肖丁浩，張若蘭，洪鵬志,2，周春霞,2*，宋春勇，鐘坦君

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院, 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實驗, 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心, 廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 創(chuàng)新中心,廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東 湛江，524088)2(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心， 大連 工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連，116034)

二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid，DHA)是人體中的一種功能性脂肪酸，能預(yù)防心血管疾病[1]，影響嬰幼兒及兒童時期神經(jīng)系統(tǒng)和認(rèn)知功能的發(fā)育，尤其對兒童腦細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞的發(fā)育及功能有重要作用[2]。目前用于食品營養(yǎng)補(bǔ)充劑的DHA主要來源于魚油和藻油[3]。與魚油相比，藻油屬于植物性油脂，具有易獲取、對環(huán)境污染小的特點(diǎn)，因此藻油常被作為DHA的主要來源和載體應(yīng)用于食品[3]。然而，將DHA藻油直接添加到食品體系中，會不可避免地改變食品的風(fēng)味和穩(wěn)定性，且富含多不飽和脂肪酸的DHA藻油也極易被氧化，引起油脂某些品質(zhì)指標(biāo)的改變[4]。研究表明，乳液體系可以提高藻油的物理穩(wěn)定性[5]。乳液是一種液體，以小液滴的形式均勻分散在另一種不相容液體中的體系[6]，蛋白質(zhì)-DHA藻油乳液可以增強(qiáng)DHA的穩(wěn)定性和生物利用率[7]。CHANG等[8]比較了乳清濃縮蛋白、Tween80和Tween 80+Span80對DHA藻油乳液貯藏穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)乳清濃縮蛋白穩(wěn)定DHA藻油的能力弱于小分子表面活性劑。因此，需要對天然蛋白質(zhì)進(jìn)行適度處理以提高其乳化能力。

研究表明，動植物蛋白混合經(jīng)物理和化學(xué)方法制備的共沉淀蛋白，具有比單一蛋白質(zhì)無法比擬的加工性質(zhì)[9-10]。與單一蛋白質(zhì)相比，采用共沉淀法制備的大豆-乳清和棉籽-乳清共沉淀蛋白，具有強(qiáng)的親水性和吸脂性，且其溶解度和乳化能力明顯提高[9]；KRISTENSEN等[10]研究發(fā)現(xiàn)，共沉淀法可以改善豌豆蛋白的功能特性。與單一大豆球蛋白相比，混合酪蛋白和大豆蛋白制備的乳液具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，且其穩(wěn)定性隨酪蛋白含量的增加而增強(qiáng)。此外，在乳清-豌豆共沉淀蛋白中，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用主要是二硫鍵和靜電相互作用[11]，也包括變性亞基之間的非共價相互作用。與單一蛋白相比，大多數(shù)共沉淀可溶性聚集體顯示出更高的分子質(zhì)量和更小的直徑，同時共沉淀蛋白的熱穩(wěn)定性[11]和凝膠性能[12]也會明顯增強(qiáng)。實際上，共沉淀蛋白的溶解度、發(fā)泡能力和凝膠性能都明顯優(yōu)于單一蛋白，植物蛋白和動物蛋白共混體系具有比單一蛋白更獨(dú)特的功能，同時也可以滿足不同年齡段消費(fèi)群體的營養(yǎng)需求[2]。

近年來，有關(guān)魚蛋白潛在的抗氧化應(yīng)用被廣泛報道，可作為一種潛在的乳化劑[13]。魚蛋白具有獨(dú)特的氨基酸組成，能有效阻止蛋白結(jié)構(gòu)被氧自由基攻擊，緩解乳液中油脂的氧化[14]。羅非魚是我國養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)魚類，2019年我國羅非魚產(chǎn)量164萬t，占全球羅非魚總產(chǎn)量的26%，生產(chǎn)潛力和加工潛力巨大[15]。然而，魚蛋白本身的溶解性和熱穩(wěn)定性較差，在加工貯藏過程中，魚蛋白乳液易發(fā)生凝聚和沉淀的現(xiàn)象，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。大豆分離蛋白具有良好的加工特性，是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的植物蛋白。因此，本研究以羅非魚和豆粕為原料，按比例混合經(jīng)堿溶酸沉法提取羅非魚-大豆共沉淀蛋白(tilapia-soy protein co-precipitates，TSPC)，高壓均質(zhì)制備DHA藻油乳液，研究TSPC穩(wěn)定的DHA藻油乳液的物理穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性，為共沉淀蛋白乳液的制備及其對DHA藻油的穩(wěn)定化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚，廣東湛江當(dāng)?shù)厮a(chǎn)加工市場，取背部白肉攪碎，保存于-20 ℃下備用；大豆豆粕，山東萬德福生物技術(shù)有限公司，攪碎后過80目篩，室溫貯藏備用；40% DHA藻油，陜西承乾生物科技有限公司；尼羅紅，上海麥克林生化科技有限公司；尼羅藍(lán)，SIGMA試劑公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-26 sxp落地高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman公司；ALPHA1-2LD plus冷凍干燥機(jī)，德國Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen公司；高壓納米均質(zhì)機(jī)，加拿大ATS儀器公司；DF-101S恒溫水浴鍋，河南省予華儀器有限公司；Nano Brook Omni激光粒度及Zeta電位儀，美國布魯克海文儀器公司；Cintra1010紫外分光光度計，澳大利亞GBC儀器公司；FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡，奧林巴斯儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分離蛋白的制備

采用堿溶酸沉法[16]制備羅非魚分離蛋白(tilapia protein isolate，TPI)、TSPC和大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)。其中TPI制備過程中采用的溶解pH值為11.0，沉淀pH值為5.5；將羅非魚肉和大豆按質(zhì)量比2∶1、1∶1和1∶2混合制備TSPC2∶1、TSPC1∶1和TSPC1∶2，采用的溶解pH值為11.0，沉淀pH值為4.5；SPI制備過程中采用的溶解pH值為8.0和沉淀pH值為4.5。蛋白溶液經(jīng)冷凍干燥后密封干燥，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白乳液的制備

取上述TPI、TSPC2∶1、TSPC1∶1、TSPC1∶2和SPI 5種蛋白粉末分別分散于去離子水，冰浴條件下磁力攪拌2 h，制備蛋白質(zhì)量濃度10 mg/mL的蛋白溶液，利用高壓均質(zhì)機(jī)在60 MPa條件下均質(zhì)循環(huán)5次，得到預(yù)處理后的5種蛋白溶液。取上述預(yù)處理后的蛋白溶液，按照油水比為1∶9(g∶mL)的比例添加DHA藻油，經(jīng)10 000 r/min勻漿2 min，并高壓均質(zhì)(60 MPa)循環(huán)5次，得到5種蛋白穩(wěn)定的DHA藻油乳液。將新鮮制備的乳液分別分裝，密封于容量為50 mL的玻璃瓶中，4 ℃貯藏28 d，用于物理穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性的檢測。

1.3.3 粒徑和Zeta電位的測定

為避免多次散射的影響，利用去離子水將乳液稀釋至0.5%(體積分?jǐn)?shù))，在室溫條件下測定乳液的平均粒徑、多分散性指數(shù)(polydispersity，PDI)和Zeta電位。每個樣品至少測定3次，并取平均值。

1.3.4 濁度的測定

參考孫亞欣等[17]的方法并略作改動。利用去離子水將新鮮制備的蛋白乳液稀釋1 000倍，以去離子水作空白對照，在波長為600 nm處測定其吸光度，濁度T的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A，稀釋乳液在600 nm處的吸光度；V，稀釋倍數(shù)；I，光程差，取1 cm。

1.3.5 乳析指數(shù)的測定

參考ZHANG等[18]的方法測定乳液的乳析指數(shù)。4 ℃貯藏28 d期間，每天記錄乳液的乳析情況并拍照，乳析指數(shù)(creaming index,CI)的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：HC，乳液底部析出清液層的高度；HE，乳液的總高度。

1.3.6 氧化穩(wěn)定性的測定

參考SHAO等[19]的方法并稍加修改，測定乳液的氫過氧化值。將異辛烷和異丙醇按照3∶1的體積混合，作為溶液A；將甲醇和正丁醇按照2∶1的體積比混合，作為溶液B；將0.132 mol/L的氯化鋇和0.144 mol/L的硫酸亞鐵等體積混合，在室溫下5 000 r/min離心2 min，所得上清液為溶液C。取200 μL蛋白乳液與1.5 mL溶液A混合，渦旋10 s并靜置10 s，重復(fù)3次后在室溫下5 000 r/min離心3 min。吸取200 μL上層有機(jī)相與2.8 mL溶液B混合，依次加入0.3 g/mL硫氰酸銨和溶液C各15 μL，充分混合后孵育20 min，在波長510 nm處測量溶液的吸光度，同時采用過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的氫過氧化物值。

參考陳旭輝[20]的方法并作略微修改測定乳液的硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)值。取0.5 mL乳液與1 mL的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)試劑混合，90 ℃水浴加熱15 min。冷卻至室溫后，用注射器小心吸取底部清液過0.45 μm濾膜，于波長532 nm處測定其吸光值。同時利用0.1 mmol/L的1,1,3,3-四乙氧基丙烷作標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)曲，以水作為對照組。其中TBA試劑的配制：稱取三氯乙酸15 g和2-硫代巴比妥酸0.375 g，加入到100 mL的0.5 mol/L HCl溶液中，并超聲至溶質(zhì)完全溶解。

1.3.7 乳液的微觀結(jié)構(gòu)觀察

乳液形貌學(xué)的觀察參考陳艾霖等[21]的方法并稍加修改。將10 mg尼羅紅分散于5 mL甲醇溶液中制備尼羅紅溶液，將5 mg尼羅藍(lán)分散于5 mL去離子水中制備尼羅藍(lán)溶液。取新鮮制備的乳液，用去離子水稀釋10倍，按照V(樣品)∶V(尼羅紅)∶V(尼羅藍(lán))=1∶1∶2混合，并將混合液滴在載玻片上，利用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)放大60倍觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乳液的平均粒徑、Zeta電位和濁度分析

經(jīng)高壓均質(zhì)預(yù)處理后的蛋白溶液，添加10%的DHA藻油，再經(jīng)高壓均質(zhì)制備O/W蛋白乳液，檢測其平均粒徑、PDI、電位和濁度，結(jié)果如圖1所示。TPI乳液的平均粒徑和PDI值最大，隨著原料中大豆比例的增加，TSPC乳液的平均粒徑不斷減小(P<0.05)，電位絕對值增大(P<0.05)，電負(fù)性增強(qiáng)。TSPC2∶1乳液的平均粒徑和電位分別為603.10 nm和31.44 mV，而TSPC1∶2乳液的平均粒徑減小到277.16 nm，電位絕對值增大到41.17 mV，乳液的PDI值更小。共沉淀蛋白表現(xiàn)出的物理穩(wěn)定性與2種原料蛋白本身性質(zhì)有關(guān)。與羅非魚蛋白相比，大豆蛋白具有更好的分散性和界面活性，在均質(zhì)處理過程中，表面暴露的帶電基團(tuán)增多，蛋白質(zhì)分子間的排斥作用更大[22]，羅非魚-大豆復(fù)合共沉淀蛋白乳液的電負(fù)性增強(qiáng)(圖1-b)。因此，與TPI穩(wěn)定的DHA藻油乳液相比，大豆蛋白組分的存在明顯降低了TSPC-DHA藻油乳液的平均粒徑，增強(qiáng)了乳液的電負(fù)性，乳液的物理穩(wěn)定性增強(qiáng)。

乳液的濁度能夠反映乳液的平均粒徑和穩(wěn)定性[17]。隨著原料中羅非魚比例的減少，共沉淀蛋白乳液的濁度明顯降低，TSPC2∶1乳液的濁度值為5 577.99 cm-1，TSPC1∶2乳液的濁度值減小為3 220.28 cm-1(圖1-d)，表明乳液中小粒徑組分的比例增加。此外，在TPI和TSPC2∶1乳液的粒度分布圖中，能明顯觀察到“雙峰”，說明其粒度分布不均勻，發(fā)生了奧氏熟化現(xiàn)象[18]。而TSPC1∶1和TSPC1∶2乳液的粒度分布圖呈現(xiàn)單峰分布(圖1-c)，且與SPI乳液的粒度分布圖接近，平均粒徑更小，進(jìn)一步說明了大豆蛋白組分的存在能明顯提高TSPC-DHA藻油乳液的物理穩(wěn)定性。

2.2 乳液的乳析指數(shù)分析

乳液在4 ℃貯藏28 d，觀察實物圖并測定其乳析指數(shù)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，TPI乳液貯藏第7天即開始出現(xiàn)了明顯的分層，乳析指數(shù)高達(dá)28.57%；貯藏28 d后，TSPC2∶1乳液也出現(xiàn)了明顯的分層，其乳析指數(shù)為8.00%，乳液的穩(wěn)定性較差；而TSPC1∶1和TSPC1∶2乳液的外觀與SPI乳液接近，4 ℃貯藏28 d沒有明顯的分層現(xiàn)象，乳析指數(shù)接近于零，乳液的宏觀穩(wěn)定性好，與乳液的平均粒徑結(jié)果(圖1-a)一致，也反映了乳液貯藏穩(wěn)定性受粒徑大小的影響。在重力的作用下，大顆粒的羅非魚蛋白聚集體擴(kuò)散速度慢、易沉降，在溶液中難以覆蓋油水界面[23]。比較而言，大豆蛋白分子含有更多的親水基團(tuán)和表面電荷，更容易附著在油水的界面處[8]。當(dāng)羅非魚和大豆的混合比例為1∶1和1∶2時，TSPC中大豆蛋白組分的存在導(dǎo)致共沉淀蛋白的表面性質(zhì)足夠覆蓋油水界面，減緩了油滴的絮凝，且乳液組分之間強(qiáng)烈的布朗運(yùn)動和靜電斥力抑制了離心聚集[23]，進(jìn)而增強(qiáng)TSPC1∶1和TSPC1∶2乳液的物理穩(wěn)定性。

a-平均粒徑與PDI；b-電位；c-粒度分布；d-濁度圖1 TSPC-DHA藻油乳液的分析Fig.1 The analysis of TSPC-DHA algal oil emulsion 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

a-乳析指數(shù)；b-實物圖圖2 TSPC-DHA藻油乳液貯藏過程中乳析指數(shù)和實物圖的變化Fig.2 Creaming index of TSPC-DHA algal oil emulsion and visual appearance during storage

2.3 乳液的氧化穩(wěn)定性分析

DHA藻油富含多不飽和脂肪酸，極易被氧化，可能導(dǎo)致乳液風(fēng)味的劣化和功能活性的喪失[4]。TPI、TSPC和SPI乳液在4 ℃貯藏28 d，產(chǎn)生的初級和次級氧化產(chǎn)物含量如圖3所示。由圖3可知，4 ℃貯藏過程中，TPI乳液和TSPC乳液的氧化產(chǎn)物含量較低，而SPI乳液的氧化產(chǎn)物含量隨貯藏時間的延長明顯增加，表明TPI和TSPC能減緩DHA藻油的氧化。4 ℃貯藏28 d后，TSPC2∶1、TSPC1∶1和TSPC1∶2乳液的過氧化值分別為9.65、13.95、15.91 mmol/L，與TPI乳液接近(12.89 mmol/L)，并且產(chǎn)生的TBARS值在TPI乳液和SPI乳液之間。初步分析，一方面，魚蛋白質(zhì)自身含有與抗氧化活性有關(guān)疏水性組分，如自由巰基和色氨酸[13-14]，在預(yù)防油脂氧化方面具有天然的緩解效果,乳液均質(zhì)處理過程中，蛋白質(zhì)內(nèi)部的自由巰基和色氨酸暴露出來，并通過螯合金屬離子的方式促使自由基失活，進(jìn)而減緩油脂的氧化[14]。另一方面，TSPC中的魚蛋白組分的存在可以在油水界面形成厚的粘彈性膜，作為物理屏障減少脂質(zhì)和水相中氧化劑的相互作用[24]。因此，TSPC中魚蛋白組分的存在有利于保護(hù)DHA藻油，提高其氧化穩(wěn)定性。魚類蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成豐富，近年來，由各種魚蛋白制備抗氧化活性成分及應(yīng)用的研究被廣泛報道[13]。

a-過氧化值；b-TBARS值圖3 TSPC-DHA藻油乳液貯藏過程中的變化Fig.3 Changes of TSPC-DHA algal oil emulsion during storage

2.4 乳液的微觀結(jié)構(gòu)分析

乳液的形成和穩(wěn)定直接受到油滴分布和顆粒大小的影響。將乳液的蛋白和油相分別用尼羅紅和尼羅藍(lán)染色，通過CLSM觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)并拍照，如圖4所示。由圖4可知，TPI乳液和TSPC2∶1乳液微觀圖中明顯存在不均勻的顆粒分布，蛋白分子間相互結(jié)合形成聚集體，且油滴周圍包裹了較厚的蛋白吸附層。結(jié)果與乳析指數(shù)和實物圖的變化趨勢一致，說明TPI乳液和TSPC2∶1乳液內(nèi)部的蛋白聚集體是引起乳液分層的主要原因。由于較大的蛋白聚集體不容易移動到油-水界面，引起蛋白質(zhì)的界面活性下降[8]，油滴間更容易相互聚集，導(dǎo)致乳液的物理穩(wěn)定性變差。同時，由于油滴周圍包裹了較厚的蛋白吸附層，可以作為天然的物理屏障減少DHA藻油和促氧化劑的相互作用[24]，進(jìn)而減緩了DHA藻油的氧化。隨著原料中大豆比例的增加，TSPC乳液的平均粒徑逐漸減小，蛋白聚集體和油滴逐漸分散。其中，TSPC1∶1和TSPC1∶2乳液油滴的分散程度接近SPI乳液，顆粒小且分布均勻，蛋白分子更容易擴(kuò)散到油水界面，可以有效阻止油滴之間的聚集，乳液的物理穩(wěn)定性更好，并且油滴周圍的蛋白吸附層較厚，減少了DHA藻油和環(huán)境中促氧化劑的相互作用。因此，TSPC乳液具有優(yōu)于TPI乳液的物理穩(wěn)定性和優(yōu)于SPI乳液的氧化穩(wěn)定性，其中TSPC1∶1和TSPC1∶2乳液的物理穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性更好。

圖4 TSPC-DHA藻油乳液的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.4 CLSM pictures of the TSPC-DHA algal oil emulsion

3 結(jié)論

為了探究羅非魚-大豆復(fù)合共沉淀蛋白乳化穩(wěn)定DHA藻油的可行性，比較了TPI、3種TSPC和SPI-DHA藻油乳液的物理穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性。結(jié)果表明，TSPC穩(wěn)定的DHA藻油乳液具有優(yōu)于TPI乳液的物理穩(wěn)定性和優(yōu)于SPI乳液的氧化穩(wěn)定性，且不同比例的共沉淀蛋白穩(wěn)定DHA藻油的效果不同。大豆蛋白組分的存在能增強(qiáng)TSPC乳液體系的分散性和電負(fù)性，乳液的平均粒徑減小，提高乳液的物理穩(wěn)定性；而魚蛋白組分的存在能夠減緩TSPC乳液體系中油脂的氧化速率，提高乳液的氧化穩(wěn)定性。當(dāng)羅非魚肉和大豆原料混合的比例為1∶1和1∶2時，TSPC1∶1和TSPC1∶2乳液平均粒徑小，體系分散均勻，4 ℃貯藏28 d無明顯分層，且貯藏期間體系的過氧化值接近TPI乳液，乳液的物理穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性較好。因此，羅非魚-大豆復(fù)合共沉淀蛋白具有優(yōu)于單一蛋白的特性，可用作良好的乳化劑穩(wěn)定DHA藻油，研究結(jié)果為共沉淀蛋白功能乳液的開發(fā)提供新的可能。