萬春云，肖草茂，李玉云

1.江西省醫(yī)療器械檢測中心，江西 南昌 330000；2.南昌醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 南昌 330000

祛風(fēng)消痛噴霧劑是由獨(dú)活、羌活、細(xì)辛、三七、紅花等13 味藥材組成的一種外用制劑，具有祛風(fēng)除濕，通血活絡(luò)之功效。方中獨(dú)活性溫，入腎經(jīng)，可散里之伏風(fēng)，祛濕止痛，善行祛腰膝筋骨間風(fēng)寒濕邪所致的下焦之病癥，為君藥，其主要成分為蛇床子素［1］。羌活辛溫之品，具有祛風(fēng)消腫止痛等功效，為臣藥，研究表明，其發(fā)揮藥效的有效成分是紫花前胡苷［2］。羌活、獨(dú)活相須為用，祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛力強(qiáng)，故有“羌活善治在上在表之游風(fēng)，獨(dú)活善治在下在里之伏風(fēng)”之說。細(xì)辛味辛性溫，具有解表散寒，祛風(fēng)止痛等作用，為臣藥，其主要成分是細(xì)辛脂素［1］。三七味甘性溫，具有散瘀止血，消腫定痛等功效，人參皂苷Rg1 為其主要成分之一［1］。紅花為活血行氣之品，使氣血運(yùn)行通暢，達(dá)到活血通經(jīng)散瘀之效，紅花與三七同為佐藥。羥基紅花黃色素A 是其主要成分之一［1］。為更好地開發(fā)與推廣該方劑，本研究以獨(dú)活、羌活、細(xì)辛、三七、紅花的有效成分轉(zhuǎn)移率以及得膏率為評價指標(biāo)，應(yīng)用層次分析法確立權(quán)重系數(shù)，采用L9（34）正交試驗優(yōu)選祛風(fēng)消痛噴霧劑的乙醇提取工藝，為祛風(fēng)消痛噴霧劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LD-20AD 高效液相色譜儀（Shimadzu），ME5超微量電子天平（Sartorius），BT25S 電子天平（Sartorius）。

1.2 試藥

蛇床子素對照品（批號110822-201710），紫花前胡苷對照品（批號111821-201604），細(xì)辛脂素對照品（批號111889-201705），人參皂苷Rg1對照品（批號110703-201933），羥基紅花黃色素A 對照品（批號111637-201810），以上對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。獨(dú)活藥材飲片、羌活藥材飲片、細(xì)辛藥材飲片、紅花藥材飲片、三七藥材飲片均購自江西致和堂中藥飲片有限公司，由江西省醫(yī)療器械檢測中心李玉云研究員鑒定，均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 祛風(fēng)消痛噴霧劑各有效成分含量測定色譜條件及得膏率的測定方法

2.1.1 供試品的制備獨(dú)活、三七粉碎成最粗粉，備用；羌活、細(xì)辛、紅花直接采用飲片，備用。

2.1.2 蛇床子素含量測定色譜條件色譜柱為Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（49∶51）；檢測波長為330 nm；柱溫25 ℃。

2.1.3 紫花前胡苷含量測定色譜條件［3］色譜柱為Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（40∶60），檢測波長為334 nm，柱溫為25 ℃。

2.1.4 細(xì)辛脂素含量測定色譜條件色譜柱為Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～20 min，50% A；20～26 min，50%→100% A）；檢測波長為287 nm；柱溫40 ℃。

2.1.5 人參皂苷Rg1 含量測定色譜條件色譜柱為Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～12 min，19% A；12～60 min，19%→36% A）；檢測波長為203 nm；柱溫25 ℃。

2.1.6 羥基紅花黃色素A 含量測定色譜條件色譜柱為Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；檢測波長為403 nm；柱溫25 ℃。

2.1.7 得膏率的測定精密量取各試驗項下醇提液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，置105 ℃干燥箱中干燥至恒重，取出置干燥器內(nèi)冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量。計算浸膏得率。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度考察按處方量稱取獨(dú)活、三七最粗粉，羌活、細(xì)辛、紅花飲片4 份，分別加入不同濃度乙醇，8 倍溶劑量加熱提取2 次，每次2 h，溶劑回收定容至100 mL。測定各乙醇濃度項下各藥材有效成分的含量，并計算出各有效成分轉(zhuǎn)移率及得膏率，結(jié)果見表1。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇70%乙醇濃度進(jìn)行后續(xù)考察。

表1 不同乙醇濃度各有效成分轉(zhuǎn)移率及得膏率 %

2.2.2 料液比考察按處方量稱取獨(dú)活、三七最粗粉，羌活、細(xì)辛、紅花飲片4 份，分別加入不同料液比的70%乙醇溶液為，加熱提取2 次，每次2 h，溶劑回收定容至100 mL。測定各提取體積項下各藥材有效成分的含量，并計算出各有效成分轉(zhuǎn)移率及得膏率，結(jié)果見表2。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇10 倍體積提取溶劑進(jìn)行后續(xù)考察。

表2 不同料液比各有效成分轉(zhuǎn)移率及得膏率 %

2.2.3 提取時間考察按處方量稱取獨(dú)活、三七最粗粉，羌活、細(xì)辛、紅花飲片4 份，加入10 倍體積的70%乙醇溶液，加熱提取2 次，分別提取1 h、2 h、3 h、4 h，溶劑回收定容至100 mL。測定各提取時間項下各藥材有效成分的含量，并計算出各有效成分轉(zhuǎn)移率及得膏率，結(jié)果見表3。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇每次提取2 h 進(jìn)行后續(xù)考察。

表3 不同提取時間各有效成分轉(zhuǎn)移率及得膏率

2.2.4 提取次數(shù)考察按處方量稱取獨(dú)活、三七最粗粉，羌活、細(xì)辛、紅花飲片3 份，加入10 倍體積的70%乙醇溶液，加熱提取2 h，分別提取1 次、2 次、3 次。溶劑回收定容至100 mL。測定各提取次數(shù)項下各藥材有效成分的含量，并計算出各有效成分轉(zhuǎn)移率及得膏率，結(jié)果見表4。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇提取2 次進(jìn)行后續(xù)考察。

表4 不同提取次數(shù)各有效成分轉(zhuǎn)移率及得膏率 %

2.3 層次分析法確定綜合評分權(quán)重系數(shù)

層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）是一種通過兩兩比較來判斷各目標(biāo)優(yōu)先次序的矩陣，將人為賦分結(jié)果和客觀驗證結(jié)果有效地結(jié)合起來的方法［4］?；谥兴帍?fù)方的君臣佐使配伍關(guān)系及各起效成分配伍強(qiáng)弱，確定各成分的優(yōu)先順序：獨(dú)活>羌活=細(xì)辛>三七=紅花>得膏率，以獨(dú)活、羌活、三七、細(xì)辛、紅花的主要有效成分含量及得膏率為測定指標(biāo)進(jìn)行評價，計算各綜合評分，構(gòu)建成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，賦予各項指標(biāo)間的相對評分，見表5。

表5 6項目標(biāo)成對比較判斷優(yōu)先矩陣 分

在各項指標(biāo)兩兩比較判斷矩陣中，各藥材的有效成分相對得膏率重要得多，因為它是發(fā)揮臨床藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。在處方中獨(dú)活為君藥，羌活與細(xì)辛為臣藥，紅花和三七為佐藥，獨(dú)活有效成分蛇床子素相對羌活有效成分紫花前胡苷及細(xì)辛有效成分細(xì)辛脂素重要，記2 分，相對紅花有效成分羥基紅花黃色素A 及三七有效成分人參皂苷Rg1更重要，記3 分，相對得膏率記4 分，其余以此類推。

式中，RI為判斷矩陣的平均隨機(jī)一致性指標(biāo)，查找相應(yīng)的平均隨機(jī)一致性指標(biāo)，當(dāng)矩陣階數(shù)為6時，RI＝1.24［6］。

由計算結(jié)果可知，蛇床子素的權(quán)重系數(shù)為0.342 9、細(xì)辛脂素、紫花前胡苷的權(quán)重系數(shù)為0.171 4、羥基紅花黃色素A、人參皂苷Rg1的權(quán)重系數(shù)為0.114 3，得膏率的權(quán)重系數(shù)為0.085 7。其中，CR作為衡量所得權(quán)重系數(shù)是否合理的指標(biāo)，由表6 可知，CR<0.1，即認(rèn)為判斷矩陣具有滿意的一致性，說明所求得的權(quán)重系數(shù)合理有效，它可用在下一步祛風(fēng)消痛噴霧劑提取工藝優(yōu)選的綜合評分中。

表6 指標(biāo)性成分權(quán)重系數(shù)及一致性檢驗

2.4 提取工藝優(yōu)選

根據(jù)對上述單因素考察結(jié)果的分析，以影響醇提工藝主要因素乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，以各藥材有效成分轉(zhuǎn)移率及得膏率的總得分為評價指標(biāo)，通過4 因素3 水平的正交試驗L9（34）進(jìn)一步研究提取最佳條件。正交因素水平表見表7。按設(shè)計的正交試驗表進(jìn)行試驗，測定各藥材有效成分的轉(zhuǎn)移率及得膏率，并根據(jù)“2.3”項下基于AHP 確立的Wi分別計算出各正交試驗的總得分，總得分（M）=0.342 9×蛇床子素轉(zhuǎn)移率+0.171 4×細(xì)辛脂素轉(zhuǎn)移率+0.171 4×紫花前胡苷轉(zhuǎn)移率+0.114 3×羥基紅花黃色素A 轉(zhuǎn)移率+0.114 3×人參皂苷Rg1轉(zhuǎn)移率+0.085 7×得膏率，正交試驗結(jié)果見表8。

表7 L9（34）正交試驗因素水平表

表8 正交試驗各成分轉(zhuǎn)移率及綜合評分結(jié)果

對上述正交實驗結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，最佳提取工藝為A2B2C2D3，料液比（R 值最?。┳鳛榉讲罘治稣`差項，結(jié)果顯示，各因素影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表9。

表9 正交試驗的方差分析

2.5 驗證試驗

為驗證祛風(fēng)消痛噴霧劑提取工藝的穩(wěn)定性，對優(yōu)選出的提取條件A2B2C2D3 進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果顯示，3 組驗證實驗總得分的RSD 為2.33%，表明該提取工藝穩(wěn)定可靠，可用于工業(yè)生產(chǎn)。結(jié)果見表10。

表10 工藝驗證試驗轉(zhuǎn)移率和綜合評分結(jié)果

3 討論

三七屬于貴重藥材，其質(zhì)堅硬，不粉碎難以提取有效成分，因此在單因素考察過程中采用最粗粉，但提取轉(zhuǎn)移率未達(dá)到80%以上，后續(xù)特對三七粉碎粒度進(jìn)行了考察。參照上述醇提因素，以三七最粗粉、粗粉、中粉粒度考察，檢測其人參皂苷Rg1，結(jié)果表明三種粉碎粒度轉(zhuǎn)移率基本接近，三七粉碎度對提取轉(zhuǎn)移率無明顯影響，因此，在本處方提取過程中，選用三七最粗粉即可。羌活中異歐前胡素加熱提取后，含量明顯下降，是因為異歐前胡素在加熱回流過程中，在酸性條件下發(fā)生了麥?zhǔn)现嘏?，轉(zhuǎn)變了結(jié)構(gòu)接近的其他香豆素類成分［7］，經(jīng)過查閱文獻(xiàn)，紫花前胡苷為香豆素成分，具有鎮(zhèn)痛作用，因此提取工藝中采用紫花前胡苷轉(zhuǎn)移率作為指標(biāo)成分之一。

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以提取影響較大的四個因素乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)進(jìn)行正交試驗考察，根據(jù)該制劑的特點(diǎn)及臨床療效，以祛風(fēng)消痛噴霧劑處方中的獨(dú)活、羌活、細(xì)辛、三七、紅花的主要有效成分含量及得膏率為評價指標(biāo)，結(jié)合該方中君臣佐使配伍關(guān)系，根據(jù)各藥材間的重要性差異確定其有效成分的權(quán)重系數(shù)，采用正交試驗結(jié)合層次分析法，對祛風(fēng)消痛噴霧劑的提取條件進(jìn)行了研究，確定最佳提取條件，即加入10 倍體積的70%乙醇提取，提取3 次，每次1.5 h，提高了處方中各藥材有效成分的含量，并就此工藝參數(shù)進(jìn)行了試驗驗證，結(jié)果表明基于AHP 確立的提取工藝穩(wěn)定、可靠，有效成分提取完全，應(yīng)用層次評分法進(jìn)行評價，更客觀、科學(xué)地評價祛風(fēng)消痛噴霧劑的提取工藝。需要特別指出的是，乙醇提取之后細(xì)辛脂素轉(zhuǎn)移率超過100%，是由于在加熱回流過程中，甲基丁香酚等有毒成分有可能轉(zhuǎn)換成細(xì)辛脂素，且有研究報道，加熱時間越長，越有助于細(xì)辛脂素的溶出［8-9］，因此細(xì)辛久煎后細(xì)辛脂素含量顯著增大。