于曉玲 李文彬 李智博 阮孟斌

（1 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101；2 海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院 海南省熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101）

木薯（Manihot esculentaCrantz）起源于南美洲，是世界上第六大糧食作物［1］，其最適生長(zhǎng)溫度為25-29℃［2］，低于10℃發(fā)育停滯［3］。低溫條件下木薯發(fā)育遲緩、毒性物質(zhì)累積，品質(zhì)及產(chǎn)量都受到很大的影響［4］。因此木薯耐低溫研究，對(duì)木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的作用。

國(guó)內(nèi)外目前對(duì)木薯低溫響應(yīng)的分子機(jī)理尚不清晰，研究主要集中在活性氧（reactive oxygen species,ROS）系統(tǒng)方面。增加ROS 的清除能力可以提高木薯對(duì)低溫的耐受性［5-6］；Cheng 等［7］的研究表明，植物特異轉(zhuǎn)錄因子MeTCP4（teosinte branched/ cycloidea / PCF,TCP）的過(guò)量表達(dá)可以誘導(dǎo)ROS途徑相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)擬南芥對(duì)冷脅迫耐受性； 過(guò)表達(dá)MeCu/ZnSOD和MeAPX2（ascorbate peroxidase,APX）提高活性氧清除能力，降低H2O2積累，提高轉(zhuǎn)基因木薯對(duì)低溫的耐受性［6］。另外，CBF3（c-repeat-binding factor,CBF）在木薯中過(guò)表達(dá)，可增強(qiáng)木薯對(duì)低溫的耐受性［8］；干擾木薯MeMYB2的表達(dá)也可以提高木薯轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫的耐受能力［9］。此外，也可以通過(guò)施肥提高木薯的抗寒能力［10］。

MYC2 轉(zhuǎn)錄因子是bHLH（the basic helix-loophelix）轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，其bHLH 保守結(jié)構(gòu)域可與DNA 結(jié)合發(fā)揮作用［11］。近年來(lái)，在擬南芥、番茄、煙草、長(zhǎng)春花、丹參等多種植物中對(duì)MYC2 基因進(jìn)行了研究［12］，結(jié)果顯示，MYC2 在植物應(yīng)答逆境刺激時(shí)起重要調(diào)控作用，是茉莉酸（jasmonic acid,JA）信號(hào)傳導(dǎo)途徑的核心調(diào)控元件，同時(shí)也是JA 通路與其他植物激素信號(hào)通路交互的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)［13］。赤霉素（gibberellin acid,GA）途徑DELLA 阻遏物和JAZ 與MYC2 相互作用以抑制花中倍半萜的生物合成［14］；而脫落酸（abscisic acid,ABA）促進(jìn)ABA 受體PYL6（pyrabactin resistance 1-like 6）與MYC2 的相互作用，并阻遏MYC2 與靶啟動(dòng)子的結(jié)合［15］；擬南芥MYC2 可能在EDR1（enhanced disease resistance 1）基因上游調(diào)控JA-SA（Sal Icylic acid）的信號(hào)互作［16］；蘋果MdMYC2 與ERF3（ethylene response factor 3）啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控乙烯生物合成［17］。低溫及外源MeJA 可誘導(dǎo)香蕉MYC2 的表達(dá)，且MYC2可與ICE1（inducer of CBF expression 1）互作調(diào)節(jié)可香蕉的抗凍性［18］。

生產(chǎn)中木薯表現(xiàn)為對(duì)干旱具有良好的耐受性，但對(duì)低溫敏感，但其分子機(jī)理尚不清楚。MYC2 在其他作物中表現(xiàn)出良好的抗寒作用，其在木薯中的作用尚未清楚。本研究通過(guò)前期低溫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MeMYC2 基因受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)［19］。為進(jìn)一步明確MeMYC2 基因的功能，本研究借助過(guò)表達(dá)木薯MeMYC2 基因的擬南芥，驗(yàn)證MeMYC2 影響低溫耐受性的功能，旨在為進(jìn)一步利用該基因提高栽培木薯對(duì)低溫的耐受性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Col-0）由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 木薯MeMYC2.2 基因的克隆 利用TaKaRa 高保真酶（R045），以木薯cDNA 為模板，以特異性引物（表1）PCR 克隆木薯MeMYC2.2 基因［19］。PCR反應(yīng)程序：98℃變性10 s，55℃退火 5 s，72℃延伸10 s，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳回收純化、與T 載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；經(jīng)菌落PCR 及酶切鑒定為陽(yáng)性克隆的，進(jìn)行測(cè)序（上海生工）。所用引物及其序列如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

利 用NCBI Conservered Domain（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）預(yù)測(cè)基因序列的功能結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用在線工具PI_tool（https://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）預(yù)測(cè)基因編碼蛋白的分子量和等電點(diǎn)。

1.2.2 木薯MeMYC2.2 基因轉(zhuǎn)錄活性分析及亞細(xì)胞定位 將MeMYC2.2 基因開(kāi)放閱讀框插入pGBKT7載體多克隆位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化酵母Y187 感受態(tài)細(xì)胞。將鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與轉(zhuǎn)化空白對(duì)照載體pGBKT7 的酵母菌液活化，濃度調(diào)整一致后，劃線于SD/-Trp 平板（+40 μg/mL X-α-Gal），30℃倒置培養(yǎng)3-5 d 后，觀察酵母顯色情況。

利用XbaI 和BamH I 限制性內(nèi)切酶，將MeMYC2.2 基因全長(zhǎng)編碼序列（不包括TGA 終止子）克隆到帶有35S:GFP 植物表達(dá)載體中，形成35S:MeMYC2.2:GFP 融合表達(dá)載體。將上述重組質(zhì)粒采用化學(xué)法分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404 中。將陽(yáng)性克隆菌通過(guò)葉盤注射法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片。利用激光共聚焦顯微鏡（Olympus FV1000），在GFP 的激發(fā)波長(zhǎng)（488 nm/505-550 nm）下檢測(cè)熒光。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥 將攜帶有35S:MeMYC2.2:GFP 重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404 菌株接種至LB 液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至OD600為1.0。短暫離心收集菌體，然后以懸浮液（MS培養(yǎng)基+60 g/L 蔗糖+0.02% Silwet）重懸菌體。選取生長(zhǎng)旺盛、剛剛開(kāi)花的擬南芥（Col-0），將花序浸入懸浮好的菌液中10 s，20℃保濕狀態(tài)下過(guò)夜暗培養(yǎng)，然后恢復(fù)正常（22℃）光照培養(yǎng)1 周后，重復(fù)侵染1 次。待果莢成熟后，收獲T0代種子。篩選壓力（30 mg/L 潮霉素）下篩選T0代種子，獲得T1代轉(zhuǎn)化苗。隨后T2代經(jīng)3∶1 分離比篩選培養(yǎng)后，T3代獲得單拷貝純合植株，收取T3代純合子種子備用。提取3 個(gè)T3代純合轉(zhuǎn)化株系葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄后，qPCR 檢測(cè)過(guò)量表達(dá)擬南芥株系中MeMYC2.2 基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系耐低溫實(shí)驗(yàn) 將篩選的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥種子表面消毒（75%乙醇+0.1% Triton X100，10 min）后，無(wú)水乙醇洗滌一次，超凈工作臺(tái)吹干種子，播種于1/2 MS 平板上，待長(zhǎng)至四葉期，移栽于裝有營(yíng)養(yǎng)土（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶2）的營(yíng)養(yǎng)缽中，置于光照培養(yǎng)房中。待擬南芥葉盤鋪開(kāi)，進(jìn)行低溫（-20℃）處理。低溫處理0、1、3 和6 h 后，取葉片于液氮中速凍后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 基因定量表達(dá)分析 低溫處理后的轉(zhuǎn)基因及野生型擬南芥葉片，提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。進(jìn)行目的基因檢測(cè)及低溫信號(hào)途徑相關(guān)基因的熒光定量分析。以AtActin1為內(nèi)參基因。

2 結(jié)果

2.1 木薯MeMYC2.2基因的克隆與生物信息學(xué)分析

木薯中有12 個(gè)MYC2 相似的基因，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中2 個(gè)（Manes.17G016000，Manes.15G-182700）基因與蓖麻、擬南芥、玉米等的MYC2 親緣關(guān)系最近［19］。Manes.17G016000，Manes.15G182-700 分別命名為MeMYC2.1 和MeMYC2.2。采用在線生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果如表2。NCBI在線預(yù)測(cè)蛋白保守功能域發(fā)現(xiàn)，MeMYC2.1 和Me-MYC2.2 都具有bHLH-MYC 保守結(jié)構(gòu)域和HLH DNA結(jié)合域，屬于典型的MYC 轉(zhuǎn)錄因子。

表2 MeMYC2 生物信息學(xué)分析Table 2 Bioinformatics analysis of MeMYC2

2.2 木薯MeMYC2基因表達(dá)模式分析

為探究木薯MeMYC2 在低溫脅迫過(guò)程中的作用，我們對(duì)野生型木薯組培苗葉片在低溫處理（10℃）不同時(shí)間段（0、12、24 和48 h）進(jìn)行取材。提取葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 作為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（RT-qPCR）對(duì)MeMYC2.1/2.2基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，MeMYC2 基因的mRNA 在低溫脅迫12 h 時(shí)豐度達(dá)到最高，隨后逐漸降低，其中MeMYC2.2 的表達(dá)差異更明顯（圖1）。上述結(jié)果表明MeMYC2 為低溫脅迫早期誘導(dǎo)基因，而MeMYC2.2 表達(dá)差異更顯著。因此選擇MeMYC2.2基因作為目標(biāo)基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 不同冷脅迫時(shí)間下MeMYC2 的表達(dá)分析Fig.1 Expression patterns of MeMYC2 under different cold stress（CS）time

2.3 MeMYC2.2可能作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中行使功能

MeMYC2.2 蛋白定位預(yù)測(cè)分析顯示其可能定位于細(xì)胞核。為驗(yàn)證MeMYC2.2 蛋白的亞細(xì)胞定位，本研究將MeMYC2.2 基因與GFP 進(jìn)行融合后，構(gòu)建相應(yīng)的植物表達(dá)載體。利用煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)驗(yàn)證蛋白的定位，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、共培養(yǎng)3 d 后，使用共聚焦顯微鏡（Olympus FV1000,Japan）在GFP 激發(fā)光波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光。結(jié)果表明MeMYC2.2蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)（圖2-A）。

為驗(yàn)證MeMYC2.2 蛋白是否具備轉(zhuǎn)錄自激活作用，本研究將MeMYC2.2-pGBKT7 轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞，在SD/ -Trp + X-α-gal 培養(yǎng)基上對(duì)MeMYC2.2 蛋白的轉(zhuǎn)錄激活功能進(jìn)行分析。結(jié)果（圖2-B）表明，MeMYC2.2 基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠激活酵母α-半乳糖苷酶（MeL1）基因的表達(dá)，使得酵母細(xì)胞在SD/ -Trp + X-α-gal 平板上形成藍(lán)色菌斑，說(shuō)明MeMYC2.2 具備轉(zhuǎn)錄自激活功能，結(jié)合MeMYC2.2 蛋白定位于細(xì)胞核的結(jié)果，由此推斷MeMYC2.2 可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。

圖2 MeMYC2.2 轉(zhuǎn)錄因子驗(yàn)證Fig.2 Validation experiments of transcription factor MeMYC2.2

2.4 MeMYC2.2過(guò)量表達(dá)能夠提高擬南芥植株抗凍能力

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花轉(zhuǎn)化方法，獲得MeMYC2.2 過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥。經(jīng)潮霉素抗性篩選獲得的16 個(gè)T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥，PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性。T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)一步在潮霉素抗性平板上通過(guò)3∶1 的篩選比，獲得單拷貝轉(zhuǎn)基因株系；T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥繼續(xù)抗性篩選，最終得到單拷貝的轉(zhuǎn)基因擬南芥純合子。選取3 個(gè)T3代轉(zhuǎn)基因純合株系，采用RT-qPCR 方法檢測(cè)過(guò)量表達(dá)株系中MeMYC2.2 基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果（圖3）顯示，3個(gè)被檢株系中MeMYC2.2 基因皆被高水平轉(zhuǎn)錄。

圖3 轉(zhuǎn)基因擬南芥中MeMYC2.2 表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of MeMYC2.2 in transgenic Arabidopsis plants

為驗(yàn)證MeMYC2.2 基因的過(guò)量表達(dá)對(duì)擬南芥植株抗凍性的影響，我們采用-20℃模擬凍害。結(jié)果（圖4）顯示，未經(jīng)凍害處理時(shí)，MeMYC2.2 過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和野生型在形態(tài)特征上未有明顯差異。冷凍處理4 h 的野生型擬南芥葉片逐漸開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫；而冷凍處理6 h 的野生型擬南芥葉片大面積出現(xiàn)枯萎，凍害嚴(yán)重，植株死亡率較高。而冷凍處理4 h 的MeMYC2.2 過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片可以正常伸展；如表3所示，與野生型對(duì)比，凍害延續(xù)至6 h 的轉(zhuǎn)基因擬南芥凍害程度較輕，死亡率顯著降低。經(jīng)冷凍處理后，在22℃條件下恢復(fù)生長(zhǎng)1周后，MeMYC2.2 過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的成活率顯著高于野生型擬南芥。

表3 野生型和轉(zhuǎn)基因植株冷凍處理后的存活率統(tǒng)計(jì)Table 3 Survival rates of wild-type and transgenic plants with cold treatment (n>30)

圖4 轉(zhuǎn)基因和野生型植株表現(xiàn)出不同的耐凍能力Fig.4 Wild-type and transgenic plants demonstrating different freezing tolerance abilities

由此可見(jiàn)，MeMYC2.2 基因的過(guò)表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗凍能力的提高有正調(diào)控作用。

2.5 CBF基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)分析

對(duì)冷凍脅迫（-20℃）下MeMYC2.2 過(guò)表達(dá)擬南芥及野生型擬南芥葉片中CBF基因的表達(dá)量進(jìn)行RT-qPCR 分析。結(jié)果（圖5）顯示，與野生型擬南芥相比，CBF3基因的表達(dá)在MeMYC2.2 過(guò)表達(dá)擬南芥中受低溫誘導(dǎo)更為明顯。但其他3 個(gè)CBF基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中受低溫誘導(dǎo)的表達(dá)量明顯低于其在野生型擬南中的表達(dá)量。

圖5 冷凍脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥中CBF 基因的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of CBF genes in transgenic Arabidopsis under cold stress

3 討論

作為一種熱帶塊根作物，木薯原產(chǎn)于溫暖的熱帶地區(qū)，被歸類于對(duì)寒冷敏感的物種［20］。低溫對(duì)木薯儲(chǔ)藏根及種莖損害極大，2008年1月份我國(guó)南方發(fā)生的冷凍災(zāi)害，導(dǎo)致廣西、廣東等省木薯產(chǎn)業(yè)造成巨大的破壞［21］。在10℃以下低溫，木薯表現(xiàn)出明顯的損害癥狀，包括產(chǎn)量下降、葉片擴(kuò)展減少、褪綠甚至死亡［22］。本研究采用10℃做木薯低溫脅迫處理與生產(chǎn)實(shí)際密切相關(guān)，并且對(duì)篩選基因做抗寒機(jī)理研究非常重要。

MYC2 轉(zhuǎn)錄因子是bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，廣泛存在于動(dòng)植物中。MYC2 在植物應(yīng)答逆境刺激時(shí)起重要調(diào)控作用，是JA 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的核心調(diào)控因子，同時(shí)也是JA 與其他植物激素信號(hào)交互的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)［13］。已有研究表明，擬南芥MYC2 轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)特異性結(jié)合CBF3啟動(dòng)子上的MYC 結(jié)合位點(diǎn)（CANNTG），正調(diào)控CBF3基因的表達(dá)［23］。大量研究證明CBF基因在植物抗寒方面是一個(gè)保守的信號(hào)途徑，被認(rèn)為是調(diào)控非生物脅迫轉(zhuǎn)錄因子中的核心調(diào)控因子［8］。CBF 轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF多基因家族，是植物抗凍性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［24-25］。CBF 轉(zhuǎn)錄因子能直接激活一系列提高冷凍耐受性的COR（冷調(diào)節(jié)）基因［26-28］，對(duì)于植物的冷馴化和抗凍性至關(guān)重要。已有研究顯示，干擾CBF3 基因后，二穗短柄草在低溫下的存活率顯著降低［29］；而增強(qiáng)CBF3的表達(dá)，植株表現(xiàn)出更好的抗凍性［30-31］。

栽培木薯對(duì)低溫敏感，但其低溫敏感的分子基礎(chǔ)尚不明確。CBF參與了多個(gè)低溫響應(yīng)基因（COR）表達(dá)的調(diào)控，直接影響植物的抗寒性。基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)CBF基因在木薯頂芽中的表達(dá)缺失，這可能是造成木薯低溫敏感的原因之一［20］。在擬南芥中，CBF基因表達(dá)在低溫處理15 min 內(nèi)顯著上調(diào)，在2 h 后達(dá)到最高［32］。而木薯CBF基因表達(dá)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)明顯滯后，需要數(shù)個(gè)小時(shí)后才開(kāi)始響應(yīng)，且其表達(dá)要在8 h 以上才達(dá)到最高［33］。過(guò)表達(dá)木薯CBF1基因的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫的耐受性明顯提高［33］；研究也發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)木薯CBF4基因也可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性［34］。這說(shuō)明木薯CBF基因同樣具有調(diào)控抗寒性的功能，但木薯中CBF表達(dá)調(diào)控途徑無(wú)法迅速響應(yīng)低溫脅迫信號(hào)。

為研究MeMYC2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗凍性顯著增強(qiáng)的原因是否與CBF 信號(hào)途徑關(guān)聯(lián)，對(duì)冷凍脅迫（-20℃）下MeMYC2.2 過(guò)表達(dá)擬南芥及野生型擬南芥葉片中CBF基因的表達(dá)量進(jìn)行RT-qPCR 分析。結(jié)果顯示，MeMYC2.2 過(guò)表達(dá)擬南芥植株中，僅CBF3的表達(dá)量較野生型植株顯著提高，且隨著冷凍脅迫時(shí)間的持續(xù)，MeMYC2.2 過(guò)表達(dá)擬南芥中CBF3 的表達(dá)豐度持續(xù)升高。這說(shuō)明木薯MeMYC2.2 具有調(diào)控CBF 途徑影響低溫耐受性的可能性。栽培木薯中MeMYC2.2 的表達(dá)雖然對(duì)低溫有響應(yīng)，但其差異表達(dá)量變化倍數(shù)并不高，這一點(diǎn)是否與低溫脅迫下木薯CBF基因表達(dá)模式有關(guān)還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

木薯MeMYC2.2 基因，屬于bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其表達(dá)受低溫誘導(dǎo)。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過(guò)表達(dá)MeMYC2.2 可上調(diào)CBF3 基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)低溫的耐受性，為進(jìn)一步利用MeMYC2 基因改良木薯的低溫耐受性奠定理論基礎(chǔ)。