凌曉寧，鄢陸琪，張 榮，章啟慧，李昆太，*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】柑橘類水果風(fēng)味獨(dú)特，果實(shí)含有大量維生素C、類胡蘿卜素、果膠等生物活性物質(zhì)，深受消費(fèi)者的喜愛[1]。由于柑橘營養(yǎng)成分豐富，在柑橘采摘、運(yùn)輸及儲存過程中，容易受到病原體的感染，其中由指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的綠霉病是采后柑橘最具破壞性的病害，占柑橘儲藏過程因真菌性病害造成腐爛損失的60%～80%[2]。目前，對于柑橘綠霉病的防治主要采用化學(xué)殺菌劑如抑霉唑、噻苯咪唑、咪鮮胺等，但這些化學(xué)農(nóng)藥的過渡使用往往容易導(dǎo)致病原真菌的耐藥性，且對人體健康存在一定的風(fēng)險，因此尋求綠色安全可靠的生物防治方法成為了研究者們的關(guān)注熱點(diǎn)[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對柑橘綠霉病的生物防治方法主要包括使用植物提取物[4]、抗菌肽[5]及拮抗微生物[6]等，其中以使用拮抗微生物的方法研究最多。開展柑橘綠霉病微生物防治的首要工作是獲得對病原真菌具有拮抗活性且能適應(yīng)柑橘貯藏運(yùn)輸環(huán)境的拮抗微生物。近年來，已從陸地環(huán)境如根際土壤[7-9]、柑橘果實(shí)和葉片[10]等處分離出大量拮抗柑橘綠霉病菌的微生物，主要為細(xì)菌、酵母菌和放線菌。由于對陸地資源進(jìn)行了廣泛的微生物篩選和研究，發(fā)現(xiàn)新的微生物變得越來越困難[11]。海洋蘊(yùn)含著豐富的微生物資源，海洋微生物生活在高鹽、低溫、無光照、寡營養(yǎng)等極端環(huán)境中，這些環(huán)境決定了其與陸地微生物生長代謝的差別，使得其具有產(chǎn)生獨(dú)特生物活性化合物的潛力[12]。過去的幾十年間，海洋微生物已被證實(shí)是生物活性化合物的重要來源，其代謝產(chǎn)物具有多種藥理活性，包括抗癌、抗菌、抗腫瘤等，被喻為生產(chǎn)天然產(chǎn)物的微生物工廠[13]。利用海洋微生物防治柑橘綠霉病的報道較少，目前的研究主要集中在海洋放線菌。鹿連明等[14]分離到一株對柑橘青霉病菌（P.italicum）、綠霉病菌（P.digitatum）具有強(qiáng)抑制作用的海洋放線菌米修鏈霉菌A3202（Streptomyces misionensisA3202），Hu 等[15]分離到一株海洋來源的鏈霉菌Streptomyces chumphonensisAM-4，其發(fā)酵液對指狀青霉（P.digitatum）和意大利青霉（P.italicum）的菌絲生長抑制率分別為66.23%和61.42%。而對于海洋細(xì)菌、真菌防治柑橘綠霉病仍缺乏相關(guān)研究。

【本研究切入點(diǎn)】目前，對于柑橘綠霉病菌具有拮抗作用的菌株大多篩選自陸地環(huán)境，鮮有從海洋環(huán)境中篩選拮抗菌株的報道。海洋與大陸有較大的環(huán)境差別，其微生物與陸地微生物相比具有不同的特征[16]，因此從海洋中有望篩選到產(chǎn)特殊抑菌活性物質(zhì)的拮抗菌株。【擬解決的關(guān)鍵問題】篩選對指狀青霉具有拮抗作用的海洋來源微生物，并探討篩選獲得的菌株對高鹽的耐受性及其所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性，以期為柑橘綠霉病的生物防治提供菌種資源，為微生物拮抗劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源 樣 品采自廣 東 省湛江市5 個海底 淤 泥（20°33′08.42467″N，109°36′51.68500″E；20°33′01.52869″N，109°37′09.79277″E；20°33′04.97675″N，109°37′00.73894″E；20°31′52.78761″N，109°38′13.75760″E；20°29′09.04517″N，109°38′26.98106″E），保存于4 ℃冰箱。

1.1.2 供試菌株 指狀青霉（Penicillium digitatum），保存于江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 主要培養(yǎng)基 改良LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，MgCl22.1 g，MgSO44.2 g，KCl 0.9 g，CaCl21.2 g，NaCl 36.5 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，其中固體培養(yǎng)基添加20 g 瓊脂，121 ℃滅菌20 min；高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、FeSO40.01 g、MgCl22.1 g，MgSO44.7 g，KCl 0.9 g，CaCl21.2 g，NaCl 30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min；PDA 培養(yǎng)基：去皮土豆（八層紗布過濾）200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，pH 自然，其中固體培養(yǎng)基添加瓊脂20 g，121 ℃滅菌20 min；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，蔗糖30 g，蛋白胨20 g，硫酸銨2 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂 1 g，硫酸錳 0.01 g，硫酸鋅0.01 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌30 min。

1.1.4 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，生工生物工程（上海）有限公司；丙三醇，西隴科學(xué)；胃蛋白1∶10 000，胰蛋白酶1∶250，蛋白酶K，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.5 主要儀器 顯微鏡ECLIPSE Ni（日本尼康），掃描電子顯微鏡QUANTA 250（美國FEI 公司），立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KBS（上海申安醫(yī)療器械廠），高速冷凍離心機(jī)JW-2019HR（安徽嘉文儀器裝備有限公司），PCR 儀T-100（美國Bio-rad 公司），電泳儀DYCP-31DN（北京六一生物科技有限公司），三孔電熱恒溫水槽DK-8D（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），生化培養(yǎng)箱LRH-250A（韶關(guān)泰宏君儀器有限公司），紫外可見分光光度計(jì)GENESYS 50（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海洋微生物的分離篩選 稱取10 g 海泥，加入裝有90 mL 無菌水（帶玻璃珠）的三角瓶中，混合均勻梯度稀釋到10-4。吸取10-3、10-4稀釋液分別涂布在改良LB、高氏一號培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)并計(jì)數(shù)。挑取單菌落進(jìn)行劃線純化3次，將純化的單菌落接種到改良LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所得菌液加入到含25%甘油的凍存管中于-80 ℃保存。

1.2.2 指狀青霉孢子懸液的制備 取指狀青霉斜面，使用20 mL 無菌水倒入斜面刮下孢子，制備成孢子懸液，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為1×108spores/mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 拮抗菌的初篩 采用平板對峙法，將篩選獲得的海洋細(xì)菌分別接種于裝有50 mL 改良LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，于30 ℃、160 r/min 活化12 h，分別取菌液100 μL，涂布于改良LB 固體培養(yǎng)基中，獲得單菌落。將單菌落分別點(diǎn)接于含1%指狀青霉孢子懸液的PDA 培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察拮抗效果。

1.2.4 拮抗菌的復(fù)篩 將初篩獲得的具有拮抗指狀青霉效果的海洋細(xì)菌分別接種于裝有50 mL改良LB液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中于30 ℃、160 r/min 活化12 h，將活化后的菌液按2%的接種量（V/V）接種于裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，繼續(xù)于30 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液于10 000 r/min離心20 min，取發(fā)酵上清液于0.22 μm 濾頭過濾，即得無菌的發(fā)酵上清液（Cell-free supernatant，CFS），以不接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)液作為對照組（Control check，CK）。利用牛津杯法[17]檢測發(fā)酵上清液的抑菌效果，按1%的接種量（V/V）將指狀青霉孢子懸液接種至冷卻到50 ℃的PDA瓊脂培養(yǎng)基中，搖勻后倒平板，待平板凝固后，均勻放置牛津杯，加入CFS 200 μL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h至出現(xiàn)抑菌圈，使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，每株菌重復(fù)3次。

1.2.5 菌株HY 2-1的形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列分析 將保存的菌株劃線接種于改良LB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征。挑取平板中的單菌落，經(jīng)過革蘭氏染色后于光學(xué)顯微鏡觀察菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)。參考張文平等[18]的方法使用掃描電鏡對菌株進(jìn)行觀察。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[19]對菌株的部分生理生化進(jìn)行鑒定。

將菌株HY 2-1 斜面刮入裝有20 mL 無菌水（含玻璃珠）的三角瓶中，接入1 mL 于改良LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使用基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA模板，分別使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。體系為：模板5 μL，細(xì)菌通用引物27F、1492R 各取2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，無菌雙蒸水16 μL，總體積為50 μL。條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，退火55 ℃ 15 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)34 次；之后72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。將擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rDNA 測序。將測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選取比對后菌株的16S rDNA 序列，使用MEGA-X軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 菌株HY 2-1 對鹽的耐受性 配置氯化鈉質(zhì)量濃度分別為5，10，20，30，40，50，70，90，110，130，150，170，200 g/L 的發(fā)酵培養(yǎng)基，將菌株HY2-1 于改良LB 培養(yǎng)基活化12 h，活化的菌液按2%的接種量（V/V）接種于上述不同氯化鈉濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基（裝液量40 mL/250 mL）中，發(fā)酵48 h 后于600 nm 處測定各培養(yǎng)液吸光度，記錄OD值。

1.2.7 抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性檢測（1）熱穩(wěn)定性檢測。將CFS 分別分裝于5 個10 mL 離心管中，于40，60，80，100 ℃水浴30 min，第5個離心管于121 ℃高壓保持20 min，經(jīng)牛津杯擴(kuò)散法測試各處理的抑菌活性，以不處理的CFS為空白對照，每個處理重復(fù)3次，使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，下同。

（2）紫外照射穩(wěn)定性檢測。取CFS 20 mL 放入滅菌的平板中，打開蓋置于20 w 紫外燈下照射，分別于5，10，15，20，30，40，50 min 取樣裝入滅菌的離心管中，經(jīng)牛津杯擴(kuò)散法測試各處理的抑菌活性，以不處理的CFS為空白對照，每個處理重復(fù)3次。

（3）pH 穩(wěn)定性檢測。將CFS 分別分裝于6 個10 mL 離心管中，使用6 mol 的NaOH 和1 mol 的HCl 調(diào)節(jié)pH 至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，并于37 ℃水浴2 h，調(diào)至CFS 初始pH 值（6.25），經(jīng)牛津杯擴(kuò)散法測試各處理的抑菌活性，以不處理的CFS為空白對照，每個處理重復(fù)3次。

（4）酶處理檢測。將CFS分別分裝于4個10 mL 試管中，分別用胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K 處理，終質(zhì)量濃度為1 mg/ml，于37 ℃水浴鍋中水浴2 h，取出試管于沸水浴中滅活5 min，經(jīng)牛津杯擴(kuò)散法測試各處理的抑菌活性，以不加酶處理的CFS同樣處理為空白對照，每個處理重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用DPS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Duncans 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，使用Origin 2018對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘綠霉病拮抗菌株的初篩

從5 個海泥樣品中篩選出30 株菌落形態(tài)不一且呈明顯細(xì)菌特征的菌株，對30 株海洋細(xì)菌開展拮抗實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)編號為HY 2-1、HY 4-2、HY 8-4-1、HY 8-7 的4 株菌具有拮抗指狀青霉的能力，其拮抗效果如圖1 所示。選擇上述4株菌作為初篩菌株，用于進(jìn)一步的復(fù)篩。

圖1 拮抗指狀青霉海洋細(xì)菌的初篩Fig.1 Preliminary screening of antagonistic Marine bacteria against Penicillium digitatum

2.2 柑橘綠霉病拮抗菌株的復(fù)篩

對初篩獲得的4 株拮抗菌進(jìn)行牛津杯復(fù)篩，其對指狀青霉的抑菌結(jié)果如表1所示。由表1可知，4株拮抗菌的CFS 中僅有編號為HY 2-1 和HY 4-2 兩株菌對指狀青霉具有明顯的抑菌作用，編號為HY 8-4-2 和HY 8-7的菌株抑菌圈只有牛津杯直徑的大?。?.8 mm）。拮抗菌HY 2-1 抑菌圈直徑大于HY 4-2，且差異具有顯著性（P＜0.05），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇HY 2-1 作為出發(fā)菌株。HY 2-1菌株CFS對指狀青霉的抑菌作用如圖2所示。

圖2 HY 2-1菌株CFS對指狀青霉的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of CFS of strain HY 2-1 on Penicillium digitatum

表1 4株拮抗菌復(fù)篩結(jié)果Tab.1 Rescreening results of 4 antagonistic strains

2.3 柑橘綠霉病拮抗菌株HY 2-1的鑒定

2.3.1 菌株HY 2-1形態(tài)學(xué)觀察 拮抗菌HY2-1單菌落特征為：乳白色，表面光滑，菌落邊緣整齊，較濕潤，菌落直徑相對較?。▓D3a）；對該菌進(jìn)行革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡觀察，菌株為短桿狀，為革蘭氏陽性菌（圖3b）；由掃描電子顯微鏡觀察可知，該菌株邊緣整齊，呈典型的短桿狀（圖3c）。

圖3 菌株HY2-1的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of strain HY2-1

2.3.2 菌株HY 2-1生理生化特性菌株HY2-1 的部分生理生化鑒定結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，菌株HY2-1能夠利用葡萄糖、木糖、半乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇作為唯一碳源，吲哚實(shí)驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)呈陽性，能液化明膠，水解淀粉，還原硝酸鹽，V-P實(shí)驗(yàn)、脲酶和接觸酶實(shí)驗(yàn)為陰性，不能利用檸檬酸鹽。

表2 菌株HY 2-1的生理生化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strain HY 2-1

2.3.3 菌株HY 2-1 分子生物學(xué)鑒定 以細(xì)菌16S 通用引物27F 和1492R 為引物，菌株HY 2-1 基因組DNA 為模板，PCR擴(kuò)增電泳檢測結(jié)果如圖4。由圖4 可知，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測到條帶一有1 條單一的DNA 片段條帶，與DNA Marker相比較，PCR擴(kuò)增的DNA片段條帶在1 500 bp 附近，長度約1 500 bp 左右。

圖4 菌株HY 2-1基于16S通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of PCR amplification products of strain HY 2-1 based on 16S universal primer

將菌株HY 2-1的16S rDNA 序列，通過在線程序NCBI中的BLAST 與Genbank 中的其他保藏序列進(jìn)行比較，將比對結(jié)果使用MEGA X 軟件中的Neighbor-joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可知，菌株HY 2-1 與已公布的Bacillus amyloliquefaciens（GenBank 登錄號MN174660.1）聚為一簇，同源性為99.93%，確定菌株HY 2-1為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens），將其命名為解淀粉芽孢桿菌HY 2-1（B.amyloliquefaciensHY 2-1），其16S rDNA 序列已提交至NCBI，GenBank登錄號為MZ709015。

圖5 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株HY 2-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree of HY 2-1 strain based on 16S rDNA sequence

2.4 解淀粉芽孢桿菌HY 2-1對鹽的耐受性

由圖6可知，添加不同質(zhì)量濃度的氯化鈉對HY2-1的生長具有先促進(jìn)后抑制的作用。當(dāng)氯化鈉質(zhì)量濃度為5 g/L時，菌體含量達(dá)到最大值，與不添加氯化鈉相比，菌體含量顯著增加；繼續(xù)增加氯化鈉質(zhì)量濃度至10 和20 g/L，菌體含量開始呈下降的趨勢但始終高于不添加氯化鈉組，直至氯化鈉質(zhì)量濃度增加至30 g/L 時，菌體含量才開始小于不添加氯化鈉組；菌體在130 g/L氯化鈉質(zhì)量濃度下仍有一定的生長，而當(dāng)氯化鈉質(zhì)量濃度達(dá)到150 g/L 及以上時，菌體生長才完全被抑制。以上結(jié)果表明，海洋來源的HY2-1菌株具有良好的鹽耐受性，而且鹽質(zhì)量濃度在20 g/L范圍內(nèi)對菌體生長反而有明顯的促進(jìn)作用。

圖6 不同氯化鈉質(zhì)量濃度對B.amyloliquefaciens HY2-1生長的影響Fig.6 Effect of different sodium chloride concentrations on the growth of B.amyloliquefaciens HY2-1

2.5 解淀粉芽孢桿菌HY 2-1發(fā)酵上清液穩(wěn)定性

不同紫外照射時間、溫度、pH和酶處理對菌株HY 2-1發(fā)酵上清液穩(wěn)定性的影響如圖7所示。由圖7（a）可知，利用20 w 紫外燈照射5～60 min，菌株HY 2-1 的CFS 抑菌圈直徑呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，經(jīng)不同時間紫外照射的處理組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），表明菌株HY 2-1 的CFS 在短時間的紫外照射下穩(wěn)定性較好；由圖7（b）可知，隨著溫度的升高，CFS 的抑菌圈直徑呈現(xiàn)下降的趨勢，與對照組相比，40 ℃和60 ℃處理的CFS 抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05），80 ℃、100 ℃和121 ℃處理的CFS 抑菌圈直徑差異顯著（P＜0.05），且121 ℃處理的抑菌圈直徑與對照組相比減少了45.33%，表明菌株HY 2-1 的CFS 在60 ℃以上高溫處理下穩(wěn)定性較差，這可能是高溫破壞了菌株HY 2-1 的CFS 中抑菌活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)；由圖7（c）可知，與對照組相比，pH 在3～9 范圍內(nèi)CFS 的抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05），pH 大于11 時CFS 的抑菌圈直徑出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），這表明菌株HY 2-1的CFS在酸性及弱堿性條件下穩(wěn)定性較好，在強(qiáng)堿處理下穩(wěn)定性較差；由圖7（d）可知，與對照組相比，菌株HY 2-1的CFS經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K 處理后，抑菌圈直徑顯著降低（P＜0.05），且經(jīng)胃蛋白酶、蛋白酶K 處理后的CFS，其抑菌活性幾乎喪失，這表明菌株HY 2-1的CFS具有蛋白質(zhì)屬性，推測抑菌活性物質(zhì)中含有蛋白類物質(zhì)。

圖7 不同處理對B.amyloliquefaciens HY 2-1發(fā)酵上清液穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of different treatments on the stability of Cell-free supernatant of B.amyloliquefaciens HY 2-1

3 結(jié)論與討論

細(xì)菌是生防微生物的重要資源，其中解淀粉芽孢桿菌是目前生物防治研究較多的生防細(xì)菌。已有研究表明，解淀粉芽孢桿菌對馬鈴薯瘡痂病[20]、桃褐腐病[21]、水稻基腐病[22]等多種植物病害具有拮抗作用，具有廣譜抗真菌活性。解淀粉芽孢桿菌在拮抗柑橘綠霉病菌方面也有報道，呂捷等[23]從田間分離到一株B.amyloliquefaciensBs43，其菌懸液對指狀青霉的抑菌圈直徑達(dá)28 mm，Chen等[24]從柑橘根際土壤分離到一株B.amyloliquefaciensDH-4，其對指狀青霉的抑菌圈直徑高達(dá)（55.6±0.5）mm。在本研究中，篩選到一株對指狀青霉具有較好拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌HY 2-1（B.amyloliquefaciensHY 2-1），該菌分離自生境相對特殊的海洋環(huán)境，與分離自陸地的B.amyloliquefaciens相比，海洋微生物適應(yīng)了高鹽、寡營養(yǎng)等特殊生存環(huán)境，在抗逆性方面具有一定優(yōu)勢，由此產(chǎn)生的活性物質(zhì)往往具有耐受溫度、pH 范圍廣等特點(diǎn)，且該菌具有一定的耐鹽性，為適用于復(fù)雜的應(yīng)用場景提供了基礎(chǔ)。該菌的CFS對指狀青霉具有明顯的拮抗作用，其抑菌圈直徑達(dá)到（21.88±0.19）mm，從該菌對指狀青霉拮抗效果可知，海洋源微生物具備一定的應(yīng)用前景，不僅可以豐富柑橘綠霉病拮抗菌的來源，也可為生防制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

芽孢桿菌抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性易受外界條件的影響，陳超等[25]研究了解淀粉芽孢桿菌M9（B.amyloliquefaciensM9）發(fā)酵液穩(wěn)定性，其在40～100 ℃處理30 min抑菌活性不變，紫外穩(wěn)定性強(qiáng)，pH高于9或低于7 時抑菌活性明顯降低。李亮亮等[26]研究了解淀粉芽孢桿菌WS3-1（B.amyloliquefaciensWS3-1）發(fā)酵液中活性物質(zhì)的穩(wěn)定性，其活性物質(zhì)在溫度為40，60，80 ℃及pH 8～10條件下抑菌活性穩(wěn)定，抑菌率保持80%以上，同時具有較好的紫外線穩(wěn)定性。Alfonzo 等[27]研究了解淀粉芽孢桿菌AG1（B.amyloliquefaciensAG1）產(chǎn)生的抗真菌代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性，其在溫度為60～120 ℃，pH 2～10 條件下抑菌活性保持穩(wěn)定，且經(jīng)1 mg/mL 的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、蛋白酶K 等酶處理后，抑菌活性保持不變。通過對菌株HY 2-1 的CFS 穩(wěn)定性檢測，發(fā)現(xiàn)其在5～60 min 的紫外照射后，抑菌活性與對照相比無顯著變化，具有很強(qiáng)的紫外穩(wěn)定性；在80 ℃處理后抑菌活性才出現(xiàn)顯著下降但保持了83.86%的抑菌活性，具有一定的熱穩(wěn)定性；在pH值3～9范圍內(nèi)抑菌活性穩(wěn)定，但對強(qiáng)堿敏感；經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K處理后，抑菌活性出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05），對蛋白酶敏感。

采后柑橘在儲藏期易受青霉病菌和綠霉病菌的感染，造成果品質(zhì)量下降及經(jīng)濟(jì)損失。微生物法作為抑制植物病害的一種安全的生物防治方法，目前已在柑橘采后病害防治中得到一定的應(yīng)用[28]。本研究篩選出了一株對柑橘采后最易誘發(fā)且造成損失最大的綠霉病病原菌—指狀青霉具有較好拮抗作用的B.amyloliquefaciensHY 2-1，探究了該菌對高鹽的耐受性，并驗(yàn)證了該菌CFS的穩(wěn)定性。值得注意的是，B.amyloliquefaciensHY 2-1對指狀青霉抑菌活性評估及其自身活性物質(zhì)穩(wěn)定性測試，是基于成分復(fù)雜的CFS而非單體活性物質(zhì)。因此，還需要進(jìn)一步對CFS進(jìn)行分離純化，以確定其活性化合物的種類和數(shù)量，并開展活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定與解析等后續(xù)研究。