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宏基因組二代測序在非HIV感染型肺孢子菌肺炎中的應(yīng)用研究*

2023-02-04 12:00:04陳佳怡夏銨冬耿嘉蔚
重慶醫(yī)學(xué) 2023年1期
關(guān)鍵詞:測序入院標(biāo)本

陳佳怡,梁 曉,夏銨冬,楊 蕓,袁 兵,耿嘉蔚△

(云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院:1.感染性疾病及肝病科;2.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,昆明 650032)

肺孢子菌肺炎(PJP)是由耶氏肺孢子菌(Pj)感染引起的疾病,常見于艾滋病患者和其他免疫機能低下宿主。近年來隨著免疫抑制藥物的使用,非HIV感染者的PJP越來越引發(fā)關(guān)注。既往經(jīng)驗來看,非HIV感染PJP患者往往比HIV感染者發(fā)病更急、疾病進展更快、重癥化概率和死亡率更高[1-2],因此早期診斷尤為重要。在現(xiàn)有臨床Pj檢測手段中,特殊染色鏡檢的病原檢出率低,免疫組織化學(xué)和PCR等[3]在多數(shù)臨床機構(gòu)中應(yīng)用有限。近年來,隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展,宏基因組二代測序(mNGS)在病原學(xué)診斷中有越來越多的實踐,多用于特殊、罕見感染的鑒定和新發(fā)病原體的解析。本研究報道m(xù)NGS輔助診斷非HIV感染型PJP患者情況,結(jié)合既往研究闡述mNGS在非HIV感染型PJP病原學(xué)診斷中的價值和特點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年4月至2021年1月在本院住院并通過mNGS結(jié)合臨床資料診斷PJP的18例患者。入組標(biāo)準:>18歲;具有免疫受損疾病基礎(chǔ)[4](3個月內(nèi)有血液系統(tǒng)或?qū)嶓w惡性腫瘤化療史,自身免疫性疾病、器官移植等疾病史及接受糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制藥物治療>30 d的用藥史,其他免疫功能低下狀態(tài));肺炎伴呼吸困難、低氧血癥或呼吸衰竭表現(xiàn);胸部CT提示彌漫型或斑片狀融合型磨玻璃影(GGO)、小葉間隔增厚網(wǎng)格影等間質(zhì)性病變征象;伴或不伴G試驗、乳酸脫氫酶(LDH)等血清學(xué)檢測結(jié)果支持;外周血或呼吸道標(biāo)本mNGS檢出Pj序列;排除HIV感染。本研究通過本院倫理委員會批準(KHLL2022-KY013)。

1.2 方法

1.2.1臨床資料收集

從住院電子病歷系統(tǒng)中收集入選病例的一般資料,包括性別、年齡、入院時間等,以及發(fā)病時間、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、影像學(xué)檢查、合并癥、傳統(tǒng)呼吸道標(biāo)本病原檢測結(jié)果(涂片+培養(yǎng)等)、二代測序結(jié)果、治療及轉(zhuǎn)歸等臨床資料??筆j治療2周以上進行療效判斷,好轉(zhuǎn)表現(xiàn)為臨床癥狀及生化指標(biāo)改善,肺CT病灶較前吸收好轉(zhuǎn);記錄患者院內(nèi)死亡情況。

1.2.2mNGS檢測

按照采樣標(biāo)準流程采集支氣管肺泡灌洗液(BALF) 5 mL或血標(biāo)本3 mL放置 4 ℃冷藏,并于24 h內(nèi)專人低溫運送至第三方測序中心(華大基因科技有限公司)。測序平臺使用BGISEQ-500進行測序。數(shù)據(jù)分析:測序數(shù)據(jù)下機后去除低質(zhì)量和長度<35 bp的數(shù)據(jù)。通過BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對,將人源基因組序列數(shù)據(jù)去除,再去除低復(fù)雜度序列數(shù)后與專用微生物大數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)比對,按照細菌、真菌、病毒、分枝桿菌和寄生蟲等進行分類和排列。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示。計量資料以M(P25,P75)表示,兩兩比較采用 Mann-WhitneyU檢驗;測序參數(shù)與臨床數(shù)據(jù)進行Spearman秩相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本信息

18例患者中男15例,女3例,中位年齡46歲。所有患者均有腫瘤、腎病或自身免疫性疾病背景,見表1。其中16例患者使用激素+免疫抑制劑治療基礎(chǔ)疾病,使用時間10.5(4.0,24.0)個月,另外2例為正在接受化療的惡性腫瘤患者。

表1 18例患者入院時的一般情況及實驗室檢查

續(xù)表1 18例患者入院時的一般情況及實驗室檢查

2.2 臨床資料

患者以急性、亞急性起病,從起病至mNGS標(biāo)本采集的中位時間為16 d,最短4 d。起病癥狀以發(fā)熱(77.8%)、咳嗽(100.0%)、干咳(50.0%)、氣促(77.8%)為主。所有患者入院時均有不同程度的低氧血癥,氧合指數(shù)(校正大氣壓后)262(215,297),LDH水平473.0(303.5,581.3)U/L。15例患者的血清1,3-β-D葡聚糖276.0(178.9,569.8)pg/mL,15例患者的誘導(dǎo)痰細胞中性粒細胞比例明顯升高達73.08%~97.02%,提示肺炎癥損傷重。所有患者入院72 h內(nèi)均進行了細胞免疫功能評估并記錄 CD4+T淋巴細胞計數(shù),其中8例<200個/μL。18例患者均采集呼吸道標(biāo)本送院內(nèi)涂片及培養(yǎng),2號病例痰培養(yǎng)出敏感嗜麥芽窄食單胞菌,7、11、13號病例痰涂片查見真菌孢子和(或)菌絲,但因?qū)嶒炇覘l件有限未進一步鑒定,其余均為陰性。影像學(xué)上病例均呈現(xiàn)雙肺彌漫性或斑片融合型磨玻璃征,部分可見小葉間隔增厚、網(wǎng)格影、鋪路石征等。

2.3 mNGS結(jié)果

測序標(biāo)本在入院后7~10 d采集,測序結(jié)果均于第三方測序中心收到標(biāo)本約48 h后回報,標(biāo)本檢出Pj菌種嚴格比對的序列數(shù)為14~10 579個,除1例外其余標(biāo)本的Pj序列相對豐度在85%以上(圖1),Pj序列數(shù)在所有檢出微生物種間排名1~14名(圖2)。不同個體之間的Pj序列數(shù)差異較大,與 PJP 的發(fā)病時間、氧合指數(shù)、CD4+T淋巴細胞計數(shù)無明顯相關(guān)性(rs=-0.131、-0.129、-0.040,P>0.05),見表2。Pj序列數(shù)在采樣前是否經(jīng)驗性抗Pj治療(P=0.158)及是否發(fā)生院內(nèi)死亡(P=0.426)的組間比較中也無明顯差異。其他微生物檢出情況:14例患者標(biāo)本檢出病毒序列,其中,9例檢出人類β皰疹病毒5型(CMV)序列,6例檢出人類γ皰疹病毒4型(EBV)序列,2例檢出了單純皰疹病毒(HSV1)序列,1例血標(biāo)本檢出了細環(huán)病毒屬序列。所有BALF標(biāo)本都檢出大量細菌序列并報告了可疑致病菌,其中2號病例檢出軍團菌屬,3號病例檢出李斯特菌、銅綠假單胞菌;2例血標(biāo)本并未檢出細菌序列。

圖1 18例標(biāo)本Pj序列數(shù)及相對豐度

圖2 18例標(biāo)本Pj序列數(shù)在微生物序列中的種間排名

2.4 治療反應(yīng)及預(yù)后

所有患者在采樣前均接受抗菌藥物治療,其中4例患者經(jīng)驗性使用磺胺甲噁唑/甲氧芐啶或棘白菌素類抗Pj治療,其余患者在mNGS結(jié)果回報后加用上述藥物抗Pj治療,部分患者胸部CT特征見圖3。最終3例患者因膿毒癥多器官衰竭而發(fā)生院內(nèi)死亡,其余患者均好轉(zhuǎn)出院隨訪。

表2 Pj序列數(shù)與部分臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

A:2號、4號、12號、15號、16號、18號病例PJP特征表現(xiàn)主要為雙肺彌漫性磨玻璃影,可見網(wǎng)格影和鋪路石征(箭頭)等;B:20號病例抗Pj治療后病灶吸收;C:8號病例從起病局部磨玻璃影(2020-01-23)進展為雙肺彌漫性病變(2020-02-22),最后抗Pj治療好轉(zhuǎn)(2020-03-06)。

3 討 論

PJP是免疫抑制宿主常見的嚴重機會性感染疾病,在國內(nèi)外的報道中,PJP的發(fā)病率在侵襲性真菌感染疾病中排名前4[5-6]。早期診斷對PJP患者的預(yù)后有重要意義[7],然而既往臨床實踐中直接獲得PJP病原學(xué)證據(jù)較為困難,新興的mNGS技術(shù)具有高靈敏度、覆蓋廣、無偏倚的特點,給感染病診斷帶來更多的病原信息,且抗菌藥物使用對mNGS的影響小于傳統(tǒng)培養(yǎng)[8],因此臨床上得以實踐應(yīng)用。

本研究中主要檢測PJP患者的下呼吸道標(biāo)本,盡管Pj也可以在人類Ⅰ型肺泡上皮細胞表面定植生長[9],但免疫正常和免疫抑制人群中的呼吸道病原譜仍有明顯差異。WU等[10]分析了多中心329例重癥肺炎BALF標(biāo)本的mNGS,Pj序列均在免疫受損的肺炎病例中檢出,而免疫功能正常的264例病例中并未檢出,既往大樣本呼吸道標(biāo)本mNGS研究中Pj序列檢出率也并不高[8],提示免疫受損人群的Pj陽性結(jié)果有較大意義。此外,有研究觀察到非HIV型PJP BALF中的Pj載量明顯低于HIV型PJP[11],因此雖然部分標(biāo)本僅檢出少量Pj序列,本研究仍然將此作為支持診斷的重要依據(jù)。

除呼吸道標(biāo)本外,血液 mNGS在PJP診斷中也有良好的敏感性,且一般不受呼吸道定植菌的干擾。在顧鵬等[12]研究中,外周血mNGS對腎臟病合并PJP的診斷靈敏度和特異度達到了94.59%和100%。另一項研究分析了14例腎移植術(shù)后的PJP患者,92.8%的患者均通過外周血或呼吸道標(biāo)本mNGS發(fā)現(xiàn)Pj序列,且與PCR驗證結(jié)果一致[13],值得注意的是,在該研究中呼吸道標(biāo)本匹配到的Pj序列數(shù)(488~29 751)明顯高于血標(biāo)本(6~260),并且在2例患者的4份同源同期標(biāo)本中得到驗證,提示呼吸道標(biāo)本可能有更高的檢測效能。

此外,非HIV型PJP患者常為免疫機能受損的重癥患者,往往非單一病原體感染。在本研究中,BALF測序都報告了可疑致病菌序列,部分檢測出非典型細菌病原體,如軍團菌屬、李斯特菌等,給治療用藥提供了參考。而2例血標(biāo)本測序雖然沒有報告細菌序列,但患者的臨床資料均有細菌性肺炎的表現(xiàn),如咳黃痰、中性粒細胞升高及影像學(xué)實變征等,入院后給予經(jīng)驗性抗菌藥物治療。既往PJP研究中血mNGS的細菌檢出率也僅有21.6%[12],在另一項重癥肺炎(SCAP)的診斷研究中,以血培養(yǎng)為金標(biāo)準,外周血mNGS的敏感性和一致率均不如呼吸道標(biāo)本[14],提示呼吸道標(biāo)本對非HIV型PJP的診療更有優(yōu)勢。

目前對于判斷mNGS檢出序列為致病菌尚無定量標(biāo)準,有研究提出Pj序列的相對豐度>85%或序列數(shù)排名前15名可能提供較滿意的診斷閾值[15]。在本研究中,17例標(biāo)本中Pj序列相對豐度>85%,包括2例血標(biāo)本。也有研究觀察到血標(biāo)本中Pj序列相對豐度差異較大分布離散[12],由于均為小樣本觀察性研究,還需要更多前瞻性研究來進一步驗證。此外,測序結(jié)果不能單一解讀,共識建議[16]若mNGS結(jié)果符合患者的臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢查,可以根據(jù)結(jié)果指導(dǎo)臨床決策。

本組病例的誘導(dǎo)痰細胞分類發(fā)現(xiàn)中性粒細胞明顯升高,且入院時均有不同程度的低氧血癥或呼吸衰竭,提示患者肺炎癥損傷重。有研究對比了HIV型PJP患者的BALF細胞分類,在非HIV患者中觀察到更高的中性粒細胞計數(shù),間接提示非 HIV型PJP有更嚴重的肺損傷[11]。影像學(xué)上,PJP典型的CT特征為雙肺散在斑片樣或彌漫性磨玻璃影、小葉間隔增厚,但不具有特異性。血清G試驗可以輔助診斷PJP,但需要和其他真菌如念珠菌屬、鐮刀菌屬、曲霉菌屬等感染相鑒別。有研究認為下呼吸道標(biāo)本PCR結(jié)合G試驗可以有效地區(qū)分PJP定植和感染[17-18],但G試驗最佳診斷閾值各不相同,需要進一步驗證。此外,mNGS指導(dǎo)抗菌藥物調(diào)整后的治療反應(yīng)也可以作為依據(jù)。本研究不足之處在于缺乏特殊染色等驗證試驗,還有部分患者隨訪不足,未能觀察到疾病的遠期變化,未來需要前瞻性研究設(shè)計來改進。

綜上所述,在非HIV感染型PJP的診斷中,BALF和血標(biāo)本mNGS均有較好的靈敏度。非HIV型PJP往往呈現(xiàn)重癥化和混合感染的趨勢,條件允許時仍建議優(yōu)選下呼吸道標(biāo)本如BALF送檢,以獲得更全面的病原學(xué)信息。此外,Pj序列的相對豐度對致病菌的判定可能有提示作用,Pj序列數(shù)與臨床指標(biāo)及預(yù)后無明顯相關(guān),但需要前瞻性更大樣本研究來驗證。mNGS的結(jié)果需要綜合其他臨床資料綜合判斷。

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