徐超，章紹兵，孟珺，王敬麗，朱萌茜

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州，450001)

人體所需能量很大一部分來自于自身的氧化作用，而氧化過程中會(huì)產(chǎn)生大量的自由基物質(zhì)。這些自由基物質(zhì)會(huì)加速人體的衰老并導(dǎo)致一系列的代謝綜合征，例如糖尿病、動(dòng)脈硬化、心腦血管疾病、神經(jīng)紊亂疾病等[1]，人體本身具有的抗氧化系統(tǒng)并不能完全抵御這些危害，所以尋找安全高效無毒的抗氧化藥物尤為重要。人們?cè)趯?duì)乳酸菌的研究過程中發(fā)現(xiàn)了一些菌株具有較強(qiáng)的綜合抗氧化能力[2]，有研究表明乳酸菌在代謝的過程中可以產(chǎn)生一些具有抗氧化性的物質(zhì)，例如阿魏酸、半胱氨酸、過氧化氫酶等。

高脂血癥是指血漿中的膽固醇或者甘油三酯的水平過高，可直接引起如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等一些嚴(yán)重危害人體健康的疾病。根據(jù)調(diào)查顯示，在近十年間中國成人血脂異?；疾÷蚀蠓仙齕3]。國內(nèi)外的科學(xué)研究均已證實(shí)益生菌在緩解高血脂高血糖等方面有顯著的效果，且與傳統(tǒng)藥物治療相比，具有無毒副作用的優(yōu)點(diǎn)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)一些嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌等乳酸菌具有膽固醇降解能力[5]。本文以鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG)為陽性對(duì)照，對(duì)高加索乳桿菌(LactobacilluskefirBNCC 190565)、嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophilusATCC 4356)、布氏乳桿菌(LactobacillusbuchneriBNCC 187964)購自北京創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiCICC 23184)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumCICC 20279)這5株乳酸菌進(jìn)行了篩選，初步研究其抗氧化作用和降血脂功能，旨在篩選出1～2株具有良好的抗氧化作用和膽固醇降解功能的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L.rhamnosusGG、L.kefirBNCC 190565、L.acidophilusATCC 4356、L.buchneriBNCC 187964購自北京創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；L.caseiCICC 23184、L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

無水乙醇、鄰二氮菲、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、Na2CO3、六水氯化鐵、濃磷酸、結(jié)晶紫，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶(生物技術(shù)級(jí))、胃蛋白酶(豬源)、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, PNPG)、膽固醇，上海麥克林生化科技有限公司；IV型膠原蛋白、α -葡萄糖苷酶，美國sigma公司；豬膽鹽，上海源葉生物有限公司；牛血清白蛋白，北京索萊寶技術(shù)有限公司；甲醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；H2O2，洛陽市化學(xué)試劑廠。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20G高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；D3024R臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)，美國SCTLOGEX；SWGCZ-2F 型超凈工作臺(tái)，上海篤特科學(xué)儀器廠；PHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；XMTD-204數(shù)顯恒溫振蕩器，江蘇金壇市億通電子有限公司；DPH-360電熱恒溫培養(yǎng)箱、XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；BT-1600圖像顆粒分析儀，丹東百特儀器有限公司；MVS-1旋渦混合器，北京金北德工貿(mào)有限公司；TV-1901紫外可見分光光度儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備

1.3.1.1 菌懸液的制備

菌株在MRS液體培養(yǎng)基中連續(xù)活化3代，于18 h測(cè)定OD600值，并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，確定此時(shí)光密度對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)。將再次活化的菌液調(diào)整到相應(yīng)的光密度，離心(4 000 r/min, 4 ℃, 10 min)得到沉淀。將離心所得沉淀用生理鹽水洗滌2～3次，然后重懸，根據(jù)活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果把菌懸液統(tǒng)一調(diào)整為1.0×109CFU/mL，所得即為所需菌懸液。

1.3.1.2 發(fā)酵液的制備

將上述菌懸液按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h后，離心(4 000 r/min, 4 ℃, 10 min)，所得上清液即為所需發(fā)酵液。

1.3.2 乳酸菌益生特性的測(cè)定

1.3.2.1 產(chǎn)酸

按2%的接種量，將菌懸液接種到MRS培養(yǎng)基中，放在恒溫振蕩器培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min。24 h后測(cè)定pH值和滴定酸度，滴定酸度測(cè)定方法參考GB 5009.239—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》。

1.3.2.2 模擬消化道耐受性

(1) 消化液的配制：模擬胃液的配制參考中國藥典，pH值為2.0。模擬腸液的配制在參考藥典的同時(shí)加入豬膽鹽(3 g/L)，pH值為8.0。使用前均需在37 ℃條件下預(yù)熱。

(2) 模擬消化：取1.0 mL菌懸液至9 mL模擬胃液，在溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫振蕩器里模擬消化過程，分別在0、3 h時(shí)取樣，進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù)，并計(jì)算存活率。同樣的方法模擬腸液及膽鹽對(duì)乳酸菌的影響[6]。

1.3.2.3 黏附性

設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，以牛血清白蛋白為空白對(duì)照，在6孔培養(yǎng)板中分別加入牛血清白蛋白或IV型膠原蛋白，同時(shí)每孔放置一片玻片，室溫下包被12 h后棄去蛋白液，用pH值7.2的滅菌PBS清洗5次。分別加入2 mL 108CFU/mL的菌懸液，37 ℃孵育。3 h后將菌懸液棄去，用滅菌PBS洗滌4次。然后用甲醇固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，10個(gè)視野中細(xì)菌的平均數(shù)作為平均黏附量。每種菌和不同蛋白的組合均設(shè)置3個(gè)孔位以作重復(fù)[7]。

1.3.3 乳酸菌抗氧化能力的測(cè)定[8]

1.3.3.1 羥自由基清除能力的測(cè)定方法

在試管中加入1 mL鄰二氮菲(2.5 mmol/L)、1 mL無菌PBS(pH 7.2)、1 mL菌懸液或發(fā)酵液，再加入1 mL的FeSO4(2.5 mmol/L)，充分混勻后加入1 mL的H2O2(20 mmol/L)，37 ℃水浴1.5 h后，在536 nm波長處測(cè)定吸光度值(OD值)，記為A1；將1 mL發(fā)酵液或菌懸液稀釋到5 mL，測(cè)得吸光度值A(chǔ)2；用生理鹽水代替菌懸液或發(fā)酵液，其他操作不變，測(cè)得吸光度值A(chǔ)3；用生理鹽水代替菌懸液或發(fā)酵液，用蒸餾水代替H2O2，其他操作不變，測(cè)得吸光度值A(chǔ)0。羥自由基清除率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3.2 還原能力測(cè)定方法

在2 mL離心管中加入0.5 mL的菌懸液或發(fā)酵液、0.5 mL的鐵氰化鉀(1%)、0.5 mL PBS(pH 6.6)，充分振蕩混合均勻，在50 ℃水浴20 min后，冰浴急速冷卻，再次加入0.5 mL三氯乙酸(10%)，3 000 r/min離心10 min。取其上清液1 mL，加入1 mL FeCl3(0.1%)，室溫放置10 min 后，在710 nm波長處測(cè)定OD值。用生理鹽水代替樣品作為空白組，用空白組和實(shí)驗(yàn)組OD值的差值來表征還原能力的強(qiáng)弱，計(jì)算如公式(2)所示：

還原力=A710(實(shí)驗(yàn))-A710(空白)

(2)

1.3.3.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定方法

在2 mL離心管中加入1 mL的菌懸液或者發(fā)酵液，然后加入1 mL的DPPH自由基無水乙醇溶液(0.2 mmol/L)，使用旋渦混合器混合均勻，在室溫條件下避光反應(yīng)30 min后離心，離心條件為轉(zhuǎn)速6 000 r/min、時(shí)間10 min。取其上清液在517 nm波長處測(cè)定吸光度，測(cè)得的吸光度值記為A1；用生理鹽水代替菌懸液或發(fā)酵液，其他操作不變，測(cè)得的吸光度值記為A2；用生理鹽水代替菌懸液或發(fā)酵液，無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液，其他操作不變，測(cè)得的吸光度值記為A0。DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

1.3.4 乳酸菌降膽固醇能力的測(cè)定

1.3.4.1 膽固醇培養(yǎng)基的配制

膽固醇無法直接溶于MRS液體培養(yǎng)基，所以參考郭翔[5]的實(shí)驗(yàn)，將雞蛋黃作為培養(yǎng)基的膽固醇來源。膽固醇培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基+5%(體積分?jǐn)?shù))蛋黃液。

1.3.4.2 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取2.5 g六水氯化鐵溶于87%濃磷酸中，加濃磷酸定容到100 mL，貯存于棕色試劑瓶內(nèi)，使用時(shí)取8 mL該液，加濃硫酸定容至100 mL，所得試劑即為磷鐵硫試劑。準(zhǔn)確稱取膽固醇溶解于無水乙醇中，并用無水乙醇定容，使最終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，精確吸取2 mL該液，使用無水乙醇稀釋50倍，可以于冰箱冷藏，使用前放置到室溫。分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液加入試管中，用無水乙醇統(tǒng)一調(diào)整到1 mL，然后加入2 mL磷鐵硫試劑搖勻冷卻后，在550 nm波長處測(cè)定OD值。

1.3.4.3 膽固醇含量的測(cè)定

按2%的接種量在膽固醇培養(yǎng)基中接種乳酸菌，37 ℃、180 r/min的條件下在恒溫振蕩器中培養(yǎng) 24 h，取2 mL的菌液加入離心管中，3 000 r/min離心10 min，取其上清液加入1 mL無水乙醇渦旋振蕩5 min，10 000 r/min離心10 min。再次取400 μL加入到離心管中，加入1.6 mL無水乙醇，振蕩處理5 min, 10 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液，加入2 mL磷鐵硫試劑，搖勻冷卻后，在550 nm波長處測(cè)定OD值。利用膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線確定膽固醇含量，并計(jì)算降解率[9]。

1.3.5 乳酸菌對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力的測(cè)定

參考ZHANG等[10]以及張軍蒙[6]的實(shí)驗(yàn)方法，并略作修改，在試管中加入50 μL菌液、150 μL的PNPG (2.5 mmol/L)、300 μL PBS溶液(0.1 mol/L, pH 6.8)，孵育(37 ℃, 10 min)，然后加入100 μL α-葡萄糖苷酶(0.2 U/mL)在37 ℃的條件下反應(yīng)20 min，最后加入2 mL Na2CO3溶液(1 mol/L)終止反應(yīng)，在405 nm波長處測(cè)OD值，測(cè)得的OD值記為A1；用PBS代替α-葡萄糖苷酶，其他操作不變，測(cè)得的OD值記為A2；用生理鹽水代替菌液，其他操作不變，測(cè)得的OD值記為A3；用生理鹽水代替菌液，用PBS代替α-葡萄糖苷酶，其他操作不變，測(cè)得的OD值記為A0。α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均由3次或以上平行實(shí)驗(yàn)計(jì)算得出平均值，使用SPSS 25和origin 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理以及繪圖，使用Duncan法或t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌益生特性的比較

2.1.1 不同乳酸菌產(chǎn)酸能力對(duì)比

有研究認(rèn)為乳酸菌在腸道繁殖過程中產(chǎn)生的乳酸、乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸可以改變腸道環(huán)境，降低腸道的酸度，從而抑制一些致病菌在人體生長，同時(shí)還能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，加速了病原體的排出。本實(shí)驗(yàn)使用了2種評(píng)價(jià)方法來評(píng)價(jià)乳酸菌的產(chǎn)酸能力，一種是測(cè)乳酸菌生長24 h前后pH值的變化大小，一種是用NaOH滴定發(fā)酵液并換算成乳酸度，用吉爾涅爾度(°T)表示。從圖1-a、圖1-b可看出，2種評(píng)價(jià)方法得出的結(jié)果趨勢(shì)相同。6種菌中產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的是L.rhamnosusGG、L.caseiCICC 23184和L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279，24 h的ΔpH均在2.0以上，滴定酸度也都在120 °T左右，均顯著高于其他3種菌。王明好[11]對(duì)12株乳酸菌的產(chǎn)酸性能測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其中8株菌的ΔpH為2.0～2.5，最高的一株菌ΔpH為2.42。王磊[12]對(duì)65株乳酸菌的產(chǎn)酸能力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)乳酸菌發(fā)酵后的酸度在100 °T左右，僅有2株菌的酸度可達(dá)到140 °T以上。綜上所述，L.rhamnosusGG、L.caseiCICC 23184和L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279這3株菌的產(chǎn)酸能力比較優(yōu)良。

2.1.2 不同乳酸菌模擬消化道耐受性對(duì)比

模擬胃液具有胃蛋白酶和低pH，模擬腸液中含有胰蛋白酶和膽鹽，這些均不利于乳酸菌生長。乳酸菌在人體內(nèi)發(fā)揮作用的前提是必須要對(duì)人體的胃腸液有一定的耐受性，擁有較高耐受性的菌株才能更好的在人體內(nèi)存活并發(fā)揮出益生作用。由圖2可知，在模擬胃液處理3 h后，存活率最高的為L.buchneriBNCC 187964和L.acidophilusATCC 4356，存活率分別為60.3%和52.5%，其次是L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279，存活率為47.0%，均高于L.rhamnosusGG。張軍蒙[6]測(cè)定了18株乳酸菌對(duì)胃液的耐受性，結(jié)果表明，18株乳酸菌中有11株存活率在20%～45%，只有4株菌的存活率在50%以上；由圖2可知，對(duì)腸液和膽鹽具有較高耐受性的菌株是L.acidophilusATCC 4356和L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279，存活率分別為64.5%和48.3%，均高于L.rhamnosusGG。呂嘉櫪等[13]對(duì)18株乳酸菌的腸液耐受力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中有16株菌的存活率在20% 以上，其中有3株菌的存活率在70% 以上。綜合分析，L.acidophilusATCC 4356和L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279具有良好的消化道耐受性。

2.1.3 不同乳酸菌黏附能力對(duì)比

乳酸菌在腸道發(fā)揮益生作用前需要在腸道內(nèi)完成黏附定植，有研究表明[14]細(xì)胞外的膠原蛋白參與了細(xì)胞黏附。所以本實(shí)驗(yàn)用牛血清白蛋白作為陰性對(duì)照，通過比較乳酸菌對(duì)IV型膠原蛋白和牛血清白蛋白黏附量的差異來評(píng)價(jià)菌株的黏附力。由表1可知，除L.kefirBNCC 190565外，其余菌株對(duì)2種蛋白的黏附均有顯著性差異，即L.rhamnosusGG、L.buchneriBNCC 187964、L.acidophilusATCC 4356、L.caseiCICC 23184、L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279均對(duì)IV型膠原蛋白具有特異性黏附作用。ARGYRI等[15]對(duì)13株乳酸菌研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株的黏附能力差異顯著，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌具有較強(qiáng)的黏附能力。

圖2 不同菌株在模擬胃液或模擬腸液中處理3 h后的存活率Fig.2 Survival rate of different strains treated in simulated gastric fluid or simulated intestinal fluid for 3 h

表1 不同菌株對(duì)不同蛋白的黏附量Table 1 Adhesion of different strains to different proteins

2.2 乳酸菌抗氧化能力的比較

現(xiàn)存的抗氧化測(cè)定方法非常多，但并沒有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，所以在研究物質(zhì)的抗氧化作用的時(shí)候，一般會(huì)選取以不同原理為基礎(chǔ)的方法，來共同說明該物質(zhì)的抗氧化能力。所以綜合考慮，選擇了以下3種方法共同評(píng)價(jià)乳酸菌的抗氧化能力。

2.2.1 不同乳酸菌菌懸液及發(fā)酵液對(duì)羥自由基的清除作用

人體中的自由基90%都是氧自由基，羥自由基是一種強(qiáng)烈的氧自由基，這種自由基會(huì)導(dǎo)致DNA降解、損傷細(xì)胞膜和多糖類物質(zhì)，由此導(dǎo)致多種人體細(xì)胞損傷及脂質(zhì)過氧化。劉珊春等[16]對(duì)18株乳酸菌的羥自由基清除率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)清除率最高為34.89%。由圖3可知，幾種菌的菌懸液中，羥自由基清除能力最強(qiáng)的是L.caseiCICC 23184和L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279，L.caseiCICC 23184的羥自由基清除率為40.7%，L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279的羥自由基清除率為38.6%，均高于L.rhamnosusGG；由圖3可知，幾種菌的發(fā)酵液中，對(duì)羥自由基清除能力最差的是L.buchneriBNCC 187964，清除率為16.7%，其余5種菌發(fā)酵液的羥自由基清除率均高于L.buchneriBNCC 187964，且與L.rhamnosusGG無顯著性差異。考慮到乳酸菌產(chǎn)品通常同時(shí)包括乳酸菌菌體和分泌物，綜合比較表明，L.acidophilusATCC 4356、L.caseiCICC 23184、L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279均具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。除L.rhamnosusGG外的乳酸菌菌懸液的羥自由基清除率均高于或接近于發(fā)酵液，可能是因?yàn)檫@些乳酸菌菌體上清除羥自由基的活性物質(zhì)含量高于發(fā)酵液中的含量。

圖3 不同菌株菌懸液和發(fā)酵液的羥自由基清除率Fig.3 Hydroxyl radical scavenging rates of bacterial suspensions and fermentation broths of different strains 注：不同大寫字母表示同株菌不同組分有顯著性差異(P<0.05)，不同 小寫字母表示不同菌株同種組分具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2.2 不同乳酸菌菌懸液及發(fā)酵液的還原能力對(duì)比

還原能力是指抗氧化劑抵抗氧脅迫和降低螯合亞鐵離子的能力，是體外檢測(cè)抗氧化劑抗氧化能力的關(guān)鍵指標(biāo)。由圖4可知，幾種菌的菌懸液中，還原力最強(qiáng)的為L.buchneriBNCC 187964和L.rhamnosusGG；幾種菌的發(fā)酵液中，還原力最強(qiáng)的是L.acidophilusATCC 4356，其還原力強(qiáng)于L.rhamnosusGG。綜合比較表明，除L.kefirBNCC 190565外，其余5株菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力。發(fā)酵液還原力顯著高于菌懸液，可能是因?yàn)榫哂羞€原能力的活性物質(zhì)主要存在于乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物之中。

2.2.3 不同乳酸菌菌懸液及發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基的清除作用

DPPH是一種人工合成的、穩(wěn)定的自由基，能與自由基清除劑反應(yīng)，孤對(duì)電子被配對(duì)，DPPH自由基變?yōu)镈PPH-H非自由基形式，溶液從紫色變?yōu)辄S色，吸光度值也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。以此為原理進(jìn)行的抗氧化能力評(píng)價(jià)的方法具有快速、簡單、靈敏的特點(diǎn)，所以被廣泛應(yīng)用。由圖5可知，6株菌的菌懸液對(duì)DPPH自由基的清除率沒有顯著性差異；從圖5可以看出6株菌的發(fā)酵液中，L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279的清除能力顯著高于其他5株菌。對(duì)比菌懸液和發(fā)酵液的DPPH自由基清除率，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的自由基清除能力要遠(yuǎn)高于菌懸液。所以推測(cè)菌株的抗氧化能力主要靠發(fā)酵液中代謝物質(zhì)來體現(xiàn)。有研究表明，乳酸菌的DPPH自由基清除能力可能和菌體產(chǎn)生的胞外多糖濃度正相關(guān)[17]。

圖4 不同菌株菌懸液及發(fā)酵液的還原能力Fig.4 The reducing ability of bacterial suspension and fermentation broth of different strains

圖5 不同菌株菌懸液及發(fā)酵液的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging rate of bacterial suspension and fermentation broth of different strains

綜合3個(gè)指標(biāo)比較，發(fā)現(xiàn)抗氧化能力較強(qiáng)的菌株為L.acidophilusATCC 4356、L.caseiCICC 23184和L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279。DAS等[18]報(bào)道了植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌具有較高的抗氧化能力，與本文結(jié)果相近。

2.3 乳酸菌降膽固醇能力的比較

國外研究者發(fā)現(xiàn)，一些飲用乳桿菌發(fā)酵乳制品的人群中，其體內(nèi)的血清膽固醇普遍較低[19]。這一現(xiàn)象引起了學(xué)者們的注意，在不斷地研究下，人們發(fā)現(xiàn)不同菌類的乳酸菌具有降低膽固醇的效果。本文比較了幾類被證實(shí)具有降膽固醇效果的乳酸菌，由圖6可知，6株乳酸菌降解率均在50%以上。TANG等[20]所測(cè)的11株菌中膽固醇清除率最高的是一株植物乳桿菌，清除率為47.83%，比較之后可以看出本文所測(cè)6株菌均具有優(yōu)秀的膽固醇降解能力。可能是乳酸菌在生長的過程中，分泌的一些代謝產(chǎn)物，例如胞外多糖或蛋白質(zhì)，起到了降解膽固醇的作用。王霄鵬等[21]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵液中的多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)對(duì)膽固醇均具有一定的降解率。有研究證明，乳酸菌可以通過分泌膽汁鹽水解酶或者吸收、分解膽固醇的方式來降低膽固醇含量[22]。

圖6 不同菌株的膽固醇降解率Fig.6 Cholesterol degradation rate of different strains

2.4 乳酸菌對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力的比較

α-葡萄糖苷酶是一種碳水化合物水解酶，催化α-葡萄糖從底物的非還原端釋放。α-葡萄糖苷酶可促進(jìn)小腸對(duì)葡萄糖的吸收，從而提高了血糖和血脂含量水平，所以可以通過抑制α-葡萄糖苷酶來達(dá)到降低血糖和血脂的目的[23]。α-葡萄糖苷酶可以降解PNPG產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol, PNP)，所以可以通過測(cè)定PNP在405 nm處的吸光度來反映α-葡萄糖苷酶的被抑制程度。由圖7可知，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高的是L.buchneriBNCC 187964，抑制率為26.3%，其余5株菌對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率均在10%～20%。WANG等[24]測(cè)定了L.rhamnosusGG的α-葡萄糖苷酶抑制率，其抑制率為17.21%，與本文測(cè)定的L.rhamnosusGG結(jié)果相近。本文所測(cè)的其余5株菌的α-葡萄糖苷酶抑制率均與L.rhamnosusGG相近或略高，即均具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制效果。

圖7 不同菌株的α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.7 α-glucosidase inhibition rate of different strains

3 結(jié)論

本文對(duì)L.kefirBNCC 190565、L.acidophilusATCC 4356、L.buchneriBNCC 187964、L.caseiCICC 23184、L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279、L.rhamnosusGG這6株乳酸菌進(jìn)行了益生特性、抗氧化作用、降膽固醇能力、α -葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定，旨在篩選出具有較強(qiáng)抗氧化作用、降解膽固醇和降血糖功能的乳酸菌，以期制備出具有更強(qiáng)功能的乳酸菌產(chǎn)品。

對(duì)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)L.acidophilusATCC 4356和L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279具有較強(qiáng)的消化道耐受力，能很好的在人體內(nèi)生存，且均具有良好的益生活性；抗氧化作用通常需要通過不同的指標(biāo)來共同評(píng)價(jià)，考慮到乳酸菌產(chǎn)品通常同時(shí)包括乳酸菌菌體和分泌物，所以綜合比較發(fā)現(xiàn)抗氧化作用較強(qiáng)的菌株有L.acidophilusATCC 4356、L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279和L.caseiCICC 23184，優(yōu)于L.rhamnosusGG；6株菌對(duì)膽固醇的降解率均在50%以上，表現(xiàn)出很強(qiáng)的膽固醇降解能力；L.buchneriBNCC 187964的α-葡萄糖苷酶抑制率高于L.rhamnosusGG，其余4株菌和L.rhamnosusGG沒有顯著性差異。以L.rhamnosusGG為陽性對(duì)照，以抗氧化能力和膽固醇降解率為主要篩選指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)L.acidophilusATCC 4356、L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279和L.caseiCICC 23184這3株菌表現(xiàn)良好，但考慮到乳酸菌必須存活下來才能在人體發(fā)揮相應(yīng)的作用，所以排除了腸胃液耐性較差的L.caseiCICC 23184；L.buchneriBNCC 187964具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制率，但腸液耐受力較差，同樣被排除；進(jìn)行一系列的分析比較發(fā)現(xiàn)L.acidophilusATCC 4356和L.plantarumsubsp.plantarumCICC 20279不僅有著較好的抗氧化能力和降血脂能力，還有良好的胃腸液存活能力，具有在人體中發(fā)揮出相應(yīng)作用的潛力。