羅皓天 王龍 王禹茜 王月 李佳禎 楊夢珂 張杰 鄧欣 王紅艷

（遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，沈陽 110036）

RNA 介導(dǎo)的DNA 甲基化（RNA-directed DNA Methylation，RdDM），是生物體內(nèi)DNA 甲基化從頭構(gòu)建的主要途徑［1］。在植物中分為典型的RdDM 途徑和非典型的RdDM 途徑，其中非典型的RdDM 途徑還包括轉(zhuǎn)錄后沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），即RNA 干擾（RNA interference，RNAi）途徑［2］。RNAi 途徑首先利用 DNA 或 RNA 合成雙鏈 RNA（double-stranded RNA,dsRNA），RNase 會(huì)將 dsRNA 切割成小 RNA（small RNA,sRNA），這些小 RNA 可對(duì)目標(biāo)序列的 mRNA 進(jìn)行降解，從而特異性地沉默或抑制該基因表達(dá)［3］。這一途徑在對(duì)抗病毒RNA、轉(zhuǎn)座子的沉默等過程中發(fā)揮重要作用［2］。在RNAi 途徑中有3 種蛋白質(zhì)發(fā)揮主要作用，分別是識(shí)別并結(jié)合sRNA 序列的Argonaute（AGO）、切割dsRNA 成為sRNA 的Dicer-like（DCL）和RNA依賴的RNA 聚合酶（RDR）。AGO 家族蛋白可以與21-24 nt 的小RNA（small RNA,sRNA）相結(jié)合，并通過與SPT5L、NRPE1 和IDN2-IDP 復(fù)合物的相互作用和幫助下，將DRM2 招募到DNA 中［3-5］。不同AGO 蛋白功能也有不同，例如AGO1 可結(jié)合21-22 nt 的sRNA，AGO4 和AGO6 可結(jié)合24 nt 的sRNA；AGO9 可在生殖組織中發(fā)揮作用；AGO18 為禾本科特有的一類AGO 蛋白，最早在水稻中被發(fā)現(xiàn)，主要與病毒外源RNA 入侵的防御有關(guān)［3,6］。DCL 家族是一類具有核酸內(nèi)切酶活性的蛋白質(zhì)，它們可以將雙鏈小RNA（dsRNA）剪切成21-24 nt 的sRNA［5］。DCL1 可切割miRNA 前體或具有反向重復(fù)序列的mRNA，如轉(zhuǎn)座元件，并產(chǎn)生21 nt 的sRNA［7-10］。DCL2 可切割mRNA 并產(chǎn)生22 nt 的sRNA［5］。DCL3會(huì)優(yōu)先靶向Pol Ⅳ-RDR2 復(fù)合物產(chǎn)生的dsRNA，切割并產(chǎn)生24 nt 的sRNA，但也可以切割其他dsRNA底物［5,7-8］。DCL4 可產(chǎn)生21 nt 的sRNA，在禾本科中SHO 為DCL4 的同源蛋白［7-8］。DCL1/2/3/4 之間會(huì)互相競爭底物，當(dāng)DCL2/4 參與的PTGS 通路飽和時(shí)，DCL3 可以介入并處理DCL2/4 的dsRNA 底物，觸發(fā)PTGS 向RdDM 介導(dǎo)的TGS 轉(zhuǎn)換［7-8,11］。RDR家族是一類RNA 依賴型RNA 聚合酶［5］。RDR2 可以與Pol Ⅳ結(jié)合，將Pol Ⅳ產(chǎn)生的單鏈RNA 產(chǎn)物加工成雙鏈RNA［12］。RDR6 可將AGO1 產(chǎn)生的單鏈sRNA 加工成dsRNA，從而導(dǎo)致PTGS［5,13］。

目前已知的所有動(dòng)植物中均存在AGO、DCL 和RDR 基因的多個(gè)拷貝，并且部分基因的功能已被闡明［14］。以禾本科為例，水稻（Oryza sativa）中含有19 種AGO 蛋白，8 個(gè)DCL 類蛋白和5 個(gè)RDR 蛋白［14］。在谷子（Setaria italica）中鑒定出AGO 蛋白13 個(gè)，DCL 蛋白7 個(gè)以及RDR 蛋白4 個(gè)［15］?；蚩截悢?shù)的多樣性為基因功能的變化提供了空間，有利于物種的進(jìn)化［16］。青狗尾草（Setaria viridis）是谷子的野生近緣種，為禾本科2 倍體（2n=2x=18）C4植物，廣泛分布在世界各地。大約在9 000-6 000年前，青狗尾草被馴化成為谷子［17］。在作物馴化與改良過程中，落粒性和株高是兩個(gè)重要的目標(biāo)性狀。對(duì)青狗尾草群體測序，人們發(fā)現(xiàn)控制落粒性狀的基因SiLes1由于轉(zhuǎn)座元件的插入使其發(fā)生了突變，從而使得青狗尾草喪失了落粒性，并重現(xiàn)了青狗尾草馴化的初始階段［18］?？梢娢锓N馴化的過程是極其復(fù)雜的，但表觀遺傳修飾基因是否受到馴化影響還有待研究。

因此，本研究通過生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)方法，對(duì)青狗尾草的RNAi 途徑相關(guān)的3 種主要基因家族進(jìn)行全基因組的挖掘和鑒定，并對(duì)其亞細(xì)胞位置、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、保守結(jié)構(gòu)域、染色體位置、Ka/Ks 比值以及基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。同時(shí)比較了各家族成員在青狗尾草和谷子間的異同。本研究為上述基因在調(diào)控青狗尾草的表觀遺傳修飾中的功能和作用提供初步的理論依據(jù)，為青狗尾草與谷子之間的馴化和基因進(jìn)化的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 青狗尾草RNAi途徑相關(guān)基因的鑒定

青狗尾草基因組下載自Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。利用已知的谷子RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)序列作為參考序列［15］，在青狗尾草的蛋白質(zhì)序列中做blastp，得到的結(jié)果送至Pfam（https://pfam.xfam.org/）做進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位

將得到的青狗尾草RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)序列上傳至ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）和BUSCA（http://busca.biocomp.unibo.it/）得到其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和預(yù)測的亞細(xì)胞定位。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析、保守結(jié)構(gòu)域和染色體定位

利用MEGA X（v5.1.1）對(duì)擬南芥、水稻、谷子和青狗尾草的RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)全長分別構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Bootstrap 測試和1 000個(gè)重復(fù)來評(píng)估每個(gè)節(jié)點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)一致性。

將青狗尾草的RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)序列上傳至Pfam 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，得到序列的保守結(jié)構(gòu)域信息。

根據(jù)青狗尾草和谷子的基因組信息，利用在線軟件MapGene2Chrom（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）定位青狗尾草和谷子的RNAi 途徑相關(guān)基因的染色體位置。

1.4 Ka/Ks和跨膜結(jié)構(gòu)分析

利用TBtools（v1.082）分析青狗尾草和谷子的RNAi 途徑相關(guān)基因的CDS 序列的Ka/Ks［19］。

1.5 轉(zhuǎn)錄組分析

青狗尾草和谷子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自Phytozome（PRJNA633601,SRX116346-SRX116357）［18,20］。

2 結(jié)果

2.1 青狗尾草RNAi途徑相關(guān)基因的全基因組鑒定、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位

為了鑒定出青狗尾草RNAi 途徑相關(guān)基因，利用已知的谷子AGO、DCL 和RDR 蛋白質(zhì)序列在青狗尾草中進(jìn)行同源探尋，并鑒定保守結(jié)構(gòu)域。每個(gè)谷子AGO、DCL 和RDR 蛋白質(zhì)均能在青狗尾草基因組中找到同源蛋白。結(jié)果共得到青狗尾草的13 個(gè)AGO、7 個(gè)DCL 和4 個(gè)RDR 蛋白質(zhì)序列，它們與谷子同源蛋白的相似度在95%-100%之間（表1），蛋白質(zhì)長度在313（SvDCL1b）-1 933（SvDCL1a）氨基酸之間，相對(duì)分子質(zhì)量在35 044.76（SvDCL1b）-216 220.21（SvDCL1a）Mw/Da 之間，理論等電點(diǎn)5.01（SvDCL1b）-9.55（SvAGO1c） 之間。此外，SvDCL1b（38.74）、SvDCL1c（29.3）、SvAGO2（38.85）和SvRDR1（39.69）的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，說明其為穩(wěn)定蛋白，其余為不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位的預(yù)測結(jié)果顯示SvDCL3b 和SvAGO1b 被定位在細(xì)胞間隙；SvMEL1 定位在葉綠體類囊體腔；SvRDR2 定位在葉綠體類囊體膜，其余均定位在細(xì)胞核中，說明同一家族的不同成員可能在不同細(xì)胞組分內(nèi)發(fā)揮作用（表2）。

表1 青狗尾草與谷子的基因序列信息Table 1 Gene sequence information of S.viridis and S.italica

表2 青狗尾草的蛋白質(zhì)序列信息Table 2 Protein sequence information of S.viridis

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了了解青狗尾草RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用3 個(gè)單子葉植物水稻、谷子和青狗尾草（O.sativa,S.italica,S.viridis）和一個(gè)雙子葉植物擬南芥（A.thaliana）共94 個(gè)RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。13 個(gè)SvAGO 家族蛋白被分成6 個(gè)亞組（AGO1,AGO2/7,AGO4/16,AGO10,AGO12/13/14,AGO18）。其中SvPNH1 在AGO10 亞組；SvMEL 在AGO12/13/14亞組；SvSHL4 在AGO2/7 亞組。AGO18 為禾本科植物特有的一類AGO 蛋白，被單獨(dú)分為一組。7個(gè)SvDCL 家族蛋白被分成4 個(gè)亞組（DCL1,DCL2,DCL3,DCL4）。其中SvSHO1 分到DCL4 亞組中。4個(gè)SvRDR 家族蛋白被分成4 個(gè)亞組（RDR1,RDR2,RDR3,RDR6）。其中SvSHL2 與RDR6 分到一組。作為谷子的野生近緣種，青狗尾草的蛋白質(zhì)序列與谷子的同源蛋白質(zhì)親緣關(guān)系最近，因而在同一亞組中它們總是聚在一起的，其次是水稻，外類群雙子葉植物擬南芥的蛋白質(zhì)序列總會(huì)單獨(dú)聚在一起。

圖1 擬南芥、水稻、谷子和青狗尾草的蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Protein phylogenetic tree of A.thaliana,O.sativa,S.italica and S.viridis

2.3 基因結(jié)構(gòu)的比較分析

為了初步了解這些基因在青狗尾草和谷子之間的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)青狗尾草和谷子RNAi 途徑相關(guān)同源基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析（圖2）。研究發(fā)現(xiàn)，雖然大部分基因在青狗尾草和谷子中的結(jié)構(gòu)相似度很高，但有兩個(gè)基因AGO1b和RDR3在青狗尾草和谷子間有明顯差異。具體表現(xiàn)為，SiAGO1b比SvAGO1b的第一個(gè)外顯子內(nèi)插入了一個(gè)6 974 bp 的內(nèi)含子序列；SiRDR3與SvRDR3相比，SiRDR3的基因結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，其在5 176-31 746 bp 多了11 個(gè)內(nèi)含子和外顯子，導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)更長。結(jié)構(gòu)差異必然會(huì)導(dǎo)致功能差異，因此，在后續(xù)分析中我們對(duì)這兩對(duì)基因進(jìn)行了深入分析。

圖2 青狗尾草（A）和谷子（B）的基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure of S.viridis（A）and S.italica（B）

2.4 保守結(jié)構(gòu)域分析

本研究進(jìn)一步分析了青狗尾草AGO、DCL、RDR 蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域，并將青狗尾草與課題組前期已報(bào)道的谷子同源蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比較（圖3）［15］。研究表明，青狗尾草的AGO 家族中，全部AGO 家族成員都帶有ArgoN（PF16486）結(jié)構(gòu)域、ArgoL1（PF08699）結(jié)構(gòu)域、PAZ（PF02170）結(jié)構(gòu)域和Piwi（PF02171）結(jié)構(gòu)域，此外SvAGO1b/SiAGO1b 和SvAGO1d/SiAGO1d 帶有Gly-rich_Ago1（PF12764）結(jié)構(gòu)域，個(gè)別成員還帶有ArgoMid（PF16487）結(jié)構(gòu)域。除了SvSHL4/SiSHL4，其他AGO 成員還帶有ArgoL2（PF16488） 結(jié)構(gòu)域。說明AGO 家族蛋白功能較為保守，且各成員之間功能可能相同或相似。與SiAGO12/14/18 相比，SvAGO12/14/18 的AgoN 結(jié)構(gòu)域較短可能不完整，且功能可能受損。而SiAGO12/14/18 具有更加完整的AgoN 結(jié)構(gòu)域，意味著它們具有完整的AGO 蛋白的功能。

在DCL 家族中，DCL1a、DCL3a、DCL3b 和SHO1 具有相似的結(jié)構(gòu)域（圖3），包括Helicase_C（PF00271）結(jié)構(gòu)域、Dicer_dimer（PF03368）結(jié)構(gòu)域、PAZ 結(jié)構(gòu)域和Ribonuclease_3/3_3（PF00636）結(jié)構(gòu)域。另外，SvDCL1a/SiDCL1a 和SvDCL3a/SiDCL3a和SiDCL3b 還帶有Res Ⅲ（PF04851）結(jié)構(gòu)域，而SvDCL3b 不帶有Res Ⅲ結(jié)構(gòu)域。青狗尾草和谷子的DCL1a 和SHO1 帶有dsrm（PF00035） 結(jié)構(gòu)域和DND1_DSRM（PF14709） 結(jié)構(gòu)域。但是，青狗尾草和谷子的DCL1b 和DCL1c 蛋白質(zhì)喪失了大部分DCL 蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域，只包含一個(gè)Ribonuclease_3_3 結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)dsrm 結(jié)構(gòu)域或DND1_DSRM 結(jié)構(gòu)域。

RDR 家族蛋白都包含一個(gè)RdRP（PF05183）結(jié)構(gòu)域（圖3）。但相較于其他青狗尾草RDR 蛋白，SvRDR3 的RdRP 結(jié)構(gòu)域較短，表明SvRDR3 的功能可能受損，無法正常結(jié)合和復(fù)制單鏈RNA。不同于青狗尾草的是在谷子RDR 蛋白中，SiRDR3 的RdRP結(jié)構(gòu)域更長，可能發(fā)揮正常的RDR 蛋白的功能。

圖3 青狗尾草和谷子的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved protein domains of S.viridis and S.italica

2.5 染色體定位

為了探明青狗尾草到谷子馴化過程中，RNAi 途徑相關(guān)基因在染色體定位是否有變化，我們分別確定了青狗尾草和谷子RNAi 途徑相關(guān)基因在各自染色體上的位置（圖4）。青狗尾草各基因分布在7 條染色體上，與谷子的同源基因在染色體上的位置也基本一致。說明在物種分化后，青狗尾草/谷子的自然選擇/馴化過程中，RNAi 途徑相關(guān)基因的共線性并未發(fā)生明顯改變。

圖4 谷子和青狗尾草基因的染色體位置Fig.4 Chromosomal locations of genes of S.italica and S.viridis

2.6 進(jìn)化選擇壓力（Ka/Ks）分析

為了了解青狗尾草到谷子的馴化過程是否影響了同源基因的變化，我們計(jì)算了青狗尾草和谷子RNAi 途徑基因之間的Ka/Ks（表3）。DCL1b、AGO16 和PNH1 的Ka/Ks=1，即Ka=Ks，說明它們?cè)谶M(jìn)化上受中性選擇。AGO1b 的Ka>Ks，即Ka/Ks>1，說明SvAGO1b到SiAGO1b進(jìn)化過程中受到正向選擇，說明這個(gè)基因在青狗尾草與谷子分化過程中具有重要作用，可能對(duì)物種的形成有影響。其余基因均為Ka

表3 青狗尾草和谷子的Ka/KsTable 3 Ka/Ks of S.viridis and S.italica

進(jìn)一步對(duì)SvAGO1b和SiAGO1b的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在SvAGO1b 蛋白質(zhì)的N 端存在一個(gè)22 nt的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，而在SiAGO1b 中則不存在這種結(jié)構(gòu)。說明在青狗尾草/谷子的自然選擇/馴化過程中，AGO1b 的N 端的結(jié)構(gòu)可能受到了不同程度的選擇壓力。

2.7 基因表達(dá)分析

基因結(jié)構(gòu)和功能域的變化往往預(yù)示著表達(dá)水平的變化。為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了青狗尾草和谷子RNAi 途徑相關(guān)基因在16 種不同生長時(shí)期、不同生長條件下各基因的表達(dá)量（圖5）。在青狗尾草的AGO 家族中，除了SvAGO1b/c、SvAGO4b和SvPNH1，其余多數(shù)AGO 成員表達(dá)量則較低。SvAGO1b的表達(dá)水平普遍高于SvAGO1c，而SvAGO1d則幾乎不表達(dá)。具體表現(xiàn)為，SvAGO1b在6 天齡的芽、葉片、不同處理?xiàng)l件下的根和紅光處理的地上部分中均有著較高的表達(dá)水平（TPM>40）；SvAGO1c在6 天齡的芽、藍(lán)光、黑暗和遠(yuǎn)紅光處理的地上組織中表達(dá)水平較高（TPM>40）。表明SvAGO1b在多數(shù)生長發(fā)育階段可能發(fā)揮著重要作用，尤其在葉片和不同處理下的根中；SvAGO1c響應(yīng)光變化，在功能上可能與SvAGO1b有著一定差異；SvAGO1d則可能不發(fā)揮作用或在特定時(shí)期發(fā)揮功能。SvAGO4b則在6 天齡的芽、10 天齡的根、藍(lán)光、黑暗和遠(yuǎn)紅光處理的地上組織中表達(dá)量較高（TPM>40），且SvAGO4b的表達(dá)水平均略高于SvAGO4a，不同于前者的是SvAGO4a與SvAGO4b在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)趨勢基本一致。

圖5 青狗尾草和谷子RNAi 相關(guān)基因組織特異性表達(dá)分析Fig.5 Tissue-specific expression analysis of RNAi-related genes in S.viridis and S.italica

青狗尾草的DCL 家族中，SvDCL1a在光處理下有著較高的表達(dá)水平，并在暗處理下的地上組織中表達(dá)量最高（TPM=64.46）。表明在地上組織中，DCL 家族的SvDCL1a可能發(fā)揮主要作用，其他成員則可能存在著時(shí)空特異性表達(dá)。此外，相比于不同處理，SvDCL2僅在暗處理和遠(yuǎn)紅光處理下的地上部分中有較高的表達(dá)水平（TPM=101.89），表明SvDCL2可能是潛在的光響應(yīng)基因。其他DCL 成員則表達(dá)量較低或幾乎不表達(dá)（TPM<20）。

青狗尾草的RDR 家族中，整體表達(dá)水平也較低，但相比于不同處理，SvRDR1在暗處理的地上部分中表達(dá)量相對(duì)較高（TPM=31.34）。此外，SvRDR2在不同組織、不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)量則略高于SvRDR3。結(jié)果表明，青狗尾草RDR 家族成員的表達(dá)模式基本一致，但在葉中幾乎不表達(dá)。不同于青狗尾草，SiRDR3在6 天齡的芽和不同光處理的地上組織中表達(dá)量較高。說明青狗尾草RDR 家族蛋白功能類似，SvRDR1可能在根中和暗處理的地上部分發(fā)揮著主要作用，且SvRDR3和SiRDR3在功能上可能有分化。

我們通過比對(duì)SvAGO1b和SiAGO1b的表達(dá)量，分析N 端的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的差異是否對(duì)AGO1b 的轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生了影響。發(fā)現(xiàn)在多數(shù)時(shí)期和處理下，SiAGO1b和SvAGO1b的表達(dá)模式相似。說明N 端的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的有無幾乎不影響AGO1b 的跨膜能力及其功能。

可以看出，除RDR3 外的青狗尾草和谷子的RNAi 途徑相關(guān)基因在不同生長發(fā)育時(shí)期下各基因的表達(dá)模式基本一致，且基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域存在差異的同源基因間表達(dá)水平也沒有發(fā)生明顯的變化，說明在青狗尾草和谷子中，RNAi 途徑相關(guān)基因行駛的功能相對(duì)重要和穩(wěn)定，自然選擇和馴化過程并沒有使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生大的變化，因而其表達(dá)水平也相對(duì)穩(wěn)定。

3 討論

馴化是人類最偉大的發(fā)明之一，馴化可以使野生物種在強(qiáng)大的人工選擇壓力下獲得對(duì)人類有利的優(yōu)良性狀變成栽培/家養(yǎng)品種［21］。人類對(duì)農(nóng)作物的馴化歷史悠久，例如9 000年前野生水稻被馴化為栽培稻［22］，8 000年前野生棉被馴化成為栽培棉［23］。又有大芻草馴化成玉米［24］，野生大豆馴化成栽培大豆［25］，萵苣馴化成生菜等［26］。自青狗尾草和谷子基因組信息公布以來，越來越多的研究集中于青狗尾草到谷子的馴化過程的分子機(jī)制。因此，研究青狗尾草基因組中表觀遺傳修飾相關(guān)基因家族的序列和結(jié)構(gòu)特征及其表達(dá)水平，并與谷子同源基因進(jìn)行進(jìn)化比較分析，將有助于加深理解表觀遺傳修飾在青狗尾草和谷子馴化過程中的功能和作用。

表觀遺傳學(xué)中的 RNAi 途徑在DNA 甲基化［2,27］、轉(zhuǎn)錄后沉默［13,28］、抵抗病原微生物入侵［29-30］和調(diào)控植物生長發(fā)育［31-33］等方面發(fā)揮重要作用。本研究利用同源比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域探尋方法在青狗尾草全基因組水平鑒定到13 個(gè)AGO、7 個(gè)DCL 和4 個(gè)RDR 蛋白。它們與谷子同源蛋白的相似度在95%-100%之間，說明在馴化或進(jìn)化過程中青狗尾草和谷子的這些同源基因間是保守和穩(wěn)定的。進(jìn)一步對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，在青狗尾草中SvAGO12/14/18、SvDCL3b 和SvRDR3 的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)與谷子相比有差異。Res Ⅲ和RdRP 結(jié)構(gòu)域分別是DCL 家族和RDR 家族中極其重要的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域的變化可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變。此外，青狗尾草和谷子的DCL1b 和DCL1c 只包含極少的保守結(jié)構(gòu)域，而在水稻中，與OsDCL1a相比，OsDCL1b和OsDCL1c丟失了大部分外顯子及其對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為是假基因不發(fā)揮功能［14］，說明DCL1b 和DCL1c 的結(jié)構(gòu)域或功能喪失可能是在禾本科物種中普遍存在的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，SvAGO1b在葉片和不同處理下的根中發(fā)揮著重要作用，其中TPM 值最高可達(dá)103.75；SvAGO1c在不同光處理下的地上組織樣品中表達(dá)量較高，SvDCL1a在葉片中和光處理下地上組織中表達(dá)量較高，且SvRDR1在多數(shù)處理下的根組織中和暗處理的地上組織中表達(dá)量相對(duì)較高，而各家族的其他成員表達(dá)量較低或幾乎不表達(dá)，暗示各家族僅需要個(gè)別成員表達(dá)以發(fā)揮主要作用，其他成員則低表達(dá)作為補(bǔ)充，或與時(shí)空性表達(dá)有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，SvAGO1b和SvRDR1在根中表達(dá)量相對(duì)較高，暗示其在青狗尾草應(yīng)對(duì)土壤微生物是可能發(fā)揮重要作用。此外，我們的研究結(jié)果還表明，除RDR3 外各同源基因在青狗尾草和谷子中表達(dá)模式相似，說明谷子在馴化過程中，其各同源基因在功能上與青狗尾草相比未發(fā)生明顯分歧。

4 結(jié)論

本研究利用比較基因組學(xué)在青狗尾草中鑒定到13 個(gè)AGO 蛋白、7 個(gè)DCL 蛋白和4 個(gè)RDR 蛋白。SvDCL3b 和SvRDR3 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域有缺失。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，SvAGO1b、SvDCL1a和SvRDR1在各家族中表達(dá)量較高。