田逸君，侍雯靖，董雅春，張?zhí)鞂殻煊衿?（海軍軍醫(yī)大學(xué)：. 衛(wèi)生毒理學(xué)教研室； . 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 上海 200433）

山莨菪堿是托品酸和有機(jī)堿形成的酯類，結(jié)構(gòu)與阿托品和東莨菪堿相類似，在托品基的6位碳原子上有不對(duì)稱的羥基，是一種天然的莨菪烷類生物堿[1-3]。山莨菪堿屬于非選擇性的毒蕈堿受體阻斷劑，能夠阻斷M1和M5受體亞型。因此，山莨菪堿有一系列相似于阿托品的藥理作用[4]，如抑制唾液分泌、抑制胃酸和汗液分泌、抑制胃腸蠕動(dòng)及膀胱收縮，其他還包括散瞳、擴(kuò)張支氣管等[5]，適用于胃或腸道的絞痛、急性微循環(huán)障礙及有機(jī)磷酸中毒等臨床病癥[4，6]。但單獨(dú)使用山莨菪堿用藥劑量大，故常出現(xiàn)口干、面紅、視近物模糊、心跳加快、排尿困難等阿托品樣副作用，因此極大限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。近年來，隨著對(duì)山莨菪堿注射液及其衍生物藥理作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)其膽堿能抗炎通路對(duì)慢性炎癥如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等慢性疾病具有較好的藥效作用[4]。但這些疾病的療程較長(zhǎng)，如何降低或消除山莨菪堿在治療過程中的阿托品樣副作用是臨床現(xiàn)實(shí)問題。

新斯的明是膽堿酯酶抑制劑，進(jìn)入機(jī)體后，通過可逆性抑制膽堿酯酶活性，使乙酰膽堿不能水解，從而提高體內(nèi)受體部位的乙酰膽堿濃度，加強(qiáng)和延長(zhǎng)乙酰膽堿的作用，呈現(xiàn)出全部膽堿能神經(jīng)興奮的效應(yīng)[4]。將毒蕈堿受體阻斷劑和膽堿酯酶抑制劑這兩類藥物以適當(dāng)?shù)谋壤?lián)合使用（即復(fù)方山莨菪堿）來協(xié)同激活膽堿能抗炎通路，增強(qiáng)其抗炎效果并降低其副作用的治療方案，有望為臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供新的治療方案[4]。

前期的研究結(jié)果顯示：通過將鹽酸消旋山莨菪堿與甲硫酸新斯的明組合制備而成的復(fù)方山莨菪堿注射液不僅對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有良好的抗炎效果，還可明顯降低山莨菪堿的阿托品樣不良反應(yīng)。但目前國(guó)內(nèi)外未見有關(guān)復(fù)方山莨菪堿注射液遺傳毒性安全性評(píng)價(jià)方面的研究報(bào)道。為提高臨床用藥的安全性，本實(shí)驗(yàn)采用鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）、體外培養(yǎng)CHO細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和ICR小鼠骨髓微核試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)其是否具有遺傳毒性，為進(jìn)一步的臨床研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物及溶媒對(duì)照

受試物為復(fù)方山莨菪堿注射液,兩種成分的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)式詳見圖1和圖2（無色澄明溶液，批號(hào)20101222；規(guī)格：5 ml中含鹽酸消旋山莨菪堿1 g與甲硫酸新斯的明2 mg；由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系提供）。溶媒對(duì)照為氯化鈉注射液（無色透明液體，批號(hào)110714K2，安徽豐原藥業(yè)股份有限公司）。

圖1 消旋山莨菪堿結(jié)構(gòu)式 [7]

圖2 甲硫酸新斯的明結(jié)構(gòu)式 [7]

1.2 菌株及細(xì)胞

組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）TA1535、TA102、 TA100、TA98和TA97 5個(gè)菌株，由復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生教研室贈(zèng)予，儲(chǔ)存于液氮中。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行菌株鑒定，均符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。CHO細(xì)胞由國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心贈(zèng)予。

1.3 大鼠肝微粒體酶S9

購(gòu)自美國(guó)MOLTOX公司（批號(hào)分別為2765和2715，有效期至：2013-05-17和2012-02-12），保存于-80 ℃冰箱。

1.4 動(dòng)物

選用60只SPF級(jí)的ICR小鼠，雌雄各半（上海市西普爾-必凱動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)2008001616722）。檢疫期為3 d，每日觀察動(dòng)物的外觀、糞便和攝食等情況并記錄。自購(gòu)入日起的當(dāng)日和檢疫結(jié)束當(dāng)日共兩次稱量所有動(dòng)物的體重（檢疫結(jié)束時(shí)的體重：雌鼠21.24～23.74 g; 雄鼠21.32～23.72 g），且根據(jù)該體重將雌、雄小鼠分別按隨機(jī)區(qū)組法分組，共分為6組，每組10只。

1.5 試驗(yàn)方法

按《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》等[8-9]的設(shè)計(jì)要求，選用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)[10]，體外染色體畸變?cè)囼?yàn)[11]和體內(nèi)微核試驗(yàn)[12]來全面評(píng)價(jià)復(fù)方山莨菪堿注射液的遺傳毒性。

1.5.1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)[13-17]

應(yīng)用組氨酸缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌TA1535、TA102、TA100、TA98和TA97共5種菌株進(jìn)行測(cè)試。對(duì)不受溶解度或細(xì)胞毒性限制的受試物最高濃度應(yīng)達(dá)到5 mg/皿[10]，故設(shè)復(fù)方山莨菪堿注射液（以5 ml中含鹽酸消旋山莨菪堿1 g與甲硫酸新斯的明2 mg為計(jì)）總劑量為0.5、5、50、500、5 000 μg/皿共5組，此外還有對(duì)照組，包括空白對(duì)照、溶媒對(duì)照和陽性對(duì)照。按標(biāo)準(zhǔn)的平板摻入法操作，細(xì)菌在有或沒有S9代謝活化系統(tǒng)（-S9組在每個(gè)平皿的試驗(yàn)體系中加入0.5 ml的磷酸緩沖液，+S9組在每個(gè)平皿的試驗(yàn)體系中加入0.5 ml的S9混合液）的平行條件下，將相應(yīng)濃度的受試物溶液、溶媒對(duì)照品（氯化鈉注射液）或陽性對(duì)照品溶液分別加入到無菌的試管中（表1和表2）0.1 ml，每個(gè)組別均設(shè)3個(gè)平行。以上所有物質(zhì)與頂層瓊脂混勻后，迅速鋪澆到底層瓊脂平板上，待其凝固后倒置培養(yǎng)48～72 h，通過肉眼或顯微鏡仔細(xì)觀察各劑量組的菌苔是否正常，區(qū)分受試物沉淀與白色菌落，判斷是否有由受試物導(dǎo)致的明顯抑菌現(xiàn)象，接著采用手工計(jì)數(shù)的方法記錄每皿中全部回復(fù)突變的菌落數(shù)量，統(tǒng)計(jì)3個(gè)平行皿的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，與溶媒對(duì)照組進(jìn)行比較。按上述操作再驗(yàn)證一次。

表1 復(fù)方山莨菪堿注射液的第1次Ames試驗(yàn)結(jié)果(個(gè)/皿， +s，n=3)

表1 復(fù)方山莨菪堿注射液的第1次Ames試驗(yàn)結(jié)果(個(gè)/皿， +s，n=3)

陽性對(duì)照品：-S9組TA97、TA98敵克松（50 μg/皿），TA100、TA102 甲基磺酸甲酯（1 μg皿）；TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物（0.5 μg/皿)+S9組TA97、TA98、TA100 2-AF（10 μg/皿）；TA102 1,8-二羥基蒽醌（50 μg/皿）；TA1535環(huán)磷酰胺（50 μg/皿）

劑量組(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 76.7±4.2 76.3±3.2 46.3±2.3 38.3±6.8 96.3±10.5 112.7±17.0 123.0±2.6 170.7±38.3 15.3±5.0 33.3±9.5 500 69.3±8.3 112.0±12.2 46.0±1.7 45.7±9.7 97.3±11.4 115.3±17.9 187.0±53.8 166.7±41.6 28.3±4.5 30.7±2.1 50.0 74.7±1.2 83.7±14.8 36.7±7.0 39.3±12.8 85.3±3.0 132.7±20.0 183.3±5.7 159.0±36.8 31.3±8.1 30.0±10.5 5.0 76.7±12.3 64.7±11.0 40.7±12.2 36.3±13.6 138.7±47.4 137.7±15.9 158.3±17.4 155.0±32.6 25.3±3.2 27.3±8.3 0.5 63.0±5.2 74.0±20.3 42.7±12.8 36.3±11.9 138.0±45.4 119.3±10.3 176.0±44.2 170.7±40.0 23.3±1.2 29.3±5.7空白對(duì)照 90.7±29.5 78.7±2.3 35.0±4.4 41.3±8.1 119.3±14.0 125.3±9.2 201.3±21.4 192.0±20.8 27.3±6.8 28.0±3.6溶媒對(duì)照 72.0±12.0 72.0±11.1 35.3±2.3 37.0±2.0 121.3±9.0 123.3±9.4 167.3±18.6 210.0±25.0 32.3±6.6 30.0±2.0陽性對(duì)照653.3±83.3 583.3±28.9 714.0±53.0 625.3±162.0 802.7±140.9 651.0±64.5 1 093.3±122.2 1 026.7±83.2 622.7±189.9 752.0±44.5

表2 復(fù)方山莨菪堿注射液的第2次Ames試驗(yàn)結(jié)果(個(gè)/皿， +s，n=3)

表2 復(fù)方山莨菪堿注射液的第2次Ames試驗(yàn)結(jié)果(個(gè)/皿， +s，n=3)

陽性對(duì)照品：-S9組TA97、TA98敵克松（50 μg/皿），TA100、TA102 甲基磺酸甲酯（1 μg皿）；TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物（0.5 μg/皿)+S9組TA97、TA98、TA100 2-AF（10 μg/皿）；TA102 1,8-二羥基蒽醌（50 μg/皿）；TA1535環(huán)磷酰胺（50 μg/皿）

劑量組(μg/皿)TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 65.0±23.4 64.7±15.7 17.0±3.5 25.7±1.5 74.3±1.0 89.0±4.4 108.3±6.6 102.7±19.2 18.3±2.1 16.0±3.5 500 73.0±6.1 69.0±12.1 22.0±6.9 20.3±2.9 82.3±24.4 97.7±7.8 162.0±45.4 169.3±31.0 20.0±4.6 19.0±5.6 50.0 74.0±26.4 78.3±7.1 20.0±6.2 24.3±7.5 82.3±29.4 88.0±8.2 188.3±4.5 157.0±37.6 22.0±5.3 20.0±3.6 5.0 60.7±16.8 58.0±8.0 24.0±3.0 21.3±3.9 92.0±45.2 89.7±10.0 162.7±51.0 161.0±35.0 22.7±9.8 21.0±3.6 0.5 56.7±8.1 68.7±11.8 21.0±6.0 19.0±1.7 104.0±31.2 97.7±7.6 143.0±56.2 157.3±41.0 20.0±2.6 24.0±2.0空白對(duì)照80.7±7.0 76.7±2.1 25.3±2.5 22.3±6.8 110.0±10.0 102.7±30.6 221.3±34.0 151.0±36.8 17.3±3.0 15.0±5.2溶媒對(duì)照85.7±7.6 84.0±7.0 24.0±5.2 21.3±3.0 111.3±21.9 92.3±7.4 169.3±18.0 155.0±32.4 30.3±9.3 23.3±5.0陽性對(duì)照660.0±66.8 581.0±157.0 564.0±65.8 618.7±112.1 565.3±65.2 657.3±115.7 1 064.0±24.0 1 044±26.2 552.0±78.0 597.0±89.3

1.5.2 體外染色體畸變?cè)囼?yàn)[13-17]

采用體外培養(yǎng)的CHO細(xì)胞在有或沒有S9代謝活化系統(tǒng)的平行條件下進(jìn)行測(cè)試。預(yù)試驗(yàn)最高濃度設(shè)定為5 mg/ml，再按等比級(jí)數(shù)設(shè)計(jì)若干個(gè)濃度。正式試驗(yàn)的最高濃度產(chǎn)生的細(xì)胞毒性應(yīng)約為50%[11]。故根據(jù)預(yù)試驗(yàn)測(cè)定IC50（50 %細(xì)胞生長(zhǎng)抑制濃度）為235.0 μg/ml，因此一共設(shè)3個(gè)劑量組，依次為58.75、117.5和235.0 μg/ml，另設(shè)陽性對(duì)照組（-S9組為0.5 μg/ ml絲裂霉素C溶液，+S9組為60 μg/ ml環(huán)磷酰胺溶液）和溶媒對(duì)照組（氯化鈉注射液），每個(gè)組別均設(shè)2個(gè)平行。-S9/4 h組和+S9/4 h組：受試物作用細(xì)胞4 h后棄全部培養(yǎng)基，用PBS洗滌后重新添加新的10 ml 1 640完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h后收集細(xì)胞；-S9/24 h組：受試物作用細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞。終止培養(yǎng)前4 h加入20 μg/ml秋水仙堿，目的是使大部分細(xì)胞的有絲分裂停止在中期相，所有細(xì)胞依次經(jīng)過0.75% KCl低滲、固定（甲醇∶冰乙酸=3∶1）、涂片和Gimsa染色處理，在顯微鏡下選擇染色體數(shù)目完整且分散良好的中期分裂相染色體作為觀察對(duì)象，觀察染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的改變。分別記錄各組含有結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w的細(xì)胞數(shù)和畸變類型（表3），計(jì)算每組的染色體畸變率。

表3 復(fù)方山莨菪堿注射液對(duì)體外培養(yǎng)CHO細(xì)胞的染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

1.5.3 體內(nèi)微核試驗(yàn)[13-17]

采取與臨床擬用途徑一致的給藥方式[12]，對(duì)ICR小鼠采用單次經(jīng)尾靜脈注射的給藥方式。根據(jù)受試物急性毒性的試驗(yàn)結(jié)果：半數(shù)致死量LD50為60.4 mg/kg。本次試驗(yàn)的最高劑量為1/2 的LD50，最高劑量之下的其他劑量保持劑量間距為2～3倍[12]。故共設(shè)3個(gè)劑量組（分別為7.5、15.0和30.0 mg/kg），及溶媒對(duì)照組（氯化鈉注射液，給藥方式與受試物組相同）和陽性對(duì)照組（劑量為40 mg/kg的環(huán)磷酰胺溶液，臨用時(shí)用氯化鈉注射液配制成4.0 mg/ml的環(huán)磷酰胺溶液，給藥方式為單次腹腔注射），給藥容積均為10 ml/kg。因此，總共有六組，其中的高劑量組有兩組，分別在藥物作用24 h和48 h后處死，除高劑量48 h組外，其他組均在藥物作用24 h后處死。取小鼠兩側(cè)大腿股骨制備骨髓涂片，每只小鼠制2張骨髓片，自然干燥后染色。所有動(dòng)物均鏡檢約1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE），計(jì)數(shù)含微核的PCE數(shù)（MNPCE），統(tǒng)計(jì)微核發(fā)生率，在記錄200個(gè)PCE的同時(shí)計(jì)數(shù)觀察到的所有正染紅細(xì)胞（NCE）的數(shù)量（表4），通過PCE/NCE值來評(píng)價(jià)受試物是否具有骨髓毒性。

1.6 判定標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的結(jié)果判定是將各劑量組的受試物與溶媒對(duì)照組的回復(fù)突變菌落數(shù)進(jìn)行比較，如果某個(gè)組別的回復(fù)突變菌落數(shù)是溶媒對(duì)照組突變菌落數(shù)的2倍及以上，且可重復(fù)性，并在劑量范圍內(nèi)存在著劑量-反應(yīng)關(guān)系，則判斷為陽性；體外染色體畸變?cè)囼?yàn)和體內(nèi)微核試驗(yàn)的結(jié)果，也是與溶媒對(duì)照組進(jìn)行比較，均采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

所有平皿經(jīng)均未見雜菌污染，可觀察到目標(biāo)菌苔的正常生長(zhǎng)。所有菌株的自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)和陽性物誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)都在歷史對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)的范圍內(nèi)，且陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比回復(fù)突變菌落數(shù)是顯著增加的，該結(jié)果提示整個(gè)試驗(yàn)系統(tǒng)符合要求[13-17]。最高濃度已達(dá)到5 mg/皿時(shí)，未觀察到復(fù)方山莨菪堿注射液的抑菌現(xiàn)象。兩種平行條件下，即有或沒有S9代謝活化系統(tǒng)中，各劑量組的受試物所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均與自發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)接近，未見明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。兩次結(jié)果見表1和表2。

2.2 體外染色體畸變?cè)囼?yàn)

經(jīng)顯微鏡觀察，陽性對(duì)照組能顯著誘發(fā)細(xì)胞染色體的畸變，與溶媒對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），驗(yàn)證了該系統(tǒng)的有效性[13-17]；復(fù)方山莨菪堿注射液各劑量組的CHO細(xì)胞染色體畸變率與溶媒對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表3。

2.3 體內(nèi)微核試驗(yàn)

各劑量組小鼠在給藥后未見異常，且未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。雌、雄小鼠在給予陽性對(duì)照品后，其骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核發(fā)生率與溶媒對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示試驗(yàn)系統(tǒng)符合要求[13-17]。復(fù)方山莨菪堿注射液各劑量組的雌、雄小鼠骨髓PCE/(PCE+NCE) ＞ 50%，即受試物對(duì)骨髓無抑制作用，各劑量組微核率與溶媒對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表4。

3 討論

作為單藥，山莨菪堿與甲硫酸新斯的明均已進(jìn)行過完整的遺傳毒性評(píng)價(jià)，且皆為陰性。但既往研究表明，藥物聯(lián)合作用可改變單藥的致突變性。用TA98、TA100和TA102菌株對(duì)順鉑和卡鉑與新斯的明、博萊霉素、5-氟尿嘧啶和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合用藥的遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)藥物之間的相互作用會(huì)產(chǎn)生抗致突變性作用，聯(lián)合用藥時(shí)的致突變性比單藥要低[18]。復(fù)方山莨菪堿是由鹽酸消旋山莨菪堿與甲硫酸新斯的明按照500:1的比例組成的復(fù)方注射劑，為考察其是否會(huì)產(chǎn)生與單藥不同的遺傳毒性，本研究按照《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[8]推薦的組合方法，分別從體外到體內(nèi)，從微生物、離體細(xì)胞和整體動(dòng)物水平上對(duì)復(fù)方山莨菪堿注射液的遺傳毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，該試驗(yàn)組合能檢測(cè)染色體畸變、基因突變等多個(gè)遺傳學(xué)終點(diǎn)[8-9]。Ames試驗(yàn)表明復(fù)方山莨菪堿注射液在0.5、5、50、500、5 000 μg/皿受試劑量下，兩種平行條件下，即有或沒有S9代謝活化系統(tǒng)時(shí)，與溶媒對(duì)照組的突變菌落數(shù)進(jìn)行比較，各劑量組所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均和其相近。CA試驗(yàn)結(jié)果表明58.75、117.5和235.0 μg/ml 3個(gè)劑量的受試物，所有劑量在兩種平行的系統(tǒng)條件下（即有或沒有S9代謝活化系統(tǒng)時(shí)）對(duì)CHO細(xì)胞的染色體無明顯的畸變影響。MNT試驗(yàn)設(shè)的7.5、15.0和30.0 mg/kg 3個(gè)劑量，對(duì)ICR小鼠骨髓的微核誘發(fā)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以上結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)條件下,復(fù)方山莨菪堿注射液對(duì)鼠傷寒沙門氏菌無致突變性，對(duì)哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞染色體無致畸變作用，對(duì)ICR小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞無誘發(fā)微核的效應(yīng)；此也提示復(fù)方山莨菪堿注射液在受試條件下對(duì)人體不具有潛在致癌性和遺傳毒性。

綜上可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下結(jié)果提示復(fù)方山莨菪堿注射液不具有遺傳毒性和潛在致癌性，與單方相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論基本相符，本研究結(jié)果為該藥的臨床安全性評(píng)價(jià)提供了前期科學(xué)依據(jù)。