杜松麗,樊 莉,陳茂山,周 戀,華幫江,楊宏偉,
(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 研究生院,貴州 遵義 563099;2.遂寧市中心醫(yī)院 乳腺甲狀腺外科,四川 遂寧 629000)
全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤首位,占所有惡性腫瘤的24.5%,嚴(yán)重危害女性身心健康[1]。乳腺癌是一種具有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤,根據(jù)腫瘤表達(dá)的ER、PR和HER2狀態(tài)可將乳腺癌劃分為Luminal A樣、Luminal B樣、HER2陽性和三陰性4種亞型,不同亞型乳腺癌的生物學(xué)行為及預(yù)后存在顯著差異。Luminal A樣和Luminal B樣型乳腺癌統(tǒng)稱為激素受體(Hormone receptor, HR)陽性乳腺癌,在乳腺癌中占比為60%~70%[2]。內(nèi)分泌治療(Endocrinetherapy, ET)是該類型乳腺癌的重要治療方式,能顯著提高HR陽性乳腺癌患者的預(yù)后,然而約30%的HR陽性乳腺癌患者在內(nèi)分泌治療過程中出現(xiàn)耐藥導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此,能預(yù)測HR陽性乳腺癌發(fā)生ET耐藥的標(biāo)志物和能逆轉(zhuǎn)耐藥的治療靶點(diǎn),為進(jìn)一步提高HR陽性患者的預(yù)后具有非常重要臨床意義。
隨著生物信息技術(shù)的不斷發(fā)展,基因芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,能為腫瘤等各種疾病深入了解基因?qū)用娴牟町惡烷_展機(jī)制研究,為臨床診斷、治療、預(yù)后評(píng)估等方面提供非常重要的信息[3-4]。高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫涵蓋世界各機(jī)構(gòu)提交的各種腫瘤的基因芯片數(shù)據(jù),為乳腺癌ET耐藥問題的深入研究提供了可能。目前,乳腺癌ET耐藥的具體機(jī)制尚不清楚。本研究利用基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行耐藥差異基因分析,探索耐藥可能相關(guān)的信號(hào)通路,并通過臨床標(biāo)本進(jìn)行初步驗(yàn)證。本研究通過遂寧市中心醫(yī)院科研倫理委員會(huì)審批(編號(hào):LLSLH20210060)。
1.1 芯片數(shù)據(jù)的選擇 本研究使用美國國立生物技術(shù)信息中心的基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo),采用“breast cancer”和“endocrine therapy”為關(guān)鍵詞在數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行檢索,獲得乳腺癌內(nèi)分泌治療相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)。篩選得到他莫昔芬耐藥和他莫昔芬非耐藥細(xì)胞系的基因數(shù)據(jù)集(GSE 67916),芳香化酶抑制劑耐藥細(xì)胞系和芳香化酶抑制劑非耐藥細(xì)胞系的基因數(shù)據(jù)集(GSE 51390)。
1.2 差異表達(dá)基因的篩選 采用 GEO2R篩選對(duì)HR陽性乳腺癌內(nèi)分泌治療敏感組與耐藥組的差異表達(dá)基因(DEGs)。以調(diào)整后P<0.05、|logFC|≥1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。然后,運(yùn)用Venn diagram軟件獲取兩個(gè)基因芯片的共同DEGs。logFC≥1定義為上調(diào)基因,logFC≤-1定義為下調(diào)基因。
1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因的篩選 采用STRING(Search tool for the retrieval of interacting genes/proteins)對(duì)DEGs進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction,PPI)分析。進(jìn)一步運(yùn)用 Cytoscape 3.8.0(http://www.cytoscape.org/)進(jìn)行蛋白之間的潛在相關(guān)性分析,篩選出與周圍蛋白有高度連通性(度值degree)的前20個(gè)蛋白。
1.4 差異基因的生物功能及作用通路分析 采用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(The database for annotation,visualization,and integrated discovery,DAVID)對(duì)篩選的前20個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的DEGs進(jìn)行基因本體(Gene ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析,了解基因的作用及相關(guān)通路。
1.5 關(guān)鍵基因的生存分析 運(yùn)用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫(http://www.kmplot.com/analysis/)對(duì)篩選出的20個(gè)關(guān)鍵蛋白對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行預(yù)后分析,確定其與HR陽性乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存(Recurrence-free survival,RFS)的相關(guān)性,并繪制生存曲線。
1.6 差異基因蛋白表達(dá)的驗(yàn)證 選取遂寧市中心醫(yī)院數(shù)據(jù)庫中病例及對(duì)應(yīng)的石蠟標(biāo)本,采用免疫組化(IHC)法檢測篩選出的20個(gè)關(guān)鍵蛋白,驗(yàn)證分析蛋白在乳腺內(nèi)分泌治療敏感和耐藥人群中的表達(dá)情況。具體方法如下:
1.6.1 標(biāo)本的選擇 在本中心數(shù)據(jù)庫中初篩接受規(guī)范診療、有隨訪信息及病理標(biāo)本的HR陽乳腺癌病例,再利用隨機(jī)數(shù)字表法按1∶1篩選ET敏感和耐藥病例各21例。于病理科借取相應(yīng)患者的原發(fā)灶手術(shù)石蠟標(biāo)本或穿刺石蠟標(biāo)本。
1.6.2 主要試劑 一抗、二抗、EDTA修復(fù)液(免疫組化法)、DAB顯色液、緩沖液(PBS磷酸鹽法)、蘇木素等。
1.6.3 免疫組化Enivision法染色 將存檔的非特殊浸潤性乳腺癌組織蠟塊2 μm厚連續(xù)切片制作載玻片,室溫TO液脫蠟后PBS液及EDTA修復(fù)液處理,分別用一抗、二抗處理后DAB顯色,蘇木素復(fù)染微波爐烤片后加入細(xì)胞保存液封片。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求操作。
1.6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)判 由兩位工作5年以上的副主任醫(yī)師盲態(tài)下獨(dú)立閱片,參照《免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)》[5],在400倍高倍鏡下,隨機(jī)選擇5個(gè)視野,根據(jù)相應(yīng)抗體的表達(dá)部位進(jìn)行判讀。染色強(qiáng)度評(píng)分:無色計(jì)0分,淺黃色計(jì)1分,棕黃色計(jì)2分,棕褐色計(jì)3分;陽性的細(xì)胞占比評(píng)分:0為0分,≤10%為1分,11%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%計(jì)4分。將兩個(gè)評(píng)分乘積作為該視野的IHC得分。計(jì)算兩位醫(yī)師評(píng)出的每個(gè)視野的平均分作為該視野最終得分。每個(gè)標(biāo)本的5個(gè)視野平均分,作為該標(biāo)本的IHC最終得分。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),不符合者采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。分類變量組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用單因素Logistic回歸分析ET耐藥可能相關(guān)的因素,單因素分析P<0.05的變量進(jìn)入多因素Logistic回歸分析耐藥獨(dú)立相關(guān)因素。生存分析采用Kaplan-Meier法,各基因不同表達(dá)水平患者間的RFS比較采用log-rank檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 差異基因的篩選 按照“Breast cancer”和“Endocrine therapy resistance”在GEO數(shù)據(jù)庫共檢索到168個(gè)相關(guān)芯片數(shù)據(jù)集,進(jìn)一步精確篩選后得到GSE 67916和GSE 51390兩個(gè)數(shù)據(jù)集,其中GSE 67916對(duì)他莫昔芬耐藥細(xì)胞系TamR與他莫昔芬敏感細(xì)胞系MCF7/S0.5進(jìn)行了基因陣列分析,進(jìn)行差異基因分析獲得1 787個(gè)DEGs;GSE 51390檢測了對(duì)芳香化酶抑制劑耐藥細(xì)胞系A(chǔ)3與敏感細(xì)胞系T-47D的基因表達(dá),差異基因分析獲得5 665個(gè)DEGs。兩個(gè)數(shù)據(jù)集DEGs的火山圖分別見圖1~2。進(jìn)一步運(yùn)用Venn diagram在線工具對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集的 DEGs取交集。得到同時(shí)在他莫昔芬耐藥和芳香化酶抑制劑耐藥細(xì)胞系表達(dá)的基因,繪制韋恩圖(見圖 3)。最終篩選出184個(gè)DEGs,其中上調(diào)基因68個(gè),下調(diào)基因116個(gè)。
圖1 GSE 67916 差異表達(dá)基因
圖2 GSE 51390差異表達(dá)基因
A:68個(gè)上調(diào)基因;B:116個(gè)下調(diào)基因。圖3 184個(gè)共同的差異表達(dá)基因
2.2 差異基因的富集分析
2.2.1 GO分析 使用DAVID對(duì)184個(gè)DEGs進(jìn)行GO分析,結(jié)果顯示:(1)在細(xì)胞組分上,主要富集于細(xì)胞膜、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、胞外外泌體等處(見圖4);(2)在生物學(xué)過程中,主要在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附等方面富集(見圖5);(3)在分子功能上,主要在蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合等方面富集(見圖6)。
圖4 細(xì)胞組分
圖5 生物過程
圖6 分子功能
2.2.2 KEGG分析 KEGG分析(見圖7),DEGs在癌細(xì)胞中主要富集于蛋白聚糖、鈣信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路、細(xì)胞粘附分子、甲狀腺激素信號(hào)通路等通路。
圖7 KEGG富集通路分析
2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因的篩選 用184個(gè)共同DEGs在STRING數(shù)據(jù)庫初步構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,獲得各基因相應(yīng)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的信息。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中運(yùn)用cytohubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行運(yùn)算,按Degree 算法選擇蛋白質(zhì)之間相互作用最密切的前20個(gè)蛋白(見圖8;表1),并將這20個(gè)蛋白及對(duì)應(yīng)的基因?yàn)檠芯繉?duì)象。
圖8 前20個(gè)蛋白質(zhì)互作關(guān)系
2.4 關(guān)鍵基因的生存分析 運(yùn)用Kaplan-Meier plotter中乳腺癌數(shù)據(jù)庫患者生存資料對(duì)篩選出的20個(gè)基因進(jìn)行生存分析,結(jié)果表明20個(gè)關(guān)鍵基因中有11個(gè)基因與HR陽性患者的RFS呈相關(guān)性(P均<0.05),其中基因和基因等基因高表達(dá)的患者RFS更短(P均<0.05),表明這2個(gè)基因可能是HR陽性乳腺癌疾病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素;而PTPN11、ITPR1、GATA3、PLCG2、ESR1、ERBB4、TP53、FGFR2 及PGR這9個(gè)基因高表達(dá)則可能是乳腺癌患者疾病進(jìn)展的保護(hù)性因素(P均<0.05,見圖9)。
表1 前20個(gè)樞紐基因
2.5 對(duì)差異基因行免疫組化驗(yàn)證 閱讀文獻(xiàn)及結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,IHC方法檢測乳腺癌組織中ITPR1、FGFR2相應(yīng)的蛋白,結(jié)果極少陽性表達(dá)甚至不表達(dá)[6]。已有文獻(xiàn)證實(shí)ESR1、CD24基因與乳腺癌內(nèi)分泌耐藥相關(guān)[7]。本研究對(duì)上述4個(gè)蛋白未重復(fù)驗(yàn)證。結(jié)合查閱文獻(xiàn),本研究選取ERBB4、PTPN11、GATA3、TP53、PGR、PLCG2和SDC1基因相應(yīng)的蛋白進(jìn)行IHC檢測。結(jié)果顯示:PGR、PLCG2和SDC1基因蛋白在ET敏感和耐藥兩組之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),TP53、ERBB4、GATA3和PTPN11基因蛋白在兩組之間的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05,見圖10),并通過免疫組織化學(xué)法驗(yàn)證各差異基因在乳腺癌組織中的表達(dá)情況(見圖11~17)。
7個(gè)基因敏感組與耐藥組相比,P值分別為0.033、0.008、0.460、0.213、0.793、0.082。圖10 7個(gè)基因相應(yīng)蛋白驗(yàn)證結(jié)果
A:陰性表達(dá);B:陽性表達(dá),×200。圖11 IHC法檢測PGR在乳腺癌中的表達(dá)
A:陰性表達(dá);B:陽性表達(dá),×200。圖12 IHC法檢測PLCG2在乳腺癌中的表達(dá)
A:陰性表達(dá);B:陽性表達(dá),×200。圖13 IHC法檢測SDC1在乳腺癌中的表達(dá)
A:陰性表達(dá);B:陽性表達(dá),×200。圖14 IHC法檢測TP53在乳腺癌中的表達(dá)
A:陰性表達(dá);B:陽性表達(dá),×200。圖15 IHC法檢測GATA3在乳腺癌中的表達(dá)
A:陰性表達(dá);B:陽性表達(dá),×200。圖17 IHC法檢測ERBB4在乳腺癌中的表達(dá)
激素受體(Hormone receptor, HR)陽性乳腺癌的預(yù)后與基因表達(dá)情況密切相關(guān),如ESR1基因、PIK3CA/mTOR通路的改變,抑制CDK4/6、mTOR和PI3K等通路均顯示可提高內(nèi)分泌治療(Endocrine therapy, ET)的臨床療效。但仍有部分HR陽性乳腺癌對(duì)內(nèi)分泌不夠敏感,出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)性ET耐藥。目前,ET耐藥的詳細(xì)機(jī)制尚不明確。本研究利用生物信息技術(shù)從GEO數(shù)據(jù)庫篩選出GSE67916和GSE51390芯片,對(duì)可能與乳腺癌ET耐藥密切的基因和蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)SDC1和CD24基因高表達(dá)與HR陽性乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存(Recurrence-free survival, RFS)更差相關(guān)(P均<0.05),同時(shí)發(fā)現(xiàn)PTPN11、ITPR1、GATA3、PLCG2、ESR1、ERBB4、TP53、FGFR2及PGR這9個(gè)基因高表達(dá)則與患者更優(yōu)的RFS相關(guān)(P均<0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)的這11個(gè)基因及蛋白有可能為預(yù)測HR陽性乳腺癌ET敏感性提供參考信息。
SDC1(Syndecan-1)是一種細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,通常主要由上皮細(xì)胞和漿細(xì)胞表達(dá),在乳腺癌的基質(zhì)成纖維細(xì)胞中異常表達(dá),可存在于各種正常和惡性組織中。SDC1在乳腺癌微環(huán)境中存在特定于生態(tài)位的功能,介導(dǎo)Wnt級(jí)聯(lián)信號(hào)并可能調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的遷移[8],它主要通過影響腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)配體和受體而影響腫瘤進(jìn)展。SDC1的高表達(dá)被證明是乳腺癌的一個(gè)新的獨(dú)立預(yù)后因素,SDC1過表達(dá)與ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān),主要通過調(diào)節(jié)血腦屏障的相關(guān)細(xì)胞因子促使乳腺癌細(xì)胞跨血腦屏障遷移而促進(jìn)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移[9]。SDC1基因參與調(diào)控的PI3K/AKT信號(hào)通路在乳腺癌內(nèi)分泌耐藥過程中發(fā)揮著重要作用[10]。
PLCG2(Phospholipase Cγ2)與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和腫瘤生長的調(diào)節(jié)有關(guān),在三陰性型乳腺癌中PLCG2表達(dá)上調(diào)[11]。大部分關(guān)于PLCG2的研究主要與阿爾茲海默病、消化道腫瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病耐藥等領(lǐng)域。與原發(fā)腫瘤相比,PLCG2是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者淋巴轉(zhuǎn)移中表達(dá)差異最大的基因之一,且與乳腺原發(fā)腫瘤相比,PLCG2mRNA在淋巴轉(zhuǎn)移中的數(shù)量增加[12-13],這可能預(yù)示PLCG2表達(dá)與更具侵襲性的分子亞型相關(guān)。
ERBB4是ERBB受體酪氨酸激酶家族的成員,它在腫瘤不同微環(huán)境狀態(tài)下中具有促癌和抗癌活性。ERBB4負(fù)調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞中的血管生成擬態(tài)(VM)的形成,其突變點(diǎn)可能成為乳腺癌的有效治療靶標(biāo)[14]。Kawahara等[15]學(xué)者探討ERBB4在人類腫瘤中作為生物標(biāo)志物發(fā)揮作用的可能性,分析ERBB4在人類腫瘤分期中的潛在作用以及ERBB4功能如何決定人類腫瘤的治療,均表明本研究所篩選出的ERBB4基因?qū)φ{(diào)節(jié)人類腫瘤微環(huán)境起重要作用。
PGR由位于11q22.1的PGR基因編碼,在乳腺的發(fā)育以及乳房的惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Hisham等研究結(jié)果表明,在雌激素允許的條件下,激活的PR通過重新定向ERα染色質(zhì)結(jié)合和改變靶基因的表達(dá),誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞從增殖狀態(tài)向分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)換,在ER乳腺腫瘤中起增殖抑制作用[16]。PGR基因組位點(diǎn)的基因組改變使PR表達(dá)降低從而增加乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)的一種相對(duì)常見的機(jī)制,這可能導(dǎo)致ERα染色質(zhì)結(jié)合和靶基因表達(dá)模式的改變,PGR還可以調(diào)節(jié)ER結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄活性,選擇性PR調(diào)節(jié)劑藥物可以與他莫昔芬協(xié)同作用,使小鼠腫瘤消退[16-17]。在本研究中,PGR在內(nèi)分泌治療耐藥組與敏感組的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,進(jìn)一步證實(shí)PGR與乳腺癌ET耐藥相關(guān)。
ESR1、PTPN11、TP53和ITPR1等基因與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在轉(zhuǎn)移性激素受體陽性乳腺癌中,ESR1突變是繼發(fā)耐藥的常見原因[18],可見ESR1基因是降低HR陽性乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥的潛在保護(hù)基因。PTPN11在急性髓系粒細(xì)胞白血病(AML)中RAS信號(hào)超激活、白血病轉(zhuǎn)化及化學(xué)耐藥等信號(hào)通路中皆具有重要作用[19]。TP53的突變是導(dǎo)致乳腺癌轉(zhuǎn)移極重要的遺傳變化,5%~8%的30歲以下患有乳腺癌的女性帶有種系TP53基因突變,而攜帶TP53基因種系突變的女性在60歲時(shí)患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)85%,與患者不良預(yù)后高度相關(guān)[20]。
本研究通過生物信息技術(shù)篩選出可能與乳腺癌ET敏感性相關(guān)的基因,通過單中心病理標(biāo)本初步驗(yàn)證證實(shí)SDC1、PLCG2、ERBB4、PGR、ESR1、PTPN11、TP53和ITPR1等基因可能為乳腺癌ET敏感性提供參考信息。受限于基因數(shù)據(jù)庫信息的局限性,仍存在乳腺癌耐藥基因篩選不全、基因或蛋白在信號(hào)通路間的交互作用、基因差異與現(xiàn)實(shí)中患者ET敏感性不吻合等情況,后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)本研究發(fā)現(xiàn)的耐藥基因和蛋白進(jìn)行深入研究和機(jī)制探索。