張立清 李 婕 洪秀宇 聶 娟 肖建琴

浙江省安吉縣中醫(yī)醫(yī)院 1 外科 2 醫(yī)教科 313300

哺乳期乳腺炎(Lactation mastitis，LA)是哺乳期婦女的常見多發(fā)病，臨床癥狀為乳房結(jié)塊腫脹疼痛，伴有全身發(fā)熱感染癥狀[1]。其發(fā)病原因多為乳管阻塞后乳汁分泌不暢、或乳頭破損引起金葡萄球菌等感染性細(xì)菌直接或間接入侵乳腺組織引發(fā)感染所致，嚴(yán)重者可累及全身[2-3]。但隨著對(duì)LA的深入研究，對(duì)其認(rèn)知已從單純感染性疾病過渡到免疫炎癥性疾病[4]。Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路激活與LA患者體內(nèi)炎癥因子水平升高，與LA局部疼痛和全身感染癥狀密切相關(guān)[4-6]。

中醫(yī)認(rèn)為L(zhǎng)A與“乳癰”癥狀類似，常用內(nèi)服、外敷中藥方劑，并配合手法通乳對(duì)其進(jìn)行對(duì)癥治療[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)服瓜蔞牛蒡湯治療可較大程度降低LA患者全身的炎癥反應(yīng)、緩解乳房疼痛不適感并減輕乳汁淤積[8-10]，但其作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過建立乳腺炎體內(nèi)、體外模型，探究瓜蔞牛蒡湯防治LA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與材料：小鼠乳腺上皮細(xì)胞EMT6細(xì)胞(賽百慷)；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS；貨號(hào)：L2880，Sigma)；小鼠的白細(xì)胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、IL-1β、IL-10的ELISA試劑盒(貨號(hào)：SBJ-M0044、SBJ-M0027、SBJ-R0095，森貝伽)；小鼠腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的ELISA試劑盒(貨號(hào)：MM-0132M2，酶免)；小鼠IL-12的ELISA試劑盒(貨號(hào)：ZC-36383，zcibio)；β-actin、核因子κB(NF-κB-p65)、p-NF-κB-p65、TLR4、TNF-α抗體(貨號(hào)：3700S、8242S、3033S、14358S、3707S，CST)；CCK-8試劑盒(貨號(hào)：HY-K0301，MCE)；BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：pc0020，Solarbio)。20只SPF級(jí)健康SD大鼠、36只ICR孕鼠均購于上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2018-0008]，常規(guī)飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動(dòng)物中心[動(dòng)物使用SYXK許可證號(hào)(浙)2020-0024]，批準(zhǔn)號(hào)EYOUNG-20210108-01。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào)BB150，Thermo公司)：脫水機(jī)、包埋機(jī)(型號(hào)：JJ-12J、JB-P5，武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(jī)(型號(hào)：RM2016，上海徠卡儀器有限公司)；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：AE2000，Motic)：倒置熒光顯微鏡(型號(hào)：Nikon Eclipse Ti-SR，日本尼康)；酶標(biāo)儀(型號(hào)：CMaxPlus，MD)。

1.2 方法

1.2.1 瓜蔞牛蒡湯制備和含藥血清制備：瓜蔞15g、牛蒡子12g、黃芩9g、梔子12g、金銀花9g、連翹9g、蒲公英15g、炮山甲6g、皂角刺9g、陳皮9g、青皮9g、炒王不留行10g、漏蘆9g、赤芍9g、甘草6g(藥物均由廣東一方制藥有限公司提供)，加水煎熬制備成200ml瓜蔞牛蒡湯。隨機(jī)挑選SD大鼠，分別灌胃等量蒸餾水、瓜蔞牛蒡湯(15g/kg)或頭孢曲松鈉(100g/kg)，連續(xù)7d。結(jié)束后在無菌條件下予麻醉行腹主動(dòng)脈采血(5ml)，靜置離心，獲取正常血清和兩種含藥血清經(jīng)處理后于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 細(xì)胞處理及分組：EMT6細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基，放置于5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。將1×105細(xì)胞取出接種于12孔細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)基80%時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組(等量正常血清)，模型組(等量正常血清)，低、中、高瓜蔞牛蒡湯血清組(分別含5%、10%、15%瓜蔞牛蒡湯血清)及頭孢曲松鈉血清組(含10%頭孢曲松鈉血清)。除空白組外，各組細(xì)胞均加入1μg/ml的LPS，培養(yǎng)24h，隨后各組加入相應(yīng)血清干預(yù)24h。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力：各組細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h，每孔加入10μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4 雌鼠造模及分組：取產(chǎn)后5～7d的ICR雌鼠與崽鼠分籠子禁食1～3h，隨機(jī)分為sham組、model組、不同劑量(7.5、15、30g/kg)瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組(100mg/kg)，每組6只。腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉溶液對(duì)雌鼠進(jìn)行麻醉后，仰臥固定，暴露乳頭，酒精棉球局部消毒，剪去1mm乳尖，充分暴露出乳導(dǎo)管，往第四對(duì)乳腺乳池注入0.2mg/ml的LPS(sham組在該手術(shù)操作下不進(jìn)行LPS注射)。造模后sham組、model組雌鼠給予等量生理鹽水灌胃，各瓜蔞牛蒡湯組雌鼠分別灌胃7.5g/kg、15g/kg、30g/kg的瓜蔞牛蒡湯，陽性藥物組雌鼠灌胃100 mg/kg頭孢曲松鈉，給藥治療4周。完成后安樂死雌鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，離心收集血清保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 HE染色：取各組雌鼠乳腺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色，經(jīng)蘇木素染色5min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30s，自來水浸泡，伊紅液復(fù)染2min，自來水沖洗，常規(guī)脫水，透明，封片。顯微鏡觀察HE染色切片。

1.2.6 ELISA檢測(cè)：按照ELISA試劑盒說明書，對(duì)各細(xì)胞組上清液IL-6、TNF-α、IL-1β含量和雌鼠血清IL-12、IL-10、IL-1β含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 Western blot檢測(cè)：離心收集各組細(xì)胞，制備雌鼠乳腺組織勻漿。裂解細(xì)胞和乳腺組織，提取蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳，分離目標(biāo)蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST洗膜。行免疫印跡反應(yīng)，封閉液封閉，加含一抗稀釋液(TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α)，4℃過夜孵育，加相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1～2h。以β-actin為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光儀顯影，chemi capture軟件分析圖像，測(cè)定各組細(xì)胞中蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 瓜蔞牛蒡湯對(duì)乳腺炎細(xì)胞活力的影響 如圖1所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，中、高瓜蔞牛蒡湯血清組和頭孢曲松鈉組細(xì)胞活力顯著提高(P<0.05或P<0.01)，而低瓜蔞牛蒡湯血清組細(xì)胞活力無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 瓜蔞牛蒡湯對(duì)乳腺炎細(xì)胞IL-6、TNF-α、IL-1β含量的影響 如圖2所示，與空白組相比，模型組IL-6、TNF-α、IL-1β含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，中、高瓜蔞牛蒡湯血清組和頭孢曲松鈉組細(xì)胞IL-6、TNF-α、IL-1β含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，而低瓜蔞牛蒡湯血清組則無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 各組乳腺炎細(xì)胞活力情況(n=3)

2.3 瓜蔞牛蒡湯對(duì)乳腺炎細(xì)胞TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達(dá)的影響 如圖3所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞中TLR4、p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，中、高瓜蔞牛蒡湯血清組和頭孢曲松鈉組細(xì)胞TLR4、p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；而低瓜蔞牛蒡湯血清組細(xì)胞的p-NF-κB-p65/NF-κB-p65蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，TLR4、TNF-α蛋白表達(dá)則無顯著差異(P>0.05)。

圖2 各組乳腺炎細(xì)胞IL-6、TNF-α、IL-1β含量情況(n=3)

圖3 各組乳腺炎細(xì)胞TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達(dá)情況(n=3)

2.4 瓜蔞牛蒡湯對(duì)乳腺炎組織病理變化的影響 如圖4所示，sham組小鼠組織內(nèi)乳腺細(xì)胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整且未見炎性細(xì)胞，而model組組織內(nèi)乳腺細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、積聚。隨著瓜蔞牛蒡湯組劑量的增加，LA小鼠組織內(nèi)乳腺細(xì)胞腫脹和積聚程度減輕，細(xì)胞形態(tài)趨于正常。陽性藥物組組織內(nèi)乳腺細(xì)胞的改善最為顯著。

2.5 瓜蔞牛蒡湯對(duì)乳腺炎小鼠血清中IL-12、IL-10、IL-1β含量的影響 如圖5所示，與sham組相比，model組血清中IL-12、IL-1β含量顯著升高(P<0.01)，而IL-10含量顯著下降(P<0.01)。與model組相比，15、30g/kg瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組血清IL-12、IL-1β含量顯著下降(P<0.05或P<0.01)，7.5g/kg瓜蔞牛蒡湯組血清IL-12、IL-1β含量無顯著差異(P>0.05)；而15、30 g/kg瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組血清IL-10含量顯著上升(P<0.05或P<0.01)，7.5g/kg瓜蔞牛蒡湯組血清IL-10含量無顯著差異(P>0.05)。

圖4 各組小鼠乳腺組織形態(tài)(HE,×100,×200)

圖5 各組乳腺炎小鼠血清中IL-12、IL-10、IL-1β含量情況(n=3)

2.6 瓜蔞牛蒡湯對(duì)乳腺炎組織TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，與sham組相比，model組組織TLR4、p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。與model組相比，各劑量瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組組織p-NF-κB-p65/NF-κB-p65蛋白表達(dá)均顯著下降(P<0.05或P<0.01)；15、30g/kg瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組組織TLR4蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05或P<0.01)，7.5g/kg瓜蔞牛蒡湯組組織TLR4蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)；30g/kg瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組組織的TNF-α蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)，7.5、15g/kg瓜蔞牛蒡湯組組織TNF-α蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

中醫(yī)提出治療LA應(yīng)按照不同分期進(jìn)行辨證治療，初期應(yīng)以疏肝清胃、通乳消腫為主，主張用瓜蔞牛蒡湯行“清”之功效，積極提高中醫(yī)證候改善率[11-12]。瓜蔞牛蒡湯配方組成豐富，其中的瓜蔞、牛蒡子、金銀花、連翹、蒲公英具有清熱消癰腫功效，王不留行、皂角、陳皮可健脾活血通乳[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)探索發(fā)現(xiàn)瓜蔞中活性成分可作用于生物過程中炎癥反應(yīng)的靶點(diǎn)[13]，而牛蒡子苷元可介導(dǎo)TLR4炎癥信號(hào)抑制LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子分泌[14]。

表達(dá)于乳腺細(xì)胞表面的TLR4可由細(xì)菌特異性成分LPS激活，隨后將信號(hào)傳導(dǎo)至胞內(nèi)觸發(fā)下游核因子κB(NF-κB)表達(dá)，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子引起組織炎癥[15]。TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活引起炎性細(xì)胞因子異常升高是乳腺炎小鼠局部炎癥和全身免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16]。既往研究結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)小鼠后會(huì)引起乳腺組織內(nèi)TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活，組織和血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平增加，而抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路能夠降低LA小鼠炎癥因子水平、提高抗炎細(xì)胞因子IL-10水平，減輕小鼠癥狀[17-19]。TNF-α是一種多功能型的促炎性細(xì)胞因子，其在乳腺組織高表達(dá)能夠調(diào)控炎性細(xì)胞因子生成，引起乳腺細(xì)胞凋亡和組織炎癥損傷[20]。

在本研究中，乳腺細(xì)胞及組織經(jīng)LPS誘導(dǎo)后TLR4/NF-κB信號(hào)通路及TNF-α表達(dá)均上調(diào)，炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12含量上升。而瓜蔞牛蒡湯則能抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路和TNF-α的表達(dá)，降低促炎性細(xì)胞因子水平，提高抗炎細(xì)胞因子IL-10水平，體現(xiàn)為乳腺炎細(xì)胞活力提升、乳腺炎組織淤積程度減輕，且該作用具有劑量效應(yīng)。

圖6 各組乳腺炎組織中TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達(dá)情況(n=3)

綜上所述，瓜蔞牛蒡湯改善LA的作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB、TNFα炎癥表達(dá)，繼而降低炎性因子水平有關(guān)。本研究為瓜蔞牛蒡湯臨床治療LA提供了理論依據(jù)。