孔 丹，李 偉

( 長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025 )

醛酮還原酶(AKR)超家族是一類動(dòng)力學(xué)相似的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，醛酮還原酶家族成員多數(shù)以37 ku的單體形式存在，廣泛分布于細(xì)菌、真菌、植物、原生動(dòng)物、動(dòng)物中，是一類在醛和酮還原中具有多種功能的依賴還原型輔酶Ⅱ的氧化還原酶[1]。所有已知的醛酮還原酶家族成員都有一個(gè)保守的(β/α)8或丙糖磷酸異構(gòu)酶(TIM)桶基序，以及一些決定底物特異性的可變環(huán)和螺旋[2]。醛酮還原酶成員在生物體中對(duì)醛酮類化合物起到很重要的解毒作用，可分為醛糖還原酶、醛酮還原酶、乙醛還原酶、強(qiáng)化類固醇脫氫酶和二氫二醇脫氫酶，與癌癥侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性等問(wèn)題的發(fā)生密切相關(guān)[3]。醛酮還原酶基因作為應(yīng)激調(diào)節(jié)基因，參與氧化脅迫下的解毒調(diào)節(jié)機(jī)制，影響生物體內(nèi)氧化應(yīng)激與免疫調(diào)節(jié)[4]。目前，對(duì)于魚類這些低等脊椎動(dòng)物的醛酮還原酶基因及其功能報(bào)道非常匱乏，亟需深入研究。

重金屬脅迫對(duì)魚類免疫調(diào)控以及氧化應(yīng)激過(guò)程有重要作用，即使低劑量的重金屬也對(duì)水生動(dòng)物有巨大傷害。鎘嚴(yán)重影響了生物的生長(zhǎng)性能、組織學(xué)、行為、發(fā)育以及生產(chǎn)生理學(xué)[5]。鎘的暴露可以改變酶的活性和基因的表達(dá)[6]，誘導(dǎo)肝細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生以及發(fā)揮其毒性[7]；能夠造成線粒體功能障礙，對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致許多疾病發(fā)生[8]。

黃鱔(Monopterusalbus)廣泛分布于東亞和南亞多個(gè)國(guó)家的泥塘、沼澤、稻田中，環(huán)境中的重金屬污染會(huì)影響其氧化還原代謝和機(jī)體的生理功能。有報(bào)道指出，魚類在養(yǎng)殖過(guò)程中會(huì)因水環(huán)境中藥物濫用和有毒化合物暴露發(fā)生“肝膽綜合征”[9]，其實(shí)質(zhì)就是魚類會(huì)因脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激而產(chǎn)生嚴(yán)重的肝損傷[10]。由于底棲生活的習(xí)性，黃鱔受到水環(huán)境中重金屬的影響程度更深，但其具體機(jī)制尚不完全清楚。雖然王全禾等[11]制備了黃鱔醛酮還原酶的多克隆抗體并檢測(cè)了其特異性和效價(jià)，闞延澤等[12]發(fā)現(xiàn)，黃鱔醛酮還原酶可以提高細(xì)胞抗逆境脅迫的能力，但對(duì)該基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)譜的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，其在重金屬誘導(dǎo)下的氧化應(yīng)激作用亟需深入了解。因此，筆者擬探究重金屬鎘處理對(duì)黃鱔醛酮還原酶(Eakr)基因表達(dá)的影響，旨在為進(jìn)一步分析魚類醛酮還原酶基因在抗氧化應(yīng)激中的作用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

原核表達(dá)載體pET-28a購(gòu)自Novagen公司，大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)DH5α、BL21(DE3)等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，pET-28a-Eakr的BL21(DE3)菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存于長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所。

1.1.2 主要試劑盒

DNA凝膠回收試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；Trizol柱純化總RNA提取試劑盒(杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)有限公司)；2×SYBR Green PCR MIX試劑盒(杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)有限公司)；SMARTer?RACE 5′/3′ Kit試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)樣品采集

試驗(yàn)用黃鱔購(gòu)自荊州水產(chǎn)市場(chǎng)，平均體質(zhì)量(50±10) g。在正式開(kāi)展試驗(yàn)前，使用經(jīng)過(guò)曝氣的自來(lái)水將黃鱔飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室水箱中，飼養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)曝氣并定期更換水。飼養(yǎng)馴化1周后用于后期的試驗(yàn)。

隨機(jī)選取馴化后的黃鱔4尾，解剖后取腦、血細(xì)胞、心臟、腸道、腎臟、肝臟、肌肉、性腺、皮膚、脾臟、胃11個(gè)組織，將組織轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf管中，并在液氮中冷凍。冰箱-80 ℃保存，并用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

隨機(jī)選取36尾飼養(yǎng)馴化后的黃鱔[平均體質(zhì)量(50±10) g]，隨機(jī)分為對(duì)照組與處理組，每組各18尾。處理組的黃鱔暴露于Cd2+終質(zhì)量濃度為15 mg/L[13]的曝氣自來(lái)水中，對(duì)照組的黃鱔置于相同條件未添加Cd2+的曝氣自來(lái)水中。暴露0、3、6、9、12、24 h后，兩組分別隨機(jī)選取3尾黃鱔進(jìn)行解剖，用Microcontrifuge Tube收集黃鱔肝臟，保存于-80 ℃并用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

使用DNA分離試劑盒從黃鱔組織中分離基因組DNA，使用RNA提取試劑盒從黃鱔組織中提取RNA。提取的RNA使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和質(zhì)量之后，由HiScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。

1.2.2 黃鱔Eakr基因cDNA克隆及基因結(jié)構(gòu)的獲得

根據(jù)GenBank 公布的其他物種基因cDNA序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物AKR-F和oligod(T)-R引物(表1)，用于黃鱔Eakr基因 cDNA片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10 μL 2×Taq Mix，0.5 μL F上游引物，0.5 μL R下游引物，8 μL ddH2O，1 μL cDNA模板。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳驗(yàn)證，送交生工生物工程(上海)股份有限公司武漢分公司進(jìn)行測(cè)序。為了研究黃鱔Eakr的基因組結(jié)構(gòu)，筆者用表1中的引物對(duì)Eakr基因的內(nèi)含子進(jìn)行了擴(kuò)增，引物對(duì)I1F/R、I2F/R、I3F/R、I4F/R、I5F/R、I6F/R分別用于擴(kuò)增內(nèi)含子。

表1 引物序列及用途

利用DNAMAN 6.0軟件，根據(jù)所得cDNA片段設(shè)計(jì)基因特異性RACE引物AKRGSP5和AKRGSP3，分別用于基因的5′和3′RACE擴(kuò)增；RACE反轉(zhuǎn)錄按照SMARTer?RACE 5′/3′ Kit User Manual(TaKaRa公司)說(shuō)明書進(jìn)行；Touchdown擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，70 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃預(yù)變性1 min，64 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，32循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)經(jīng)切膠回收純化后，與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。

利用DNAMAN 6.0軟件，將所得cDNA序列與5′和3′末端所得cDNA序列進(jìn)行拼接，得到黃鱔Eakr基因全長(zhǎng)cDNA序列；采用基因特異性引物PCR擴(kuò)增各內(nèi)含子序列，克隆測(cè)序后，運(yùn)用DNAMAN 6.0軟件將獲得序列結(jié)果與cDNA序列進(jìn)行拼接與分析，獲得黃鱔基因組DNA。

1.2.3 熒光定量PCR

根據(jù)黃鱔Eakr基因cDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)。以β-actin基因的表達(dá)作為內(nèi)參。測(cè)定保存的腦、血細(xì)胞、心臟、腸道、腎臟、肝臟、肌肉、性腺、皮膚、脾臟、胃11個(gè)組織中Eakr基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，以此分析Eakr基因在黃鱔各組織中的特異性表達(dá)。測(cè)定15 mg/L Cd2+處理后，肝臟中Eakr基因與Nrf2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)。提取黃鱔各組織總RNA并合成cDNA，以黃鱔各組織cDNA為模板，使用2×SYBR Green PCR Mix試劑(simgen公司)檢測(cè)Eakr基因mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)在CFX96TM Real-Time PCR Detection System擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×SYBR Green PCR Mix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，57 ℃退火45 s， 40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法分析Eakr基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 斑點(diǎn)法測(cè)定重組菌株的生長(zhǎng)活力

使用斑點(diǎn)法分析在不同濃度Cd2+的脅迫下，pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒菌株與pET-28a空質(zhì)粒菌株生長(zhǎng)活力與存活率的區(qū)別。將pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒菌株用LB培養(yǎng)基37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至600 mn 光密度約0.6時(shí)，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG，37 ℃、220 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。取5個(gè)Eppendorf管，各加入1 mL誘導(dǎo)后菌液，同時(shí)加入CdCl2，使其終濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)1 h。離心收集菌體，用滅菌水洗滌菌體后，使用1 mL新鮮LB重懸。取5 μL處理后的菌液點(diǎn)在LB平板(含50 μg/mL卡那霉素) 上于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后將平板放入菌落分析儀中拍照并保存。將含pET-28a空質(zhì)粒菌株做以上相同處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。將上述菌液進(jìn)行100倍的稀釋后，取50 μL均勻涂在含CdCl2(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L)的LB平板(含50 μg/mL卡那霉素)上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，使用菌落分析儀計(jì)算菌落數(shù)目。將pET-28a空質(zhì)粒菌株在不含CdCl2的平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)計(jì)為100%，以此為基準(zhǔn)計(jì)算不同處理下的菌落數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

基因測(cè)序結(jié)果用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)中心上的BLAST進(jìn)行比對(duì)(http: //www．ncbi．nlm．nih．gov．BLAST/)，試驗(yàn)結(jié)果均記錄為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，采用SPSS 20軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 7.5 軟件繪制柱狀圖，當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Eakr基因序列

Eakr基因cDNA全長(zhǎng)為4468 bp，包含1026 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼341個(gè)氨基酸，5′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度為74 bp，3′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度為195 bp。通過(guò)比較黃鱔AKR基因的cDNA序列(GenBank序列號(hào)KF819395.1)克隆測(cè)序后，運(yùn)用DNAMAN 6.0軟件將獲得序列結(jié)果與cDNA序列進(jìn)行拼接與分析，獲得黃鱔基因組DNA。Eakr基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，內(nèi)含子分別為373、841、540、514、112、766 bp(圖1)。

圖1 Eakr基因的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 Eakr基因組織表達(dá)分析

熒光定量PCR分析Eakr基因在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Eakr基因在黃鱔各個(gè)組織中均有表達(dá)，在腸道、腎臟、肝臟、性腺和胃組織中表達(dá)量相對(duì)較高，其中肝臟組織中表達(dá)最高，肌肉中表達(dá)量最低(圖2)。

圖2 Eakr mRNA在黃鱔不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.3 Cd2+脅迫下黃鱔肝臟中Eakr與Nrf2基因的表達(dá)差異分析

使用15 mg/L的CdCl2處理黃鱔，隨后通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)黃鱔肝臟組織中Eakr與Nrf2基因的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示：CdCl2處理后，Eakr mRNA在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有顯著升高(P<0.001)(圖3a)；CdCl2處理后，Nrf2 mRNA表達(dá)水平呈波動(dòng)趨勢(shì)，相比對(duì)照組，Nrf2在3 h和24 h表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而在處理后3、6 h和12 h Nrf2 mRNA表達(dá)量達(dá)到極顯著水平(P<0.001)(圖3b)。結(jié)果表明，Cd2+處理會(huì)誘導(dǎo)Nrf2基因和其下游Eakr基因的表達(dá)。

圖3 氯化鎘暴露后黃鱔肝臟Eakr基因(a)和Nrf2基因(b)的相對(duì)表達(dá)

2.4 Eakr基因?qū)d2+脅迫下大腸桿菌生物活力的影響

使用CdCl2處理Eakr基因重組菌株與pET-28a空質(zhì)粒菌株，用LB平板培養(yǎng)12 h后，分析菌株的生長(zhǎng)情況與存活率，以此鑒定Eakr基因在體外是否具有耐脅迫性。結(jié)果顯示，不同濃度Cd2+脅迫下，Eakr基因重組菌株均比空白質(zhì)粒菌株生長(zhǎng)旺盛，當(dāng)Cd2+濃度升至2.0 mmol/L時(shí)，空白質(zhì)粒菌株已無(wú)明顯菌落，但是Eakr基因表達(dá)菌株仍有部分存活(圖4a)。隨著Cd2+濃度的不斷升高，Eakr基因重組菌株和空白質(zhì)粒菌株的存活率均有下降，但是空白質(zhì)粒菌株下降更顯著，且Eakr基因重組菌株存活率均高于空白質(zhì)粒菌株，當(dāng)Cd2+濃度升至1.5 mmol/L和2.0 mmol/L時(shí)，Eakr基因重組菌株的存活率顯著高于含空白質(zhì)粒菌株(P<0.001)(圖4b)。結(jié)果表明，Eakr基因的表達(dá)可以在一定程度上提高大腸桿菌的生長(zhǎng)活力與存活率。

圖4 Cd2+脅迫下重組黃鱔Eakr對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)活力與存活率的影響

3 討 論

醛酮還原酶是在醛和酮還原中具有多種功能的依賴還原型輔酶Ⅱ的氧化還原酶，通過(guò)還原型輔酶Ⅱ提供還原力，可以將醛酮類化合物通過(guò)加氫的方式還原成相對(duì)應(yīng)的醇類化合物，從而降低其毒害作用。醛酮還原酶AKR基因作為應(yīng)激反應(yīng)基因，受氧化、親電、滲透脅迫和熱激調(diào)節(jié)[14]，不僅參加機(jī)體防御工作還作為防御酶存在[8]，與機(jī)體抗氧化應(yīng)激相關(guān)。

3.1 Eakr結(jié)構(gòu)分析

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)魚類醛酮還原酶鮮見(jiàn)報(bào)道，僅有Hassanin等[15]對(duì)尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)醛酮還原酶AKR1A1的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)苯并芘可以誘導(dǎo)羅非魚肝臟中AKR1A1基因的表達(dá)，醛酮還原酶AKR1A1可能對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在的苯并芘具有解毒作用。黃鱔醛酮還原酶擁有(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合域、輔酶結(jié)合域和保守的催化中心。大多數(shù)醛酮還原酶共有催化四分體，由(Asp-Tyr-Lys-His)組成，而黃鱔醛酮還原酶催化四分體由(Asp-Tyr-Ala-His)組成。

3.2 Eakr轉(zhuǎn)錄本表達(dá)特征

醛酮還原酶基因表達(dá)具有組織廣泛性。Macleod等[16]利用Western blot技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，AKR基因在小鼠的脾臟、肝臟、腎臟和肺部等組織中均有表達(dá)；Ge等[17]發(fā)現(xiàn)，AKR1B7基因在人精管、腎上腺、眼睛、腸道、肝臟、腎臟和睪丸等組織中均有表達(dá)。在水生動(dòng)物中，醛酮還原酶基因也在多個(gè)組織中表達(dá)。Mochizuki等[18]從皺紋盤鮑(Haliotisdisushannai)肝胰臟中檢測(cè)出AKR基因的表達(dá)；在尼羅羅非魚的各個(gè)組織中均能檢測(cè)到該基因的表達(dá)，并且肝臟中的表達(dá)量最高[15]。筆者采用熒光定量PCR檢測(cè)了Eakr基因在黃鱔腦、血細(xì)胞、心臟、腸道、腎臟、肝臟、肌肉、性腺、皮膚、脾臟、胃等11個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，Eakr基因在黃鱔各個(gè)組織中都有表達(dá)，且在肝組織中表達(dá)量最高。由此可見(jiàn)，水產(chǎn)動(dòng)物中醛酮還原酶基因的表達(dá)規(guī)律為：在各個(gè)組織均有表達(dá)，且在肝臟(肝胰臟)中表達(dá)量最高。組織表達(dá)差異性與組織的生物學(xué)功能有關(guān)，肝臟(肝胰臟)是魚類脂肪合成、氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要發(fā)生場(chǎng)所，所以筆者推測(cè)，該基因可能參與了肝臟細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程與解毒抗氧化過(guò)程。

3.3 鎘暴露下黃鱔Eakr基因和Nrf2基因的表達(dá)分析

鎘是自然界中主要的應(yīng)激源之一，Cd2+誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致魚類活性氧的產(chǎn)生促使細(xì)胞死亡，為了保護(hù)細(xì)胞和組織免受氧化損傷，細(xì)胞會(huì)上調(diào)抗氧化的能力。淡水魚通過(guò)鰓和皮膚攝入Cd2+，在血漿中利用蛋白與金屬離子結(jié)合，完成對(duì)金屬離子的利用，儲(chǔ)存和排泄后，多余的Cd2+在以肝臟和腎臟為主的器官中聚集，導(dǎo)致脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙等產(chǎn)生。在鯉(Cyprinuscarpio)抗氧化應(yīng)激過(guò)程的研究中發(fā)現(xiàn)，Cd2+暴露會(huì)導(dǎo)致鯉脾臟免疫受到抑制，產(chǎn)生氧化應(yīng)激[19]，誘導(dǎo)肝臟和肝細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生。為了應(yīng)對(duì)非生物脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷，生物機(jī)體通常會(huì)提高細(xì)胞體內(nèi)醛酮還原酶的活性，以減輕氧化損傷。曾有研究表明，AKR7A在對(duì)乙酰氨基酚/對(duì)苯二酚亞胺暴露后顯著上調(diào)，從而顯著提高抵御乙酰氨基酚/對(duì)苯二酚亞胺誘導(dǎo)的肝毒性的能力[20]。目前，Cd2+暴露下對(duì)AKR基因表達(dá)影響的研究較少，但是在其他非生物因子脅迫下，AKR相關(guān)基因的表達(dá)情況有相應(yīng)的報(bào)道。如：在厭氧脅迫下誘發(fā)AKR11B基因表達(dá)；在高滲透壓、過(guò)氧化氫脅迫下誘發(fā)AKR2B6基因表達(dá)等[21]。有學(xué)者自注射苯并芘的尼羅羅非魚中檢測(cè)到了AKR1A1基因的cDNA，并發(fā)現(xiàn)膽汁和肝臟中AKR1A1基因的mRNA表達(dá)量最高，這表明暴露于苯并芘中會(huì)誘導(dǎo)羅非魚中醛酮還原酶相關(guān)基因的表達(dá)[15]；Agrawal等[22]研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫導(dǎo)致魚腥藻(Anabaenasp．)的AKR17A1基因表達(dá)量升高，分析發(fā)現(xiàn)，醛酮還原酶可以對(duì)鎘脅迫產(chǎn)生的活性羰基物質(zhì)進(jìn)行解毒來(lái)提供耐應(yīng)力性。

越來(lái)越多的研究顯示，當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激條件下，Keap-1-Nrf2-ARE信號(hào)通路被激活，來(lái)調(diào)節(jié)多種抗氧化蛋白的表達(dá)，進(jìn)而減輕細(xì)胞所受損害[23]。Matsunaga等[24]研究證實(shí)，AKR1C1和AKR1C3通過(guò)Keap-1-Nrf2-ARE信號(hào)通路進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，醛酮還原酶作為Nrf2的下游信號(hào)因子，受到Nrf2的調(diào)控。結(jié)合上述熒光定量PCR結(jié)果推測(cè)，Eakr基因參與黃鱔應(yīng)對(duì)Cd2+脅迫導(dǎo)致的活性氧代謝過(guò)程，也表明Keap-1-Nrf2-ARE信號(hào)通路可能參與黃鱔醛酮還原酶表達(dá)調(diào)控過(guò)程。本試驗(yàn)中熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，暴露于Cd2+的黃鱔各組織中的Eakr基因與Nrf2基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，表明Nrf2和醛酮還原酶等被Cd2+誘導(dǎo)產(chǎn)生，Cd2+處理會(huì)誘導(dǎo)Eakr基因和Nrf2基因的表達(dá)，可能是由于Cd2+誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而開(kāi)啟Nrf2-Keap1抗氧化信號(hào)通路，導(dǎo)致Nrf2基因及其下游Eakr基因的表達(dá)。

3.4 Cd2+脅迫下Eakr基因?qū)Υ竽c桿菌生物活力的影響分析

闞延澤等[12]發(fā)現(xiàn)，Eakr基因重組菌株生長(zhǎng)活力明顯高于陰性對(duì)照菌株；AKR17A1基因在大腸桿菌中的異源表達(dá)會(huì)使菌體在非生物因子如高溫、紫外線B和鎘的脅迫下表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)[25]；野生大麥表達(dá)外源基因擬南芥AKR4C9的過(guò)程中，顯著提高了對(duì)鉻和鹽脅迫的耐受性[26]；醛酮還原酶ALDRXV4基因的表達(dá)同樣增強(qiáng)了大腸桿菌對(duì)鹽和重金屬等的耐受性。筆者用斑點(diǎn)法測(cè)定pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒菌株(Eakr基因重組菌株)與pET-28a空質(zhì)粒菌株(空白質(zhì)粒菌株)的存活率，結(jié)果顯示，隨著Cd2+濃度的提高，Eakr基因重組菌株與空白質(zhì)粒菌株的存活率均有降低，但同等條件下Eakr基因重組菌株的存活率始終高于空白質(zhì)粒菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，黃鱔醛酮還原酶可以在體外對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用，以減少重金屬對(duì)細(xì)胞的毒害作用，增強(qiáng)在非生物脅迫下的耐受性。

4 結(jié) 論

綜上所述，筆者克隆了黃鱔醛酮還原酶(Eakr)基因并闡明了其結(jié)構(gòu)，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)到Eakr基因在黃鱔的腦、血細(xì)胞、心臟、腸道、腎臟、肝臟、肌肉、性腺、皮膚、脾臟、胃中表達(dá)，且肝臟表達(dá)水平最高；Cd2+誘導(dǎo)下Eakr基因表達(dá)水平上升，且Nrf2基因表達(dá)水平也顯著提高。研究結(jié)果顯示，重組大腸桿菌生長(zhǎng)活力在同等生長(zhǎng)環(huán)境下明顯高于對(duì)照組，表明Eakr基因可對(duì)抗因Cd2+誘導(dǎo)而產(chǎn)生的氧化應(yīng)激。研究結(jié)果可為黃鱔應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫及重金屬毒理學(xué)研究提供重要參考。