成5份,每份200 μL。將200 μL血漿置于1.5 mL EP管中,加600 μL預(yù)冷甲醇,旋渦振蕩10 s,4 ℃、13 000 r/min離心10 min。取上清,用氮?dú)獯蹈?。?00 μL預(yù)冷甲醇重新溶解殘?jiān)?合并5份殘?jiān)旌弦?旋渦混合30 s,4 ℃、13 000 r/min離心10 min,取上清,再次用氮?dú)獯蹈?加入100 μL預(yù)冷甲醇,旋渦混合30 s,4 ℃、13 000 r/min離心10 min,即得CKI血漿樣品溶液?？瞻捉M血漿亦按此方法處理。

2.4 UHPLC條件 采用ACQUITY BEH C18色譜柱(2.1 mm×10 cm,粒徑為1.7 μm)對復(fù)雜組分進(jìn)行色譜分離,柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量及流速分別為2 μL和0.2 mL/min。流動(dòng)相由0.01 mol/L醋酸銨溶液(A)和乙腈(B)組成。洗脫程序:6% B,0～2.0 min;6%～15% B,2.0～4.0 min;15%～25% B,7.5～14.0 min;25%～45% B,14.0～16.0 min;45%～90% B,16.0～18.0 min;90%～100% B,20.0～21.0 min;100%～6% B,23.0～24.0 min;6% B,24.0～27.0 min。

2.5 QTOF/MS條件 采用ESI-QTOF/MS進(jìn)行質(zhì)譜檢測。運(yùn)行參數(shù):毛細(xì)管電壓3.0 kV,錐孔電壓40.0 V。離子源和干燥氣的溫度分別為120 ℃和400 ℃。錐孔氣體流速為40 L/h,干燥氣體流速為600 L/h。數(shù)據(jù)采集速率0.5 spectrum/s,掃描范圍50～1 200 Da。使用亮氨酸—腦啡肽(200 pg/mL)在10 μL/min流速下進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)校正。MSE模式下的低、高碰撞能量分別為4 V和20～35 V。

2.6 數(shù)據(jù)分析方法 首先,建立CKI生物堿化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。以苦參作為關(guān)鍵詞檢索PubMed、Web of Science、Medline和CNKI等數(shù)據(jù)庫,收集CKI可能含有的生物堿類成分信息(包含化合物名稱、分子式及結(jié)構(gòu)式)并輸入至Excel表格中。然后,將UHPLC-ESI-QTOF/MS的MSE［其中低碰撞能(4 V)獲取母離子精確質(zhì)量,高碰撞能(20～35 V)獲取碎片離子精確質(zhì)量］采集的CKI樣品及空白樣品源文件和CKI生物堿化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫一起導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI軟件進(jìn)行靶向篩查。UNIFI軟件參數(shù)設(shè)定:二維［2D,包含保留時(shí)間(retention time,tR)和離子強(qiáng)度］檢測最小峰面積為200;三維(3D,包含tR、離子強(qiáng)度和m/z)檢測的低、高碰撞能量下峰強(qiáng)度分別設(shè)置為500和150;tR偏差為±0.1 min;質(zhì)量誤差為±5×10-6。待識別出CKI所含的生物堿類成分后,以這些成分重新建庫,連同UHPLC-ESI-QTOF/MSE采集的CKI給藥后大鼠血漿及空白血漿導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI軟件進(jìn)行血中移行成分的篩查。依據(jù)母離子、碎片離子的精確質(zhì)量對篩查出的化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)。最后驗(yàn)證結(jié)果,對UNIFI輸出的結(jié)果進(jìn)行逐一核實(shí),當(dāng)在空白組和CKI組樣品譜圖的同一tR處提取到離子強(qiáng)度相近的離子流時(shí),則認(rèn)為該成分為假陽性結(jié)果,應(yīng)予以剔除。

3 結(jié)果

3.1 UHPLC-ESI-QTOF/MS條件的優(yōu)化 流動(dòng)相的表面張力、黏度及流速越低,越有利于ESI源電噴霧離子化。因此,有機(jī)相選擇表面張力和黏度均較低的乙腈,流速設(shè)為0.2 mL/min。生物堿容易荷正電荷,離子檢測模式設(shè)置為ESI+模式。水相分別考察了純水、0.5%乙酸溶液、0.1%甲酸溶液和0.01 mol/L醋酸銨溶液,其中0.01 mol/L醋酸銨溶液作為水相與乙腈進(jìn)行梯度洗脫時(shí),化合物峰形和分離度均較好。因此,選擇乙腈-0.01 mol/L醋酸銨溶液作為洗脫液。

3.2 CKI樣品中生物堿成分分析 采用UHPLC-ESI-QTOF/MSE檢測CKI樣品溶液及空白溶液。在正離子模式下CKI樣品溶液和空白溶液的總離子流圖見圖1。根據(jù)“2.6”項(xiàng)下構(gòu)建的靶向篩查策略對CKI中生物堿類成分進(jìn)行定性分析。共識別出20種生物堿類成分,包括12種苦參堿型、3種金雀花堿型、3種羽扇豆堿型、2種苦豆堿型成分,具體結(jié)果見表1。

表1 CKI生物堿類成分的UHPLC-ESI-QTOF/MSE色譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖1 空白樣品(A)和CKI樣品(B)在ESI+模式下的總離子流色譜圖

以峰7為例解析苦參堿類化合物的識別過程。低碰撞能量下峰7(tR=3.65 min)檢測到加合離子［M+H］+的m/z為 265.191 2,以MassLynx 4.1的元素組成工具推測其分子式為C15H25N2O2;高碰撞能量下觀察到247.181 9、205.133 9、150.128 1、148.111 7、136.111 4、120.080 4等碎片離子;其中,m/z247.181 9為m/z265.191 2脫去一分子H2O而產(chǎn)生,接著m/z247.181 9發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移并經(jīng)過系列i裂解后生成205.133 9、150.128 1和148.111 7,其中148.111 7可進(jìn)一步脫去C2H4生成120.080 4的碎片離子。見圖2。因此,經(jīng)UNIFI靶向篩查并結(jié)合其母離子、碎片離子精確質(zhì)量以及裂解特征,推測該化合物為氧化苦參堿。

圖2 氧化苦參堿的質(zhì)譜圖(A)和裂解途徑(B)

3.3 CKI血中移行成分分析 利用UHPLC-ESI-QTOF/MSE檢測“2.3”項(xiàng)下獲得的CKI血漿樣品及空白血漿樣品。將“3.2”項(xiàng)下的20種CKI生物堿成分重新建庫并導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI,自動(dòng)比對含藥血漿及空白血漿,靶向篩查出血中移行的生物堿類成分。共有17種成分能夠在血漿中被檢出,包括10種苦參堿型(5α,9α-二羥基苦參堿、9α-羥基苦參堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、14β-氧化槐定堿、槐醇堿、氧化槐定堿、槐定堿、苦參堿和槐果堿)、2種金雀花堿型(N-甲基金雀花堿、菱葉堿)、3種羽扇豆堿型(氧化黃葉槐堿、黃葉槐堿、lamprolobine)、2種苦豆堿型(鷹靛葉堿、羽扇烷寧)成分。

4 討論

多項(xiàng)臨床研究表明,CKI對惡性腫瘤如肝癌［10］、胃癌［11］、肺癌［12］、乳腺癌［13］具有較好的療效,腫瘤抑制作用可能與其抑制癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯,加速凋亡,抑制血管生成,抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)［5,13］。已有研究［4］表明,苦參堿和氧化苦參堿等生物堿類成分是CKI的主要活性成分,它們對人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)、胃癌細(xì)胞(MKN45和SGC-7901)以及乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)有不同程度的抑制作用。然而,中藥制劑具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn),其血中移行成分是其發(fā)揮治療作用的潛在活性物質(zhì)［9］。因此,有必要對CKI生物堿類組分及血中移行成分進(jìn)行系統(tǒng)分析。

UHPLC-ESI-QTOF/MS的MSE模式是一種能夠?qū)崿F(xiàn)高、低碰撞能量切換掃描的數(shù)據(jù)非依賴性采集技術(shù),能在一次樣品采集過程中同時(shí)捕獲母離子和碎片離子的精確質(zhì)量,并依據(jù)它們的色譜行為進(jìn)行關(guān)聯(lián)和匹配［14-15］,降低了數(shù)據(jù)采集次數(shù)。由于中藥制劑化學(xué)成分具有多樣性和復(fù)雜性,傳統(tǒng)的手動(dòng)提取離子流,依據(jù)母離子及碎片離子等信息進(jìn)行人工解譜的過程復(fù)雜且耗時(shí);在有基質(zhì)干擾的情況下,響應(yīng)信號小或含量低的成分在MSE采集模式下易發(fā)生漏判［15］。作為一種簡單高效的數(shù)據(jù)分析平臺,UNIFI能對UHPLC-ESI-QTOF/MS的MSE數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、峰提取、分子式確定,也能比對含藥樣品及空白樣品的差異并與庫中化合物進(jìn)行匹配,依據(jù)碎片離子對化合物進(jìn)行推導(dǎo),最后輸出擬識別化合物的信息［16］。

本研究通過UHPLC-ESI-QTOF/MSE技術(shù)結(jié)合靶向篩查策略識別了CKI中20生物堿類成分及17種血中移行成分,為其藥效物質(zhì)的系統(tǒng)闡明及質(zhì)量控制體系的建立奠定了基礎(chǔ)。