向鶴麟， 金曄， 袁倩， 姚冬明， 李婷， 于迪， 冷加燕， 林江， 錢(qián)軍,

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 1. 血液科， 2. 中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 3. 鎮(zhèn)江市血液病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一類(lèi)以造血干祖細(xì)胞異常增殖的惡性克隆性疾病，細(xì)胞遺傳學(xué)異常和分子改變已成為AML診斷分型的重要依據(jù)[1]。部分基因突變?nèi)绾肆椎鞍?1(NPM1)、FMS樣酪氨酸激酶3(FLT3)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CEBPA)等已被納入預(yù)后分層體系，其中NPM1突變因其克隆的穩(wěn)定性也逐漸成為NPM1突變陽(yáng)性的正常核型AML(CN-AML)微小殘留病(measurable residual disease，MRD)監(jiān)測(cè)的重要分子標(biāo)志[2]。RAS信號(hào)通路基因突變?nèi)鏔LT3、神經(jīng)母細(xì)胞瘤RAS病毒癌基因同源物(NRAS)、Kristen大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)等是驅(qū)動(dòng)髓系腫瘤的晚期事件，盡管目前沒(méi)有被視為MRD監(jiān)測(cè)的重要分子，但化療后獲得完全緩解時(shí)仍為陽(yáng)性的患者復(fù)發(fā)率更高、無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間更短[3]；此外，歐洲白血病網(wǎng)絡(luò)MRD工作組也建議將NRAS基因突變與其他分子標(biāo)志一起用于MRD監(jiān)測(cè)[4]。本研究旨在建立一種檢測(cè)NRAS突變的新型drop-off微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技術(shù)，并初步探討其在AML患者中的應(yīng)用價(jià)值，以期應(yīng)用于臨床樣本檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣本選擇

回顧性檢測(cè)2010年1月至2018年9月就診于江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科且根據(jù)當(dāng)時(shí)FAB、WHO診斷分型標(biāo)準(zhǔn)確診為AML患者(非M3)的骨髓血來(lái)源的DNA樣本，其中男77例，女63例，中位年齡57.5歲。樣本納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡不小于18歲；初診時(shí)未經(jīng)過(guò)化療診治的骨髓血樣本；具有完整的病例信息；簽署過(guò)知情同意書(shū)的患者。不符合上述標(biāo)準(zhǔn)的患者被排除在研究之外。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審查審批件號(hào)：K-20180063-Y)。

1.2 分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞以及提取DNA

初診AML患者就診時(shí)抽取骨髓血，EDTA管抗凝，使用中國(guó)TBD Science公司生產(chǎn)的Ficoll分離液，提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞。DNA提取采用美國(guó)Thermo Fisher公司生產(chǎn)的Trizol分離試劑完成。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上目標(biāo)基因序列(Gene ID：4893)，使用Primer 3設(shè)計(jì)針對(duì)NRASG12/G13突變位點(diǎn)的上游引物：5′-TTGCTGGTGTGAAATGACT-3′；下游引物：5′-ATGGTGGGATCATATTCATCT-3′；針對(duì)NRASG12/G13突變位點(diǎn)序列的野生型探針：5′-FAM-CCAACACCACCTGCTCCAAC-BHQ1-3′，突變位點(diǎn)外序列的野生型探針：5′-VIC-TTGGGAAAAGCGCACTGA-BHQ1-3′。引物和探針由上海華大基因有限公司合成。

1.4 drop-off ddPCR反應(yīng)體系配置

反應(yīng)體系含3.5 μL 10×dPCR反應(yīng)緩沖液、1 μL dPCR酶、0.7 μL上下游引物、1 μLNRAS突變位點(diǎn)序列野生型探針、1 μLNRAS突變位點(diǎn)外序列野生型探針和5 μL待測(cè)DNA模板，去離子水補(bǔ)足體積至35 μL，反應(yīng)試劑由江蘇圣極基因科技有限公司提供。使用BioDigital Loader S100樣本處理系統(tǒng)，制備裝有微滴的芯片，將芯片置于Cycler S100 PCR擴(kuò)增儀芯片槽內(nèi)，進(jìn)行如下反應(yīng)：50 ℃ 10 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，62 ℃ 40 s共45個(gè)循環(huán)，25 ℃保持。取出芯片移至Imager S100生物芯片閱讀儀上，通過(guò)檢測(cè)FAM和VIC信號(hào)進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)算該基因突變頻率。突變頻率=[1-突變位點(diǎn)序列野生探針?biāo)鶞y(cè)拷貝數(shù)(即FAM通道所示拷貝數(shù))/突變位點(diǎn)外序列野生探針?biāo)鶞y(cè)拷貝數(shù)(即VIC通道所示拷貝數(shù))]×100%。數(shù)字PCR反應(yīng)試劑盒和芯片由江蘇圣極基因科技有限公司生產(chǎn)。數(shù)字PCR反應(yīng)儀器由上海小海龜科技有限公司提供。

1.5 空白檢測(cè)限和最低檢測(cè)下限的建立

根據(jù)NCCLS-EP-17A指南，重復(fù)檢查空白樣本和極低濃度樣本，計(jì)算出該方法的空白限及最低檢測(cè)下限，并根據(jù)CNAS-GL039《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證[5-6]。檢測(cè)的空白樣本為該基因突變陰性的臨床樣本，低濃度樣本為在野生樣本的背景下，加入已知的突變樣本。為提高芯片的利用率以及結(jié)果的準(zhǔn)確性，將所有檢測(cè)臨床樣本通過(guò)DNA比色儀定量在50 ng/μL(VIC通道信號(hào)檢測(cè)的拷貝數(shù)約為10 000)。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

每個(gè)樣本均進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)3次，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果并計(jì)算變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)Spearman檢驗(yàn)對(duì)理論突變負(fù)荷與實(shí)測(cè)突變負(fù)荷進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 drop-off ddPCR檢測(cè)NRAS基因突變的方法學(xué)建立

2.1.1 特異性及準(zhǔn)確性的驗(yàn)證 特異性驗(yàn)證：使用drop-off ddPCR重復(fù)檢測(cè)野生型質(zhì)粒(5次/d，檢測(cè)2 d)，F(xiàn)AM和HEX通道為陽(yáng)性，且各通道的拷貝數(shù)基本一致，特異性驗(yàn)證通過(guò)。準(zhǔn)確性驗(yàn)證：使用drop-off ddPCR對(duì)突變型質(zhì)粒進(jìn)行多次反復(fù)檢測(cè)(5次/d，檢測(cè)2 d)，F(xiàn)AM通道為陰性，而HEX通道為陽(yáng)性；對(duì)雜合性質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)AM和HEX通道為陽(yáng)性，計(jì)算突變頻率與雜合性質(zhì)粒突變比例一致，即準(zhǔn)確性驗(yàn)證通過(guò)。

2.1.2 線(xiàn)性及檢測(cè)限的驗(yàn)證 通過(guò)對(duì)陰性樣本、低濃度突變樣本分別進(jìn)行36次重復(fù)檢測(cè)，CV<5%，計(jì)算出該方法的空白限為5.40拷貝數(shù)/μL，最低檢測(cè)下限為15.84拷貝數(shù)/μL。在已知突變頻率的突變型樣本中加入野生型樣本，將突變頻率進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e將突變樣本梯度稀釋成含25.00%，5.00%，1.00%，0.20%，0.04%的NRAS突變，應(yīng)用drop-off ddPCR對(duì)稀釋后的不同突變頻率的樣本進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次，取每次實(shí)測(cè)的平均值，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。理論稀釋后的突變頻率與實(shí)測(cè)突變頻率的平均值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(R2=0.999，P<0.001)，見(jiàn)圖2。對(duì)突變頻率在0.2%以上的樣本能夠很好地檢出。制備16拷貝數(shù)/μL的樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，分2 d，10次/d，20次均能檢出陽(yáng)性，檢測(cè)陽(yáng)性率為100%，且CV<5%，故drop-off ddPCR檢測(cè)NRAS突變檢出限驗(yàn)證通過(guò)，且對(duì)16拷貝數(shù)/μL以上濃度的樣本檢測(cè)的線(xiàn)性及重復(fù)性良好。

圖1 drop-off ddPCR檢測(cè)不同濃度梯度NRAS基因突變圖

圖2 不同濃度梯度的NRAS基因突變理論與實(shí)測(cè)值之間的相關(guān)性分析

2.2 應(yīng)用drop-off ddPCR檢測(cè)臨床樣本

對(duì)既往已行Sanger測(cè)序檢測(cè)140例初診AML患者DNA樣本進(jìn)行drop-off ddPCR檢測(cè)，檢測(cè)出NRAS基因突變的患者共28例(20%)，其中Sanger測(cè)序僅檢出7例(5%)陽(yáng)性(表1)，2例既往也有二代測(cè)序(NGS)結(jié)果證實(shí)存在NRAS基因突變，該7例標(biāo)本ddPCR檢測(cè)NRAS突變頻率為21.69%～52.85%(中位突變頻率為42.20%)；Sanger測(cè)序陰性的21例標(biāo)本drop-off ddPCR檢測(cè)NRAS突變頻率為0.26%～9.64%(中位突變?yōu)?.46%)。Drop-off ddPCR與Sanger測(cè)序法檢測(cè)NRAS基因突變結(jié)果的陰性符合率為100%，陽(yáng)性符合率為25%，總體符合率為85%。為了驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，將該21例樣本進(jìn)行NRAS基因二代測(cè)序，結(jié)果揭示14例樣本中存在陽(yáng)性突變(突變頻率1.03%～9.50%，中位突變頻率4.35%；測(cè)序深度179X-3708X，中位測(cè)序深度674X)，其中6例G12S(c.34G>A)、1例G12C(c.34G>T)、1例G12D(c.35G>A)、1例G12V(c.35G>T)、3例G13V(c.38G>T)、2例G13D(c.38G>T)；該14例患者drop-off ddPCR檢測(cè)突變頻率為0.26%～9.64%(中位突變頻率為2.82%)，將所有二代測(cè)序檢測(cè)的突變頻率與drop-off ddPCR檢測(cè)突變頻率進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3所示。7例樣本NGS未檢出突變(表2)，而drop-off ddPCR檢測(cè)突變頻率為0.53%～1.50%(中位1.10%)，見(jiàn)圖4。

表1 drop-off ddPCR和Sanger測(cè)序檢出NRAS基因突變的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表2 drop-off ddPCR和二代測(cè)序檢測(cè)NRAS基因突變的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖3 二代測(cè)序檢測(cè)的突變頻率與drop-off ddPCR檢測(cè)突變頻率進(jìn)行相關(guān)性分析

圖4 drop-off ddPCR檢出NRAS突變陽(yáng)性而二代測(cè)序結(jié)果陰性的示意圖

3 討論

RAS蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成等信號(hào)傳導(dǎo)通路中起重要調(diào)控作用。在血液系統(tǒng)腫瘤中，NRAS突變可高達(dá)10%～30%，其基因突變位點(diǎn)多發(fā)生在第12/13/61密碼子[7]。目前臨床上關(guān)于AML相關(guān)基因突變的檢測(cè)主要采取二代測(cè)序技術(shù)和PCR技術(shù)[8-9]。二代測(cè)序技術(shù)通量性高，可用于全基因組測(cè)序，但由于其技術(shù)性較強(qiáng)，費(fèi)用昂貴，耗時(shí)較長(zhǎng)，現(xiàn)階段難以用于單個(gè)基因突變的篩選以及后續(xù)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，同時(shí)現(xiàn)有的二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)基因突變的靈敏度有限、在通常的測(cè)序深度下僅為1%～3%。對(duì)于超低頻突變可能需要采用更加深度的測(cè)序，目前低于1%的基因突變檢測(cè)在臨床上沒(méi)有廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)有的ddPCR技術(shù)是一種強(qiáng)大的基因檢測(cè)技術(shù)，可以用于低頻突變的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，能夠?qū)崿F(xiàn)絕對(duì)定量，但常規(guī)ddPCR僅可對(duì)已知突變進(jìn)行檢測(cè)，并且對(duì)不同類(lèi)型突變的檢測(cè)較為煩瑣，需根據(jù)不同的突變類(lèi)型設(shè)計(jì)特異性的探針，不能用于未知突變的檢測(cè)[10-11]。而本研究建立的drop-off ddPCR能夠?qū)RAS基因G12/G13位點(diǎn)突變區(qū)域存在的不同突變類(lèi)型進(jìn)行篩選，利用一條位于突變位點(diǎn)的野生型探針和一條位于突變位點(diǎn)外的野生型探針，即可檢測(cè)出該熱點(diǎn)突變區(qū)域存在插入、缺失、替換等突變，可用于對(duì)初診AML患者存在NRAS基因G12/G13突變進(jìn)行初篩。

本研究建立了drop-off ddPCR檢測(cè)NRAS基因突變的方法，評(píng)價(jià)了該方法的準(zhǔn)確性、特異性、靈敏度和可重復(fù)性，并對(duì)該方法的檢測(cè)限進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒以及雜合型質(zhì)粒進(jìn)行反復(fù)多次檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性和特異性。通過(guò)野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒進(jìn)行線(xiàn)性關(guān)系構(gòu)建，用臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次，其線(xiàn)性結(jié)果良好(R2=0.999，P<0.001)。本研究建立的drop-off ddPCR檢測(cè)初診AML患者NRAS基因不同類(lèi)型突變的特異性強(qiáng)，其臨床樣本檢測(cè)的空白限為5.40拷貝數(shù)/μL，突變頻率占總拷貝數(shù)的0.054%，最低檢測(cè)下限為15.84拷貝數(shù)/μL，突變頻率占總拷貝數(shù)的0.158%。對(duì)該檢出限進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)陽(yáng)性率為100%。該檢出限的建立，有助于對(duì)初診AML患者NRAS基因G12/G13位點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，為提供個(gè)體化治療方案提供思路[12-13]。

建立drop-off ddPCR對(duì)NRAS基因熱點(diǎn)突變區(qū)域可能出現(xiàn)的不同突變類(lèi)型進(jìn)行初篩，應(yīng)用該技術(shù)對(duì)140例連續(xù)性初診AML患者(除外急性早幼粒細(xì)胞白血病)進(jìn)行初篩，檢測(cè)出28例NRAS基因突變的陽(yáng)性樣本，檢出率(20%)明顯高于Sanger測(cè)序(5%)。應(yīng)用NGS對(duì)這21例Sanger陰性、drop-off ddPCR陽(yáng)性的樣本進(jìn)行驗(yàn)證，NGS在21例樣本中檢出NRAS突變基因?yàn)?4例，NGS陽(yáng)性標(biāo)本drop-off ddPCR也均檢出，二者檢出的突變頻率具有良好的相關(guān)性。該結(jié)果證實(shí)drop-off ddPCR敏感性明顯優(yōu)于Sanger測(cè)序和NGS，NGS在AML群體中的漏檢率達(dá)5%(7/140)?？梢灾庇^(guān)地從drop-off ddPCR檢出NRAS突變陽(yáng)性而NGS結(jié)果陰性的示意圖中看到明顯的突變液滴聚團(tuán)，drop-off ddPCR檢測(cè)出突變頻率為0.53%～1.50%(中位1.10%)，這可能是在常規(guī)測(cè)序深度下，NGS靈敏度只有1%～3%，導(dǎo)致該7例低頻突變未檢出。對(duì)于不同類(lèi)型的堿基突變，drop-off ddPCR能夠更快更高效地進(jìn)行初篩，同時(shí)該方法有助于對(duì)單個(gè)基因突變及時(shí)監(jiān)測(cè)。

綜上，本研究建立了drop-off ddPCR檢測(cè)AML患者NRAS基因突變的方法，該方法具有良好的靈敏度和可重復(fù)性，可用于對(duì)初診AML患者NRAS基因突變的篩選及預(yù)后判斷，并且有潛在的可能與其他分子標(biāo)志聯(lián)合應(yīng)用于MRD監(jiān)測(cè)。

本研究也有一定的局限性：首先，本研究屬于回顧性研究，在樣本的選擇上有一定的限制，導(dǎo)致后期對(duì)樣本的隨訪(fǎng)不全；其次，NGS技術(shù)對(duì)于臨床樣本的檢出下限在正常測(cè)序深度上為1%～3%，而drop-off ddPCR的靈敏度可達(dá)到0.16%，但由于兩種技術(shù)之間的檢測(cè)突變頻率的方法以及計(jì)數(shù)的差異，對(duì)于低頻突變無(wú)法進(jìn)行更深層次的驗(yàn)證，而且這種低頻突變所導(dǎo)致的亞克隆型白血病細(xì)胞群體以及該基因突變能否與NPM1等基因聯(lián)合監(jiān)測(cè)MRD有待進(jìn)一步研究。