丁瑞雪,伍紅瑜,李意奇,高 楊,夏 文,楊丹莉
(遵義醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院;2.基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099;3.現(xiàn)代苗藥創(chuàng)制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,貴州 安順 561000)
隨著人口老齡化不斷加劇,冠心病已成為人類死亡的首要原因。經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(Percutaneous coronary intervention,PCI)是治療冠心病的主要方法,但PCI術(shù)后血管內(nèi)膜增生率高達(dá)20%~40%,嚴(yán)重影響患者預(yù)后效果[1]。研究表明,炎癥免疫反應(yīng)是PCI術(shù)后血管再狹窄的關(guān)鍵因素,始終貫穿于血管內(nèi)膜增生的發(fā)生發(fā)展中[2]。銀丹心腦通軟膠囊(Yindan Xinnaotong capsule,YDXNT)是銀杏葉、丹參、燈盞細(xì)辛、山楂、絞股藍(lán)、三七、艾片、大蒜8味藥物組成的中成藥,具有調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能等作用[3-5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)YDXNT減輕球囊損傷所致大鼠頸動脈血管內(nèi)膜增生[3,5]。臨床研究表明,YDXNT治療6個月后可明顯降低冠狀動脈微血管性心絞痛患者血漿白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)濃度,減輕炎癥反應(yīng)[4]。有趣的是,鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin,CaN)/活化T細(xì)胞核因子(Nuclear factors of activated T cell,NFAT)信號通路通過上調(diào)炎癥免疫反應(yīng),促使血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)表型轉(zhuǎn)換、增殖及遷移,繼而導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生[6]。然而,YDXNT是否能通過調(diào)控CaN/NFATc3信號通路減輕球囊損傷所致大鼠頸動脈血管內(nèi)膜增生尚不清晰。本研究利用球囊導(dǎo)管術(shù)損傷大鼠頸動脈血管,建立血管內(nèi)膜增生模型,以探究YDXNT是否可能通過調(diào)控CaN/NFATc3信號通路改善大鼠頸動脈血管內(nèi)膜增生。
1.1 主要藥品與試劑 銀丹心腦通軟膠囊由貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司提供(國藥準(zhǔn)字Z20027144);IL-1β抗體(貨號:A1112,ABclonal公司);TNF-α抗體(貨號:17590-1-AP,Proteintech公司);MCP-1抗體(貨號:66272-1-lg,Proteintech公司);CaN抗體(Ab3673,Abcam公司);NFATc3抗體(bs-2952R,北京博奧森生物技術(shù)有限公司);山羊抗小鼠/兔(Alexa Fluor 488/594)IgG(貨號:SA00013-1/2/4,Proteintech公司);DAPI(貨號:c0065,北京索萊寶科技有限公司);2F Fogarty(0.67 mm)球囊導(dǎo)管(美國edwards lifescience公司)。
1.2 儀器 TP1020組織脫水機(jī)(德國Leica Biosystems公司);EG1150石蠟包埋機(jī)(德國Leica Biosystems公司);自動染色機(jī)(LEICA AUTOSTAINER XL公司);BX53+DP80正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。
1.3 實(shí)驗(yàn)動物造模及分組給藥 18只雄性SD大鼠,體重310~320 g,購買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,許可證號:SCXK(湘)2019-0004。于SPF級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,腹腔注射2 %的戊巴比妥鈉溶液麻醉SD大鼠,將SD大鼠固定于手術(shù)臺上,剃除其頸部皮毛。參照文獻(xiàn)[7]建立大鼠頸動脈血管內(nèi)膜增生模型。假手術(shù)組不進(jìn)行球囊送入與擴(kuò)張。將球囊損傷后的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(Model,n=6)和YDXNT給藥組(YDXNT,n=6)。同時以假手術(shù)組(Sham,n=6)作為空白對照。YDXNT組灌胃1.0 g/kg YDXNT混懸液,Model和Sham組灌胃等體積雙蒸水,1日1次,連續(xù)14 d。本實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理有關(guān)準(zhǔn)則。動物倫理委員會批準(zhǔn)號:ZMUER 2018-2-232。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 HE染色觀察大鼠頸動脈血管的病理學(xué)變化 給藥14 d,常規(guī)麻醉SD大鼠,在其頸部剪一切口,充分暴露左頸動脈并迅速取出,用預(yù)冷的PBS沖洗干凈,取血管中部于4 %的甲醛溶液中固定24 h,常規(guī)脫水,包埋,制備血管組織切片。將血管組織切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟后進(jìn)行HE染色,用正置顯微鏡下觀察血管病理學(xué)變化。使用Image Pro Plus軟件對觀察到的頸動脈血管圖像進(jìn)行定量分析,使用面積計(jì)算工具計(jì)算內(nèi)彈力板圍繞面積(Internal elastic lamina area,IELA)、外彈力板圍繞面積(External elastic lamina area,EELA)、新生內(nèi)膜面積(Neointimal area,NIA)、中膜面積(Media area,MA)。MA =EELA-IELA。分析大鼠頸動脈血管NIA,NIA/MA,NIA/IELA變化。
1.4.2 免疫熒光技術(shù)檢測大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜的CaN、NFATc3、IL-1β、TNF-α、MCP-1蛋白表達(dá)將血管組織切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟,檸檬酸鹽修復(fù)液進(jìn)行熱抗原修復(fù),PBS洗3次×5min;37 ℃山羊血清封閉1 h;一抗孵育CaN(1∶50)、NFATc3(1∶50)、IL-1β(1∶50)、TNF-α(1∶50)、MCP-1(1∶50),4 ℃孵育20 h,37 ℃復(fù)溫30 min,PBS洗滌3次×5 min;37 ℃孵育山羊抗小鼠/兔(Alexa Fluor 488/594)二抗(1∶100)1 h,PBS洗滌3次×5 min;室溫孵育10 min DAPI染核,PBS洗滌3次×5 min,用防熒光淬滅封片劑封片;用正置熒光顯微鏡觀察大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜中蛋白表達(dá)情況,并拍照記錄。用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜組織中蛋白的平均熒光強(qiáng)度。
2.1 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管病理學(xué)變化的影響 由HE染色可見,Sham組無新生內(nèi)膜;與Sham組相比,Model組血管內(nèi)膜增厚明顯增加,管腔狹窄,成模率100 %;與Model組相比,YDXNT組血管內(nèi)膜厚度明顯降低,管腔增大,結(jié)果提示,確證YDXNT可以改善球囊損傷所致大鼠頸動脈血管再狹窄(見圖1)。
A:HE染色代表性圖片(標(biāo)尺= 100 μm);B: NIA的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;C: NIA/MA的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;D:NIA/IELA的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;與 Sham組比較,P<0.05;*:與Model組比較,P<0.05。圖1 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管病理學(xué)變化的影響
2.2 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜中CaN蛋白表達(dá)的影響 采用免疫熒光技術(shù)檢測大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜CaN蛋白表達(dá)情況,結(jié)果提示,與Sham組相比,Model組CaN蛋白表達(dá)明顯升高,主要表達(dá)于頸動脈血管新生內(nèi)膜中(P<0.05);與Model組相比,YDXNT組頸動脈血管新生內(nèi)膜中CaN蛋白表達(dá)明顯降低61.5%(P<0.05,見圖2)。
A:免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠血管新生內(nèi)膜中CaN的代表性圖片,新生內(nèi)膜為虛線所圈處(標(biāo)尺= 20 μm);B:免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠血管新生內(nèi)膜中CaN平均熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;與Sham組比較, P<0.05;*:與 Model組比較,P<0.05 。圖2 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜中CaN蛋白表達(dá)的影響
2.3 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜中NFATc3蛋白核轉(zhuǎn)位的影響 NFATc3以未激活的磷酸化狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì),CaN激活后使NFATc3脫磷酸化轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。用免疫熒光技術(shù)檢測大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜NFATc3核轉(zhuǎn)位情況,結(jié)果提示,與Sham組相比,Model組頸動脈血管新生內(nèi)膜中NFATc3蛋白核轉(zhuǎn)位明顯增多(P<0.05);與Model組相比,YDXNT組頸動脈血管新生內(nèi)膜中NFATc3蛋白核轉(zhuǎn)位明顯減少52.4%(P<0.05,見圖3)。
A:免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠血管新生內(nèi)膜中NFATc3蛋白的代表性圖片,新生內(nèi)膜為虛線所圈處(標(biāo)尺= 20 μm);B:免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠血管新生內(nèi)膜中NFATc3蛋白核轉(zhuǎn)位百分比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;C:免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠血管新生內(nèi)膜中NFATC3蛋白的局部放大代表圖;與 Sham組比較,P<0.05 ;*:與 Model組比較, P<0.05。圖3 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜中NFATc3蛋白核轉(zhuǎn)位的影響
2.4 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜中IL-1β蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光技術(shù)檢測大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜IL-1β蛋白表達(dá)情況,結(jié)果提示,與Sham組相比,Model組頸動脈血管新生內(nèi)膜中IL-1β蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與Model組相比,YDXNT組頸動脈血管新生內(nèi)膜中IL-1β蛋白表達(dá)明顯降低61.3%(P<0.05,見圖4)。
A:免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠血管新生內(nèi)膜中IL-1β的代表性圖片,新生內(nèi)膜為虛線所圈處(標(biāo)尺= 20 μm);B:免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠血管新生內(nèi)膜中IL-1β平均熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;與 Sham組比較,P<0.05 ;*:與 Model組比較,P<0.05。圖4 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜中IL-1β蛋白表達(dá)的影響
2.5 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜中TNF-α蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光技術(shù)檢測大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜TNF-α蛋白表達(dá)情況,結(jié)果提示,與Sham組相比,Model組頸動脈血管新生內(nèi)膜中TNF-α蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與Model組相比,YDXNT組頸動脈血管新生內(nèi)膜中TNF-α蛋白表達(dá)明顯降低36.6%(P<0.05,見圖5)。
A:免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠血管新生內(nèi)膜中TNF-α的代表性圖片,新生內(nèi)膜為虛線所圈處(標(biāo)尺= 20 μm);B:免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠血管新生內(nèi)膜中TNF-α平均熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;與 Sham組比較,P<0.05 ;*:與 Model組比較,P<0.05 。圖5 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜中TNF-α蛋白表達(dá)的影響
2.6 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜中MCP-1蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光技術(shù)檢測大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜MCP-1蛋白表達(dá)情況,結(jié)果提示,與Sham組相比,Model組頸動脈血管新生內(nèi)膜中MCP-1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與Model組相比,YDXNT組頸動脈血管新生內(nèi)膜中MCP-1蛋白表達(dá)明顯降低64.1%(P<0.05,見圖6)。
A:免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠血管新生內(nèi)膜中MCP-1的代表性圖片,新生內(nèi)膜為虛線所圈處(標(biāo)尺= 20 μm);B:免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠血管新生內(nèi)膜中MCP-1平均熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;與 Sham組比較,P<0.05;*:與 Model組比較,P<0.05。圖6 YDXNT對球囊損傷后大鼠頸動脈血管新生內(nèi)膜中MCP-1蛋白表達(dá)的影響
球囊導(dǎo)管術(shù)損傷所致大鼠頸動脈血管內(nèi)膜增生模型是研究PCI術(shù)后血管內(nèi)膜增生的經(jīng)典模型,具有創(chuàng)面小、操作簡單、造模時間短、成功率高等優(yōu)點(diǎn),且在球囊損傷后第14天時血管內(nèi)膜增生最明顯[7]。因此,本研究采用以上方法建立大鼠頸動脈血管內(nèi)膜增生模型。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),0.5 、1.0 g/kg的YDNXT均可以抑制該模型的頸動脈血管新生內(nèi)膜形成,而1.0 g/kg的YDNXT療效更佳[5],因此,本研究選擇1.0 g/kg的YDNXT進(jìn)行后續(xù)研究。本研究HE染色結(jié)果顯示,模型組頸動脈血管新生內(nèi)膜形成,管腔狹窄,提示該動物模型建立成功;給予YDXNT后,球囊損傷所致頸動脈血管新生內(nèi)膜的增生得到明顯減輕,頸動脈管腔增大,確證YDXNT可改善球囊損傷所致大鼠頸動脈血管內(nèi)膜增生。
PCI術(shù)后血管內(nèi)膜增生發(fā)生再狹窄的機(jī)制涉及內(nèi)皮損傷、血栓形成、血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)換、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)等[8]。當(dāng)血管內(nèi)皮損傷后,血小板聚集并合成和釋放多種炎癥因子,引起局部炎癥反應(yīng),促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移,誘導(dǎo)新生內(nèi)膜形成,導(dǎo)致血管再狹窄的發(fā)生[9]。因此,抑制炎癥反應(yīng)是改善血管內(nèi)膜增生的重要策略之一。
CaN/NFAT信號通路在血管內(nèi)皮損傷、調(diào)節(jié)免疫功能以及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[10-11]。CaN是一種Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白磷酸酶,在血管內(nèi)皮組織中高表達(dá),對Ca2+濃度較為敏感。當(dāng)血管內(nèi)膜受損后,胞漿Ca2+水平升高激活CaN,進(jìn)而使NFAT脫磷酸化轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控炎癥免疫因子(如IL-1β、TNF-α、MCP-1)等下游靶基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯[12]。而CaN調(diào)控的NFAT轉(zhuǎn)錄因子主要包括:NFAT1(NFATc2)、NFAT2(NFATc1)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATc3)。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn),miR-137可以通過激活CaN/NFATc3通路促進(jìn)模擬微重力大鼠腦血管平滑肌細(xì)胞的去分化和增殖。李曉云等[6]研究發(fā)現(xiàn),在腹主動脈血管再狹窄大鼠模型中,CaN和NFATc3 mRNA表達(dá)水平較高且血清中MCP-1表達(dá)水平也升高。在本研究中,Model組CaN蛋白表達(dá)水平升高,NFATc3蛋白核轉(zhuǎn)位明顯增多,給予YDXNT后,CaN蛋白表達(dá)水平降低,NFATc3蛋白核轉(zhuǎn)位明顯減少。結(jié)果提示YDXNT可能通過抑制CaN/NFATc3信號通路改善大鼠頸動脈血管內(nèi)膜增生。
IL-1β是重要炎癥因子,在PCI術(shù)后血管再狹窄中發(fā)揮重要作用。IL-1β水平增加可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放粘附分子,也可以促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)合成,導(dǎo)致VSMC表型轉(zhuǎn)換、遷移、增殖,進(jìn)一步促進(jìn)血管異常新生內(nèi)膜形成,最終導(dǎo)致血管再狹窄[14]。TNF-α是一種重要炎性介質(zhì),主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,參與血管再狹窄的形成過程[15]。MCP-1主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞中分泌和合成,通過激活和趨化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移到血管內(nèi)皮損傷部位,參與并加速血管內(nèi)膜異常增生[16]。研究發(fā)現(xiàn),銀丹心腦通軟膠囊通過降低冠心病不穩(wěn)定型心絞痛患者血清中CRP、IL-6和TNF-α表達(dá)水平,減輕炎癥反應(yīng)改善動脈粥樣硬化程度[17]。李曉云等[6]研究發(fā)現(xiàn),在腹主動脈血管再狹窄大鼠模型中,血漿MCP-1表達(dá)水平明顯增高。本研究中,Model組頸動脈血管內(nèi)膜IL-1β、TNF-α、MCP-1蛋白表達(dá)明顯增多,給予YDXNT后,其IL-1β、TNF-α、MCP-1蛋白表達(dá)明顯降低。
綜上所述,YDXNT可以通過抑制CaN/NFATc3信號通路,減輕炎癥反應(yīng),改善球囊損傷所致大鼠頸動脈血管內(nèi)膜增生。