高小鵬，羅勝軍，徐 麟，王澤巖，高 原，向 華，陳 晶，黃 元，白挨泉*，王曉虎*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)院，廣東 佛山 528225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 510640；3.視頻獸醫(yī)網(wǎng)，吉林 長春 130062；4.珠海市啟信達(dá)生物科技有限公司，廣東 珠海 519031)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的重要疫病之一，感染家豬與野豬外，還在反芻動物、嚙齒動物、犬科動物、昆蟲和其他非豬物種中發(fā)現(xiàn)潛在的PCV2病毒[1]。臨床上，PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎和腎病綜合征、新生仔豬先天性震顫、母豬繁殖障礙、豬增生性壞死性腸炎、肺炎[2]等癥狀的主要病原。PCV2感染可以導(dǎo)致宿主淋巴細(xì)胞損耗和免疫抑制，使其對其他病毒更易感[3]，因此，宿主體內(nèi)往往存在雙重甚至多重共感染：多種PCV2基因型、PCV3及其他豬源病毒間(豬繁殖與呼吸綜合征病毒、病豬細(xì)小病毒、古典豬瘟病毒、豬流感病毒、偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉病毒等)的共感染[4]。20多年的流行，PCV2核衣殼基因的高核苷酸替代率已導(dǎo)致多種基因型的存在[5]，雖然商品化的獸用疫苗已廣泛使用，有效降低了宿主感染后的亞臨床癥狀[6]，減少了養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)損失；但更多的證據(jù)表明，盡管使用PCV2滅活疫苗免疫，臨床的抗原陽性率仍然較高[7]，其中2014—2016年，我國PCV2的抗原陽性率高達(dá)64.68%(n=235)。目前，商用PCV2疫苗主要基于PCV2a基因型，近年來由于PCV2的抗原變異，疫苗已不能完全保護(hù)宿主抵抗感染[8]。因此，為了解PCV2在我國的流行及其遺傳進(jìn)化趨勢，本研究總結(jié)統(tǒng)計(jì)了2010—2020年間我國各地區(qū)PCV2的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)，這為我國PCV2分子流行學(xué)情況提供了具體數(shù)據(jù)，以期對我國PCV2的防控提供一定借鑒和指導(dǎo)意義。

1 病原學(xué)

PCV2為單股負(fù)鏈無囊膜正二十面體對稱的DNA環(huán)狀病毒。全基因組有1 766～1 769個(gè)核苷酸，預(yù)測有11個(gè)重復(fù)的開放閱讀框(open reading frame，ORF)[9]，即ORF1～ORF11，但只有ORF1～ORF6被正確表征：ORF1編碼2個(gè)復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep and Rep′)，ORF2編碼參與宿主免疫應(yīng)答的衣殼蛋白(Cap)，ORF3與ORF4分別編碼凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，ORF5編碼新型潛在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，ORF6編碼一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可能參與了胱天蛋白酶的調(diào)控以及PCV2感染細(xì)胞中多種細(xì)胞因子的表達(dá)[10]。其中，ORF2是病毒衣殼的唯一組成部分，參與病毒附著是宿主免疫反應(yīng)的主要靶標(biāo)；由于缺少病毒包膜，Cap蛋白被暴露在病毒體表面，具有顯著的遺傳多樣性，Cap蛋白可作為PCV2流行病學(xué)及其基因分型鑒定的靶標(biāo)基因序列[11]。

2 分子流行病學(xué)研究進(jìn)展

2.1 PCV2基因分型20世紀(jì)90年代，PCV2從美國和歐洲具有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征癥狀的豬場中被發(fā)現(xiàn)，與其他ssDNA病毒類似，PCV2具有高突變率特征。2008年，GRAUROMA等[12]基于不同ORF2核苷酸多樣性分析后，以遺傳距離3.5%的臨界值，定義了最初的2個(gè)基因型PCV2a和PCV2b；同時(shí)，DUPONT等[13]通過對丹麥PCV2的ORF2進(jìn)行回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，45個(gè)樣本的PCV2基因組核苷酸序列具有99.4%～100.0%的同源性，隨后被命名為PCV2c(EU148506和EU148507)。2010年，LONG等[14]通過分析多個(gè)地區(qū)的分離株，首次在我國發(fā)現(xiàn)并命名了新基因型PCV2d(HM038031、HM038030和HM038017)，基因組為1 766～1 767 nt，并確定了從PCV2a(HM038034)到PCV2b(HM038018、HM038022和HM038029)的轉(zhuǎn)變，且PCV2b在我國占據(jù)流行主導(dǎo)地位。2015年，在墨西哥和美國的豬中檢測到的一種新型PCV2的全基因組序列，編碼Cap蛋白的ORF2序列為717 nt，比以往報(bào)道的基因型(702～705 nt)相比3′端增加了12 nt，并被命名為PCV2e(KT795288、KT795289和KT7952-90)[15]。2017年，我國的一項(xiàng)回顧性研究，通過對1996—1999年間收集的23株P(guān)CV2毒株ORF2序列比對顯示，其中20株為PCV2a(MF139068、MF139071和MF139073)，其余3個(gè)毒株為1個(gè)獨(dú)立進(jìn)化枝，被命名為PCV2f(MF139078、MF139076和MF139077)[16]。在另一項(xiàng)回顧性研究中，F(xiàn)RANZO等[17]提出了一個(gè)以系統(tǒng)發(fā)育樹為基礎(chǔ)的基因型定義，設(shè)立了以下3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：同一基因型內(nèi)最大P距離為13%(根據(jù)ORF2基因計(jì)算)；相應(yīng)內(nèi)部節(jié)點(diǎn)的bootstrap應(yīng)高于70%，至少有15個(gè)可用序列。基于此對2018年7月之前上傳的4 586個(gè)ORF2有效序列使用鄰接法進(jìn)行比對分析，可分為8個(gè)基因型，包含新定義的PCV2g(AY713470.1、DQ363860.1和JX099786.1)和PCV2h(AY035820.1、JN411098.1和MF314300.1)。

目前，我國傳播的主要基因型為PCV2a、PCV2b和PCV2d，且PCV2d取代PCV2b成為未來的主要基因型。商品化的疫苗已廣泛應(yīng)用，也均具有一定的保護(hù)性，能夠有效控制臨床癥狀的進(jìn)一步發(fā)展，減少病毒血癥、病毒感染和傳播[18]，形成有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但卻不能完全阻止病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制[19]，PCV2的實(shí)驗(yàn)室診斷，抗原抗體同時(shí)檢測才更有意義。攻毒試驗(yàn)表明，各基因型間雖然具有免疫交叉保護(hù)，但是，與異源基因基因型攻擊相比，疫苗對同源攻擊的保護(hù)作用更高[20]。因此，對于近些年P(guān)CV2不同基因型間的遷移產(chǎn)生應(yīng)該引起足夠重視。

2.2 PCV2基因型分析對上述PCV2全基因序列使用MEGAX進(jìn)行分析。各基因型間ORF2的同源性在80.34%～95.47%之間，全基因同源性在90.20%～96.82%之間，不同基因型間ORF2的同源性差異更大，更適合基因分型鑒定。其中，Neighbor-Joining計(jì)算P距離進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖1)，全基因與ORF2的基因分型結(jié)果基本符合。 相比PCV2a-PCV2e分型，圖1B基于ORF2的系統(tǒng)發(fā)育樹，PCV2f/h與PCV2b在同一分支，而PCV2a被包含在PCV2c中，這是PCV2基因分型方法學(xué)不斷更新的表現(xiàn)，因而PCV2基因分型方法中選擇更新的標(biāo)準(zhǔn)毒株，系統(tǒng)發(fā)育樹才更可靠。

A.基于全基因的系統(tǒng)發(fā)育樹；B.基于ORF2的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 我國PCV2分子流行病學(xué)為評估我國PCV2的抗原陽性率，通過知網(wǎng)與PubMed，收集整理國內(nèi)外2010—2020年間37篇調(diào)查報(bào)告(表1)。共計(jì)13 226份樣品，7 012份核酸陽性，PCV2陽性率53.02%；涉及1 308株P(guān)CV2基因型，其中PCV2a(13.61%)，PCV2b(59.79%)，PCV2d(29.51%)，PCV2e(0.46%)。

表1 我國PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查匯總 份

續(xù)表1

為研究我國PCV2分子流行病學(xué)以及各基因型遺傳進(jìn)化的時(shí)空分布，根據(jù)我國行政區(qū)域劃分(可分為8個(gè)地區(qū))。由圖2可知，2010—2015年間，港澳臺PCV2(46.55%)的陽性率最低，而西南、西北和華南(72.79%，82.98%和86.29%)地區(qū)的陽性率較高；2016—2020年間，西北(17.30%)地區(qū)的陽性率最低，其他地區(qū)的PCV2陽性率都有所下降。

圖2 2010—2020年間我國各地區(qū)PCV2抗原陽性率

此外，PCV2具有很高的進(jìn)化率(1.2×10-3取代數(shù)/位點(diǎn)/年)[58]，我國2010—2015與2016—2020年間不同PCV2基因型相比(圖3)，現(xiàn)階段PCV2b與PCV2d已成為各地區(qū)的主要基因型，2010—2015年間PCV2b是主導(dǎo)基因型，而2016—2020年間在除華北以外的地區(qū)，PCV2d已取代PCV2b成為主導(dǎo)基因型，PCV2a則顯示較少的檢出率。我國2010—2015與2016—2020年間各地區(qū)中，東北地區(qū)PCV2a占比率由14.09%升至15.56%，PCV2b由83.89%降至31.11%，PCV2d由2.01%升至53.33%；在港澳臺地區(qū)，2016—2020年間PCV2a占比率為1.52%，2010—2015年間PCV2b為25.53%，PCV2d由74.47%升至98.48%；在華北地區(qū)2010—2015年間PCV2a占比率為13.33%，PCV2b由26.67%升至60.98%，PCV2d由60.00%降至31.71%，2016—2020年間PCV2e為7.32%；在華東地區(qū)PCV2a由13.74%升至14.08%，PCV2b由73.80%降至43.66%，PCV2d由14.38%升至53.52%；在華南地區(qū)PCV2a由12.82%降至8.33%，PCV2b由23.08%升至39.58%，PCV2d由56.41%降至52.08%，2010—2015年間PCV2e占比率為7.69%；在華中地區(qū)2016—2020年間PCV2a占比率為5.77%，PCV2b由25.00%升至34.62%，PCV2d由75.00%降至55.77%；在西北地區(qū)2010—2015年間PCV2a占比率為49.57%，PCV2b由82.05%降至55.00%，2016—2020年間PCV2d占比率為45.00%；在西南地區(qū)2016—2020年間PCV2a占比率為4.76%，PCV2b由100%降至9.52%，2016—2020年間PCV2d占比率為85.71%。

圖3 2010—2020年我國各地區(qū)不同PCV2基因型占比率

3 小結(jié)

PCV2作為一種普遍存在的病毒，特別是在豬場中妊娠分娩區(qū)域廣泛存在[59]。當(dāng)前商品化疫苗的廣泛使用使PCV2發(fā)病率和病毒血癥水平都有所下降[60]，但亞臨床感染以及新基因型的出現(xiàn)仍備受重視。本文通過統(tǒng)計(jì)近十年間我國PCV2陽性率及各基因型的時(shí)空分布，證明：首先，我國PCV2陽性率處于整體下降趨勢；PCV2d逐步取代PCV2b成為優(yōu)勢毒株；其次，不同地區(qū)的PCV2基因型占比中，華北與西北地區(qū)均無PCV2a檢出，PCV2b我國大部分區(qū)域(除港澳臺外)則都有檢出，其中，港澳臺與西南地區(qū)的PCV2d檢出率最高；再次，PCV2e僅在華南及華北少量分布。

自2000年首次報(bào)道PCV2以來[61]，我國經(jīng)歷了3次基因型轉(zhuǎn)變，2000—2003年主要為PCV2a，2003年之后逐步從PCV2a到PCV2b，2012年之后從PCV2b到PCV2d。此外，我國PCV2a/b/d具有明顯的時(shí)空分布特征與規(guī)律，并受到宿主間個(gè)體差異、不良的控制措施及毒力(PCV2多種基因型如疫苗免疫與野毒共存)的影響及內(nèi)外部環(huán)境(豬場間引種或跨宿主傳播即周邊非豬源的蝙蝠、嚙齒類動物及吸血昆蟲所攜帶的致病性PCV2病原)的威脅，而重組出更多的PCV2變體[62]。因而，豬場PCV2的防控，受到其豐富的遺傳多樣性影響而面臨巨大挑戰(zhàn)，為應(yīng)對可能出現(xiàn)的威脅，通過持續(xù)的流行病學(xué)監(jiān)測，掌握PCV2流行毒株的時(shí)空分布，對我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。