張 帆,唐友明,鄭景輝,林壽寧,朱永蘋△

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康臨床醫(yī)學(xué)院，南寧 530002)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以胃黏膜上皮和腺體萎縮，黏膜變薄，黏膜肌層增厚為特征的一種常見消化系統(tǒng)疾病[1-2]，其已被世界衛(wèi)生組織列為癌前疾病，癌變率0.5%～1.0%[3-4]。隨著現(xiàn)代中醫(yī)藥的進步，學(xué)者們從中藥單體及復(fù)方治療CAG進行各類研究[5-6]。近年來發(fā)現(xiàn)YTH結(jié)構(gòu)域N6-甲基腺嘌呤RNA結(jié)合蛋白1(YTHDF1)、YTH結(jié)構(gòu)域N6-甲基腺嘌呤RNA結(jié)合蛋白2(YTHDF2)在各類癌癥細胞中均有表達，對于癌細胞的遷移、增殖等都起到關(guān)鍵作用。敲低YTHDF1、YTHDF2表達后，能夠抑制胃癌細胞增殖并促進細胞凋亡的發(fā)生[7]。課題組經(jīng)過十幾年的研究探索，證實安胃湯對CAG的療效較好[8-9]。m6A“閱讀者”(reader)負責(zé)識別m6A位點，在RNA修飾中起到關(guān)鍵作用[10-12]。本研究以CAG大鼠為模型，觀察安胃湯對YTHDF1、YTHDF2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，雄性，SPF級，體重(110±10) g，購自湖南萊克景達實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK桂2019-0001，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物福利倫理委員會批準(zhǔn)(DW20190310-045)。安胃湯：半夏13 g，黃連5 g，干姜5 g，烏藥7 g，丹參15 g，百合20 g，白芍20 g，薏苡仁10 g，炙甘草5 g，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥劑科鑒定。陽性對照藥物胃復(fù)春片(購自杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司)，每片0.359 g。

1.2 主要儀器和試劑

Infinite M200 PRO型全波長多功能酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司；ChemiDoc MP全能型成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；羅氏Light cycler 96型熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。造模劑脫氧膽酸鈉(批號：SLBZ6975)和氨水(批號：SHBK0854)均購自美國Sigma Aldrich公司。廣譜磷酸酶抑制劑混合物(批號：15J09A83)、增強型RIPA裂解液(批號：14I03A02)、BCA蛋白定量試劑盒(批號：14G08A460)、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物(批號：#1927c03)均購自武漢博士德生物工程有限公司；SYBR qPCR Master Mix(批號：7E342F9)、RT Super Mix for qPCR(批號：7E352K9)、RNA-easy TM Isolation Reagent(批號：7E303H9)均購自南京諾唯贊生物技術(shù)股份有限公司；兔抗鼠YTHDF1抗體(批號：GR3267175-6)購自英國Abcam 公司，兔抗鼠YTHDF2抗體(批號：1#80014S)購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗鼠GAPDH抗體(批號：00078427)購自武漢三鷹技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1實驗動物模型建立

SPF級SD大鼠72只，造模組大鼠從造模第1天開始0.5 g/L氨水和20 mmol/L脫氧膽酸鈉溶液交替自由飲用，每天1次，饑飽失常喂養(yǎng)，共持續(xù)16周[13]；正常組正常飼養(yǎng)。

1.3.2分組及給藥方法

確認病理模型構(gòu)建成功后將CAG大鼠分為陰性對照組、安胃湯高劑量組、安胃湯中劑量組、安胃湯低劑量組、陽性對照組。參照《藥理實驗方法學(xué)》中標(biāo)準(zhǔn)動物的等效劑量折算系數(shù)法計算給藥劑量，安胃湯高、中、低劑量組安胃湯給藥劑量分別為20.6 g/kg、10.3 g/kg、5.15 g/kg(成人臨床劑量的12、6、3倍)，胃復(fù)春混懸液[14]給藥作陽性對照，劑量為4.43 g/kg，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃28 d，正常組與陰性對照組給予等體積的蒸餾水。

1.3.3樣本采集與病理檢測

各組藥物干預(yù)處理后，禁食24 h，將大鼠用10%水合氯醛按體重0.3 mL/100 g麻醉，剖腹取全胃，沿胃大彎剪開，并向胃竇近幽門口至胃大彎方向取1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm胃組織。通過HE法染色處理后在高倍鏡下觀察炎性細胞浸潤、腺體數(shù)量、上皮細胞形態(tài)等病理情況。

1.3.4實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測大鼠YTHDF1、YTHDF2 mRNA表達

提取研磨后的大鼠胃組織總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。稀釋后取2.5 μmol/L基因引物進行qRT-PCR，以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)配置體系共20 μL。PCR反應(yīng)體系溶液為2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，正向引物(10 mmol/L) 0.4 μL，反向引物(10 mmol/L) 0.4 μL，Template DNA/cDNA 5 μL，最后加入RNase Free ddH2O至總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性(1個循環(huán)95 ℃ 30 s)；循環(huán)反應(yīng)(40個循環(huán)95 ℃ 3～10 s，60 ℃ 10～30 s)；溶解曲線(1個循環(huán) 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s)。擴增40個循環(huán)后計算Ct值，以2-ΔΔct計算目的基因的相對表達量?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 基因引物序列

1.3.5Western blot檢測大鼠YTHDF1、YTHDF2蛋白表達

將RIPA裂解液與研磨后的胃組織混合并離心取上清液，按照蛋白濃度加入適量緩沖液，電泳分離蛋白后利用PVDF膜形成蛋白印跡，5%BSA封閉蛋白空隙。分別用YTHDF1和YTHDF2抗體4 ℃孵育過夜特異性識別目的蛋白，25 ℃孵育二抗催化顯色劑。最后使用ECL發(fā)光劑顯色，凝膠全能型成像分析系統(tǒng)成像拍照，以目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的比值作為相對定量，分析各樣品中目標(biāo)蛋白表達的差別。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胃組織病理檢測情況

正常組胃黏膜組織各層結(jié)構(gòu)完整，胃底腺組織較多且排列規(guī)整，無萎縮、中性粒細胞浸潤、腸上皮化生等組織學(xué)的胃炎狀態(tài)；陰性對照組大鼠的胃黏膜固有層可見炎癥細胞浸潤，胃底固有腺體組織因萎縮導(dǎo)致數(shù)目、體積明顯減少，透見網(wǎng)狀、樹枝狀血管，排列不規(guī)則；安胃湯高劑量組慢性炎癥細胞浸潤明顯減少，與陰性對照組相比，胃底腺體組織明顯增多，排列規(guī)整，萎縮有明顯改善；安胃湯中劑量組可見炎癥細胞浸潤有改善傾向，雖可見胃底腺組織，但量少，結(jié)構(gòu)排列較為規(guī)則，仍可見萎縮表現(xiàn)；安胃湯低劑量組固有腺體減少，黏膜固有層可見炎癥細胞浸潤；陽性對照組胃黏膜組織各層結(jié)構(gòu)較為整齊，固有層腺體排列較為緊密規(guī)則，見圖1。

圖1 各組大鼠胃組織病理染色光鏡觀察圖(HE染色，×200)

2.2 各組大鼠胃組織YTHDF1、YTHDF2 mRNA表達比較

與正常組比較，陰性對照組大鼠胃組織YTHDF1、YTHDF2 mRNA表達明顯升高(P<0.05)；與陰性對照組比較，安胃湯高劑量組、中劑量組及陽性對照組大鼠胃組織YTHDF1、YTHDF2 mRNA表達明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見表2。

表2 各組大鼠胃組織YTHDF1和YTHDF2 mRNA表達比較

2.3 各組大鼠胃組織YTHDF1和YTHDF2蛋白表達比較

與正常組比較，陰性對照組大鼠胃組織YTHDF1、YTHDF2蛋白表達明顯升高 (P<0.05)。與陰性對照組比較，安胃湯高劑量組、中劑量組和陽性對照組YTHDF1、YTHDF2蛋白表達明顯降低，呈劑量依賴性，見圖2和表3。

圖2 各組大鼠胃組織YTHDF1、YTHDF2蛋白印跡圖

表3 各組大鼠胃組織YTHDF1和YTHDF2蛋白表達比較

3 討 論

m6A甲基化在CAG治療應(yīng)用研究較少。很多惡性腫瘤都會伴隨表觀遺傳異常，異常表達的相關(guān)基因很有可能作為CAG早期診斷及預(yù)后的標(biāo)志物新靶點[15]。在m6A調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，無論癌細胞和正常組織都存在變化趨勢，說明m6A甲基化這一重要的表觀遺傳學(xué)修飾可能在炎癌轉(zhuǎn)變中密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)YTHDF1和YTHDF2作為m6A甲基化中的識別蛋白，在影響基因水平方面扮演重要角色，YTH結(jié)構(gòu)域蛋白中影響明顯[16-18]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，陰性對照組的YTHDF1和YTHDF2 mRNA和蛋白表達明顯升高(P<0.05)；而與陰性對照組比較，安胃湯高劑量組、中劑量組的YTHDF1和YTHDF2 mRNA和蛋白表達均明顯下降(P<0.05)。

YTHDF2可靶向影響mRNA的定位，RNA結(jié)合蛋白(RBPs)可以調(diào)節(jié)炎癥基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性，激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子-κB(NF-κB)信號通路，從而促進促炎細胞因子的表達，參與炎癥過程的調(diào)節(jié)[19]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)MAPK和NF-κB 信號通路，可明顯改善胃組織萎縮，減輕黏膜炎性反應(yīng)[20-22]，抑制癌前病變[23-24]。對于通過影響YTHDF2表達改善CAG的炎癥具有理論指導(dǎo)意義。

YTHDF1通過Wnt/β-catenin通路在細胞自我更新和分化中發(fā)揮重要的致癌作用，可增強腫瘤M1巨噬細胞極化和CD8+T細胞浸潤，同時增強PD-L1免疫抑制劑的作用[25-26]。Wnt拮抗基因高甲基化狀態(tài)可能與CAG的發(fā)生相關(guān)[27-28]。有研究表明Wnt參加了炎癌轉(zhuǎn)變的發(fā)生過程，是促癌進程的關(guān)鍵基因[29]。調(diào)節(jié)YTHDF1進而影響Wnt/β-catenin通路改善CAG的治療理念值得進一步探索。

綜上所述，安胃湯高劑量可以降低CAG大鼠胃組織中YTHDF1、YTHDF2 mRNA和蛋白表達，修復(fù)CAG大鼠胃黏膜損傷，恢復(fù)胃黏膜功能，抑制炎癌轉(zhuǎn)變，可能與調(diào)節(jié)YTHDF1和YTHDF2表達有關(guān)，具體機制有待進一步研究。