姚鑫炎，孫 靜，劉 宏，呂志航，車藝俊，黃淑堅，袁 生*，張雪蓮*

(1.佛山科學技術學院 生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231；2.廣東格灃動?？萍加邢薰?，廣東 肇慶 526238)

近年來，隨著養(yǎng)鵝業(yè)的不斷發(fā)展，鵝病毒性疾病變得越來越復雜化與多樣化，加之鵝飼養(yǎng)模式自身限制的影響，多種病原的混合感染在養(yǎng)鵝業(yè)已日益凸顯。有研究數(shù)據(jù)表明鵝細小病毒(goose parvovirus，GPV)、鵝圓環(huán)病毒(goose circovirus，GoCV)、鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)和鵝星狀病毒(goose astrovirus，GoAstV)4種病原在養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)病率較高且存在隱性感染[1-3]和混合感染[4-7]，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重制約養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。

鵝圓環(huán)病毒病是由GoCV感染引起鵝生長發(fā)育緩慢，羽毛脫落，胸腺、脾臟、法氏囊等免疫器官淋巴細胞減少的免疫抑制性傳染病[8]；該病流行廣泛，對雛鵝危害較大，常呈隱性感染，可使雛鵝機體免疫力下降而誘發(fā)其他多種病原的繼發(fā)感染。GPV感染雛鵝常被稱為小鵝瘟，也稱為Derzsy 病[9-10]，該病是一種急性、高傳染性和致命性的疾病，主要引起雛鵝纖維性壞死性腸炎；該疾病的嚴重程度與年齡有關，1周齡以內(nèi)的雛鵝最易感，病死率高達100%；4周齡以上的鵝感染后則很少表現(xiàn)出典型的臨床特征[11]。研究發(fā)現(xiàn)，GoCV與GPV存在混合感染，造成雛鵝脫毛斷羽等疾病[5]。而DTMUV感染可引起鵝采食量急劇下降，腹瀉、癱瘓及共濟失調(diào)，感染率100%，病死率5%～30%不等[12]。GoAstV感染可引起雛鵝關節(jié)腫大，腎臟蒼白腫脹，內(nèi)臟、關節(jié)腔、輸尿管有尿酸鹽沉積等[13]。最新研究表明，GoAstV還可導致雛鵝淋巴細胞和巨噬細胞凋亡，故該病毒感染可能引起機體的免疫抑制[14]，某種程度上也會引發(fā)多病原的混合感染，從而加速相關疾病病程導致雛鵝的死亡。

大量研究顯示，GPV、DTMUV、GoCV和GoAstV的感染主要危害雛鵝，且臨床上存在多病原的混合感染，一旦發(fā)病，病程急、病死率極高，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。因此，本研究旨在建立一種可以同時檢出GPV、DTMUV、GoCV和GoAstV 4種病原的多重PCR檢測方法，為上述疾病的臨床診斷及流行病學調(diào)查提供技術支撐及理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、Premix Ex TaqTM、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、DL2000 DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；Trans5α Chemically Competent Cell購自全式金生物技術有限公司；Gel Extraction Kit購自廣州飛揚生物工程有限公司；SteadyPure Plasmid DNA Extraction Kit 購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.2 病毒核酸鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)、鴨甲肝病毒3型(DHAV-3)、DTMUV、H5N6亞型禽流感病毒(AIV)、H9N2亞型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鴨病毒性腸炎病毒(DEV)、GoAstV、GPV、鴨腺病毒3型(FADV-3)、GoCV、新型鴨呼腸孤病毒(NDRV)陽性核酸均由佛山科學技術學院預防獸醫(yī)學實驗室保存。

1.3 臨床病料樣品2020年12月-2021年8月采集于廣東省部分地區(qū)水禽養(yǎng)殖場疑似病毒感染致死的病料樣本，共計40份，主要組織器官為肝臟。取1 mg肝臟組織加入2 mL無菌PBS后利用生物組織研磨器進行研磨，而后12 000 r/min離心10 min，收集組織研磨液上清，并于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 多重PCR引物設計與合成根據(jù)GenBank中GoAstV、GoCV、GPV及DTMUV參考毒株的全基因組序列，利用MEGA5.1 軟件進行比對，選取GoAstV的ORF2蛋白、GoCV的Rep蛋白、GPV的VP3蛋白及DTMUV的NS5蛋白序列，利用Primer Primer 5.0分別設計1對特異性PCR引物(表1)，引物均由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成。

1.5 核酸的提取參照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒說明書，提取臨床病料樣品的核酸，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 多重PCR引物序列

1.6 單重PCR擴增及重組質(zhì)粒構建以TaKaRa PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2說明書對GoAstV、GoCV、GPV、DTMUV陽性核酸進行PCR擴增；反應體系為(50 μL)：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL，陽性核酸模板5.0 μL，2×1 Step Buffer 25.0 μL，加RNase Free ddH2O至50.0 μL。擴增程序為：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預變性3 min；94℃變性40 s，53℃退火40 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將與預期大小相符的DNA片段進行純化回收，并按照pMDTM18-T Vector Cloning Kit試劑盒說明書將上述DNA片段與pMD18-T載體相連，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)中，通過PCR鑒定篩選陽性克隆，并將陽性菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司廣州分公司進行測序，序列正確的菌液提取質(zhì)粒保存于-20℃。

1.7 多重PCR擴增條件優(yōu)化

1.7.1退火溫度的優(yōu)化 以4種病毒的陽性重組質(zhì)粒混合成相同的質(zhì)量濃度作為多重PCR反應的模板(15 mg/L)，表1中4種病毒的引物等比混合為擴增引物(1.25 μmol/L)，反應體系為20.0 μL：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1.0 μL，混合引物(1.25 μmol/L)4.8 μL，混合模板(15 mg/L)2.0 μL，2×1 Step Buffer 10.0 μL，加RNase Free dH2O至20.0 μL。反應條件同1.6反應條件，但退火溫度設置為50,52,54,56,58,60℃ 6個梯度的退火溫度。擴增產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定最佳退火溫度。

1.7.2引物濃度的優(yōu)化 在20 μL的反應體系中加入0.8,1.6,2.4,3.2,4.0,4.8,5.6,6.4,7.2 μL體積的混合引物，使得4種病毒的上、下游引物依次為0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40,0.45 μmol/L 9個引物濃度梯度。擴增產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定最佳引物濃度。

1.8 多重PCR特異性試驗采用已優(yōu)化好的擴增條件，以4種病毒陽性核酸混合物、GoAstV、DTMUV、GPV、GoCV、DHAV-1、DHAV-3、NDV、NDRV、DEV、DAdV-3、H5N6 亞型、H9N2 亞型核酸作為模板進行檢測，并以ddH2O作為陰性對照，檢測四重PCR方法的特異性。

1.9 多重PCR敏感性試驗利用超微量紫外分光光度計測定GoAstv、GoCV、GPV、DTMUV 4種陽性重組質(zhì)粒標準品的質(zhì)量濃度分別為192,190,217,212 mg/L，將4種陽性重組質(zhì)?；旌现两K質(zhì)量濃度為15 mg/L，進行100～109倍比稀釋。各取2 μL 作為模板，按照上述優(yōu)化的擴增體系和擴增條件多重PCR檢測，以模板稀釋最高倍數(shù)擴增呈陽性的為該多重PCR的敏感度。

1.10 多重PCR臨床樣品檢測對采自廣東省部分地區(qū)鵝養(yǎng)殖場的疑似病毒感染致死的40份病料樣本，用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0提取肝臟組織核酸，采用已優(yōu)化好的多重PCR檢測方法，對肝臟組織核酸進行檢測；同時利用單一病毒PCR檢測方法對相應樣品進行再次檢測，并將2次檢測結(jié)果進行對比、分析。

2 結(jié)果

2.1 單重PCR擴增及陽性重組質(zhì)粒構建利用4種病毒的各自引物對4種病毒的陽性核酸進行單一PCR擴增。結(jié)果顯示，GoAstV、GoCV、GPV及DTMUV 4種陽性核酸分別擴增出約為731,543,392及200 bp大小的目的條帶(圖1)。而后，將擴增的4種病毒的目的片端進行純化回收，并與pMD18-T載體相連，構建4種病毒片段的陽性重組質(zhì)粒，并分別命名為pMD18T-GoAstV、pMD18T-GoCV、pMD18T-GPV及pMD18T-DTMUV。測序結(jié)果顯示，4個病毒的目的片段與GenBank中相應病毒的參考序列同源性均在99.0%以上。

M.DL2000 DNA Marker；1.GPV；2.GoCV；3.GoAstV；4.DTMUV；5.陰性對照

2.2 多重PCR反應條件的優(yōu)化分別對多重PCR退火溫度及引物濃度進行優(yōu)化，最佳退火溫度為52℃(圖2)，GPV、DTMUV、GoCV和GoAstV引物等比混合濃度為0.25 μmol/L(圖3)。優(yōu)化后的多重PCR擴增體系為(20.0 μL)：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，混合引物(1.25 μmol/L)4.0 μL，模板2.0 μL，2×1 Step Buffer 10.0 μL，加RNase Free dH2O至20.0 μL。擴增程序：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預變性3 min；94℃變性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延終伸5 min。

M.DL2000 DNA Marker；1～6.50,52,54,56,58,60℃；7.陰性對照

2.3 多重PCR特異性試驗分別以GoAstV、DTMUV、GPV、GoCV、DHAV-1、DHAV-3、NDV、NDRV、DEV、DAdV-3、H5N6亞型、H9N2亞型禽流感病毒的陽性核酸及GoAstV、DTMUV、GPV、GoCV陽性核酸混合物為模板，對所建立的多重PCR檢測方法進行特異性試驗。結(jié)果顯示，GoAstV、DTMUV、GPV、GoCV混合模板可擴增出4條清晰的目的條帶，GoAstV、DTMUV、GPV、GoCV陽性核酸均擴增出與預期大小一致的單一條帶，其他病毒陽性核算均未擴增出任何條帶(圖4)。

M.DL2000 DNA Marker；1～9：0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40,0.45 μmol/L；10.陰性對照

M.DL2000 DNA Marker；1.GoAstV、DTMUV、GPV、GoCV陽性核酸混合模板；2～13.GoAstV、DTMUV、GPV、GoCV、DHAV-1、DHAV-3、NDV、NDRV、DEV、DAdV-3、H5N6、H9N2陽性核酸；14.陰性對照

2.4 多重PCR靈敏性試驗以pMD18T-GoAstV、pMD18T-GoCV、pMD18T-GPV、pMD18T-DTMUV為模板，驗證該多重PCR檢測方法的敏感性。4種質(zhì)粒初始濃度為4.00×108，4.22×108，4.43×108，4.73×108copies/μL，結(jié)果顯示，GoAstV最低檢出限度為4.00×103copies/μL，GoCV最低檢出限度為4.22×103copies/μL，GPV最低檢出限度為4.43×103copies/μL，DTMUV最低檢出限度為4.73×103copies/μL(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker；1.未稀釋；2～10.101～109倍稀釋；11.陰性對照

2.5 臨床樣品的檢測利用本試驗建立的多重PCR檢測方法對收集的40份組織樣品進行檢測。結(jié)果顯示，40份臨床樣本中檢出GoAstV陽性18份，GoCV陽性2份，GPV陽性16份，DTMUV陽性9份，且存在上述病毒的雙重或三重感染(表2)。以單一PCR檢測方法對所有樣品進行檢測，結(jié)果與多重PCR檢測結(jié)果一致，兩者符合率為100%。

表2 臨床樣品的檢測結(jié)果 份

3 討論

近年來，我國養(yǎng)鵝業(yè)的規(guī)模不斷擴大、飼養(yǎng)模式多樣，致使鵝源病毒性疾病復雜多變，故對相關病原進行準確診斷、找出致病原因，并采取具體的防控及治療措施變得尤為重要。在臨床診斷中，當多種病毒混合感染時很難做出準確的判斷，常規(guī)的檢測方法(如病原分離和血清學試驗等)費時又費力，且單一PCR只能對特異的病毒核酸進行擴增，極大影響了相關傳染病病原判斷的準確性和及時性。而與單一PCR檢測方法相比，多重PCR在一個反應體系中加入多種不同病原的特異性引物，可同時對多個病原進行實時共檢，故多重PCR檢測方法既具備了單一PCR檢測的優(yōu)點，又達到了降低成本、節(jié)約時間、同步診斷的目的。

GoCV的感染引起雛鵝免疫力低下，繼發(fā)多重病原的混合感染。有研究顯示，GoAstV感染的雛鵝脾臟出現(xiàn)淋巴細胞減少，特別是白髓周圍淋巴細胞減少[14]，說明GoAstV有可能會降低機體免疫力，故該病毒感染后也可引發(fā)多種病原的混合感染。同時，已有研究表明，GoCV與GPV、GoAstV與GPV、GoCV與DTMUV存在混合感染[1-2,5]，臨床中也發(fā)現(xiàn)了GoCV與GoAstV、GoAstV與DHAV-1的混合感染。因此，快速、準確且能夠同時檢測出多種病原的混合感染對于臨床檢測及相關疾病的流行病學調(diào)查具有重要的意義。研究表明，雛鵝對GPV、DTMUV、GoCV和GoAstV均易感，加之雛鵝的免疫器官尚未發(fā)育成熟，且這4種病毒均可垂直傳播，使得這4種病毒感染引發(fā)的疾病給養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展造成了巨大威脅。雖針對GPV、DTMUV、GoCV和GoAstV均已有單一的PCR檢測方法，但實現(xiàn)這4種常見病毒共檢的多重PCR檢測方法尚未有研究報道。

本研究建立的多重PCR檢測方法，分別根據(jù)GPV、DTMUV、GoCV和GoAstV 4種病毒的VP3、NS5、Rep及ORF2蛋白基因序列設計4對特異性的引物，通過優(yōu)化擴增的反應條件，使其靈敏性達到最高。結(jié)果顯示，本研究建立的多重PCR方法針對GoAstV、GoCV、GPV、DTMUV的陽性重組質(zhì)粒標準品最低檢出限度分別為4.00×103，4.22×103，4.43×103，4.73×103copies/μL，且對DHAV-1、DHAV-3、NDV、NDRV、DEV、DAdV-3、H5N6亞型、H9N2亞型禽流感毒陽性核酸進行擴增，均無目的片段，表明建立的多重PCR檢測方法特異性良好。利用本研究建立的多重PCR檢測方法對收集的40份臨床樣品進行檢測，檢測結(jié)果與單一病毒的PCR方法的檢測結(jié)果相吻合。綜上所述，本研究建立的GPV、DTMUV、GoCV和GoAstV多重PCR檢測方法具有快速、靈敏、特異和同時檢測4種病原的諸多優(yōu)點，且具有良好的應用性，可用于現(xiàn)地臨床樣品的檢測及相關病毒病的流行病學調(diào)查。