岳怡明,皇昊,陳中原,盧玲,劉云章

(中國海洋大學醫(yī)藥學院,山東 青島 266003)

眾所周知，氧氣是許多生化代謝途徑的電子受體，細胞需要持續(xù)的氧氣供應作為代謝反應的底物。當氧濃度降低時，機體通過激活低氧信號通路來調(diào)控一系列生理病理活動。而低氧信號通路中低氧誘導因子(HIF)的發(fā)現(xiàn)，則開創(chuàng)了一個全新的研究領域，具有重要的理論價值和巨大的應用潛力。HIF通過調(diào)節(jié)數(shù)百個基因的轉錄來維持每個細胞中氧的供需平衡，尤其是在腫瘤細胞中，HIF影響腫瘤細胞的代謝、增殖、轉移、侵入和凋亡。在研究過程中，如果直接將HIF-1作為靶點進行藥物的研發(fā)設計，可能會造成藥物的副作用，若以相互作用蛋白為研究靶點，對疾病的治療可能會更加有效。本文對近年來發(fā)現(xiàn)的與HIF-1α相互作用的分子及其作用機制進行了總結。

1 HIF-1的分子結構

HIF-1由HIF-1α和HIF-1β這兩個亞基組成，每一個亞基都包含基本的helix-loop-helix(bHLH)和Per-ARNT-Sim(PAS)結構域，它們共同介導兩個亞基二聚化及其與DNA的結合[1-2]。其中的HIF-1α是可以響應氧氣調(diào)控的亞基，共編碼826個氨基酸，其編碼基因定位于人染色體14q21-q24。HIF-1α蛋白N端含有bHLH結構域、PAS-A和PAS-B結構域；HIF-1α蛋白C端含有氧依賴的降解結構域(ODD)以及NAD(N-terminal activation domain)和CAD(C-terminal activation domain)兩個轉錄激活結構域；大概576～785位的氨基酸為抑制結構域(ID)，此結構域可以降低HIF-1α蛋白轉錄激活結構域的活性，特別是在常氧條件下更加明顯。HIF-1β是芳基碳氫化合物核轉運蛋白(ARNT)，其編碼基因定位于人染色體1q21-24，HIF-1β可以和不同的bHLH-PAS蛋白質二聚化，但不能響應氧氣的變化[3]。

2 HIF-1的功能

在正常氧濃度環(huán)境中，HIF-1α的半衰期很短，在生物細胞中不停地合成與降解。在低氧條件下，HIF-1α的ODD中有兩個特殊的脯氨酸殘基(Pro402和Pro564)能夠被脯氨酰羥化酶(PHD)識別并羥基化，與腫瘤抑制蛋白(pVHL)結合，pVHL復合體能招募elongin-C/elongin-B/cullin-2 E3泛素蛋白連接酶復合物，進而導致HIF-1α的26S蛋白酶體降解[4]。同樣，HIF抑制因子(FIH)是一種2-氧戊二酸和亞鐵離子依賴的雙加氧酶，它以一種依賴于氧的方式控制HIF的轉錄活性，也具有羥基化作用。FIH可以通過調(diào)節(jié)HIF-1α的轉錄活性來發(fā)揮對HIF-1α的調(diào)節(jié)作用，HIF-1α的天冬酰胺被羥基化后，可阻斷轉錄輔助激活因子CBP/p300與TAD的結合，抑制下游基因的激活。已知公認的經(jīng)典的低氧信號通路由PHD和FIH共同作用，F(xiàn)IH通過調(diào)節(jié)氧化，與PHD/pVHL通路協(xié)同作用，加速HIF介導的低氧代謝反應[5-6]。然而，隨著科學技術的發(fā)展和進步，科學家們逐漸發(fā)現(xiàn)HIF-1的活性與HIF-1α和其他蛋白之間的相互作用息息相關，這些相互作用的蛋白不斷擴充著低氧信號通路[7]。到目前為止，研究已證明有大量蛋白與HIF-1α相互作用。在這些相互作用的蛋白質中，相互作用位點定位于特定的氨基酸殘基或HIF-1α的特殊結構域，例如bHLH-PAS結構域(在氨基酸殘基1～390位)[1-2]、PAS-B子結構域(在氨基酸殘基200～330位)[8]、ODD(在氨基酸殘基390～575位)[9]、CAD(在氨基酸殘基786～826位)[9]。

HIF-1α具有調(diào)節(jié)機體氧氣運輸、血管生成和糖酵解的功能，同時它通過上調(diào)涉及腫瘤血管生成、侵襲和轉移的基因的表達在腫瘤(乳癌、非小細胞肺癌、膠質瘤、腎癌等)低氧中發(fā)揮重要作用[10]。研究與HIF-1α相互作用的蛋白可以更好地了解疾病發(fā)生及其相關信號通路的調(diào)控機制，研究人員對相關蛋白功能的了解越精確，就越有可能為更多的疾病提供相應藥物以及靶向治療對策。例如，阿斯利康的新型治療貧血藥物羅沙司他，作為全球首個小分子HIF PHD抑制劑(HIF-PHI)，已于2018年12月率先在中國獲批上市。同樣都是PHD抑制劑，葛蘭素史克的治療慢性腎病貧血的daprodustat(GSK1278863)也緊隨其后，在不同國家和地區(qū)提交了上市申請[11]。此外，針對HIF-1α和HIF-2α的特異性抑制劑，也正在進行腎癌等腫瘤適應證的早期臨床研究。

3 HIF-1α的相互作用蛋白及作用機制

3.1 影響HIF-1α氧氣依賴的蛋白降解

在HIF-1α氧氣依賴的經(jīng)典降解途徑中，一部分與HIF-1α相互作用的蛋白可以通過穩(wěn)定HIF-1α與其羥基化復合物之間的相互作用或刺激羥基化的HIF-1α泛素化過程，從而實現(xiàn)對HIF-1α的降解調(diào)控；也有一些與HIF-1α相互作用的蛋白通過抑制pVHL-E3泛素連接酶復合體或催化去泛素化來調(diào)控HIF-1α依賴于氧氣的降解過程[12-19]。這些依賴于O2/PHDs/pVHL途徑調(diào)控HIF-1α的相互作用蛋白見表1。

表1 依賴O2/PHDs/pVHL途徑調(diào)控的相互作用蛋白

HICKS等[12]認為，Sprouty同源物2蛋白(SPYR2)充當了HIF-1α和pVHL降解復合物之間的橋梁，從而提高pVHL的局部濃度，促進低氧狀態(tài)下HIF-1α的泛素化降解。SPYR2對HIF-1α的調(diào)節(jié)最終轉化為對HIF-1α下游靶基因和葡萄糖攝取的調(diào)節(jié)，因此SPYR2通過調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白水平和基因轉錄來發(fā)揮其抑癌作用，當SPYR2在某些癌癥中表達減少或丟失時，HIF-1α的下游靶基因表達升高，從而促進癌癥的發(fā)生發(fā)展。KOZLOVA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，含SH3結構域的激酶結合蛋白1(CIN85)是PHD2的新型結合伴侶，CIN85的N端結構域與PHD2的N端結構域中的脯氨酸、精氨酸富集區(qū)相互作用，可抑制PHD2的活性，從而抑制HIF-1α的降解。泛素C末端水解酶L1(UCHL1)與HIF-1α相互結合可以阻止pVHL與HIF-1α的直接結合，而且低氧可以增強兩者的相互作用，兩者的結合抑制了pVHL介導的HIF-1α的泛素化[14]。

近年來，隨著基因組測序分析技術飛速發(fā)展，越來越多的長鏈非編碼RNA(lncRNA)通過基因組大規(guī)模的深度測序和轉錄組分析被鑒定出來。lncRNA在生物生命過程中起著廣泛而重要的作用，它們可以通過多種機制以順式調(diào)節(jié)或反式調(diào)節(jié)的方式影響基因的表達。中山大學宋爾衛(wèi)院士課題組發(fā)現(xiàn)了可穩(wěn)定HIF-1α的lncRNA(HISLA)，HISLA能阻止PHD2與HIF-1α的相互作用，從而抑制HIF-1α的羥基化和降解[20]。有研究結果表明，lncRNA TUG1也可以靶向HIF-1α，其表達減少可以抑制肺腺癌細胞的生長[21]。lncRNA作為潛在的信號轉導物，通過囊泡在免疫細胞和腫瘤細胞之間傳播，從而促進癌癥的有氧糖酵解。

3.2 影響HIF-1α非氧氣依賴的蛋白降解

在與HIF-1α相互作用的蛋白中，有一些蛋白對HIF-1α的作用獨立于依賴VHL的經(jīng)典降解途徑，這些蛋白對HIF-1α的調(diào)控作用不依賴氧氣的存在，其作用途徑包括增加泛素化及類泛素化修飾、通過蛋白酶體降解的新途徑以及分子伴侶介導的自噬(HIF-1α的溶酶體降解)；在不依賴氧氣的情況下，一部分與HIF-1α相互作用的蛋白也可以通過調(diào)節(jié)泛素化或催化去SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修飾來抑制HIF-1α的降解[22-30]。見表2。

表2 通過非氧氣依賴途徑調(diào)控的相互作用蛋白

基本螺旋-環(huán)-螺旋家族成員E41(BHLHE41)最早是由MONTAGNER等[24]發(fā)現(xiàn)的一種獨立于HIF-1α的pVHL泛素化降解途徑之外的蛋白，它可以促進HIF-1α與蛋白酶體的結合，從而導致HIF-1α蛋白酶體降解。同樣重要的蛋白還有熱休克蛋白70羧基末端反應蛋白(CHIP)，該蛋白作為E3泛素連接酶，在介導蛋白酶體或溶酶體系統(tǒng)底物降解的分類決定中起著關鍵作用。LUO等[31]研究認為，HIF-1α可以與熱休克蛋白70(HSP70)相互作用，并且通過募集E3泛素連接酶CHIP促進了在長時間低氧時HIF-1α的降解，這就是CHIP介導的蛋白酶體降解途徑。CHIP同時可以參與HIF-1α溶酶體降解途徑，F(xiàn)ERREIRA等[26]最早研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以進行伴侶蛋白介導的自噬降解。

3.3 影響HIF-1α的轉錄活性

另一大組與HIF-1α相互作用的蛋白可以作為共激活物或共抑制物來調(diào)節(jié)由HIF-1α介導的轉錄過程，同時，許多與HIF-1α相互作用的蛋白通過促進或抑制HIF-1α與其他蛋白的相互作用來調(diào)節(jié)HIF-1α的活性，這些與HIF-1α相互作用的蛋白具有催化活性，如乙?；?、去乙?；?、去甲基化、磷酸化或泛素化，導致HIF-1α翻譯后修飾，從而影響HIF-1α的穩(wěn)定性、亞細胞定位或轉錄激活功能[32-40]。見表3。

表3 調(diào)節(jié)HIF-1α轉錄激活的相互作用蛋白

LEE等[32]認為，在低氧條件下，Akt信號通路被激活，誘導糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的第9位絲氨酸殘基磷酸化，GSK3β沉默導致貨物接頭蛋白1(BICD1)和HIF-1α之間的相互作用，HIF-1α被誘導入核，發(fā)揮對其下游靶基因的轉錄調(diào)控作用。甲基轉移酶G9a是Suv39h蛋白家族的一個重要成員。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的甲基轉移酶中，G9a和GLP是組蛋白H3(H3K9me1和H3K9me2)的Lys 9位點單、二甲基化的主要酶，主要以G9a-GLP異聚體復合物的形式存在。近年來，許多重要研究認為G9a和GLP在各種生物過程中起著關鍵作用，它們介導表觀遺傳基因調(diào)控的生理相關性功能。BAO等[36]研究發(fā)現(xiàn)，G9a-GLP與HIF-1α相互作用并在體外和體內(nèi)直接催化HIF-1α的K674的單甲基化或二甲基化。G9a-GLP介導的K674甲基化可降低HIF-1α的轉錄活性和多形性膠質母細胞瘤(GBM)細胞中HIF-1α下游靶基因的表達，抑制GBM細胞的遷移能力。在表觀遺傳調(diào)控方面，CHEN等[38]的研究結果證實，溴區(qū)結合蛋白(ZMYND8)可以與HIF-1α和HIF-2α相互作用，通過增加BRD4的募集和釋放暫停的RNA聚合酶Ⅱ增加HIF下游癌癥基因的表達。

4 HIF-1α與癌癥的關系

HIF-1α在多種疾病中發(fā)揮了關鍵的作用，包括腫瘤、腦缺血、肺動脈高壓、糖尿病等，尤其在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中至關重要，其活性的增加促進了腫瘤血管生成相關基因、代謝相關基因的表達，同時也為癌細胞對低氧的其他適應提供了分子基礎[41]。

腎細胞癌(RCC)是一種常見的惡性腫瘤，全球腎癌每年導致大于10 0000人死亡。腎透明細胞癌(ccRCC)與pVHL息息相關，ccRCC一般都存在兩個pVHL等位基因失活，導致pVHL對HIF的降解功能喪失。在VHL缺陷的RCC異種移植物中重新表達pVHL會減緩腫瘤的生長，證實VHL是真正的腫瘤抑制基因。迄今為止，pVHL最具特征的靶標是HIF的α亞基。pVHL功能的喪失導致HIF-1α的穩(wěn)定，因此RCC中pVHL的喪失與HIF的激活及其轉錄激活緊密相關[42]。有研究者使用不同的基因組平臺調(diào)查了400多例腎癌腫瘤樣本，結果顯示PI3K/Akt信號通路突變率很高，表明該途徑是潛在的治療靶點[43]。染色質修飾基因在ccRCC中高頻的突變?yōu)楹诵◇w動力學模型的建立提供了強有力的證據(jù)，該模型在腎癌發(fā)生中發(fā)揮了關鍵作用。盡管有關這種調(diào)節(jié)如何促進腎癌細胞形成的具體機制尚待確定，但已有的數(shù)據(jù)揭示了與SETD2基因突變相關的DNA甲基化的改變[44]。作為可以有效改變許多轉錄輸出的表觀遺傳過程，這些突變可能通過改變整體基因和遺傳元件的表達來改變腫瘤的基因組。PI3K/Akt途徑是ccRCC未來的一個治療靶點，像哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路或相關途徑抑制劑對ccRCC的治療具有潛在價值[43]。

乳癌是近幾年研究較多的癌癥類型，特別是三陰性乳癌(TNBC，侵襲性最強的乳癌類型之一)在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢，病死率不斷上升。眾多研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在乳癌細胞中呈現(xiàn)高表達并且與乳癌的發(fā)生發(fā)展有關[45]。有研究闡明了BHLHE41和HIF-1α之間的相互作用機制，這就為其臨床應用奠定了基礎，并且已經(jīng)在TNBC中得到驗證。在乳癌細胞中，ZMYND8通過增加BRD4的募集和釋放暫停的RNA聚合酶Ⅱ增加了HIF下游癌癥基因的表達，在這個過程中，ZMYND8對p300的1 007和1 034位賴氨酸的乙?；龠M了乳癌的生長和轉移，這為診治乳癌提供了可能的分子靶標[38]。有研究表明，表皮生長因子受體(EGFR)銜接子蛋白CIN85可以促進乳癌惡化和HIF的穩(wěn)定性，這項研究使以前無法識別的腫瘤生長檢查點得以發(fā)現(xiàn)，該檢查點受CIN85-PHD2調(diào)控，并將生長因子受體與低氧信號通路聯(lián)系起來，對腫瘤的生存至關重要[13]。UCHL1在臨床中可以促進癌癥的轉移，與乳癌和肺癌病人的不良預后密切相關，未來也可用作癌癥的預后標志物和治療靶標[14]。

胃癌是全球癌癥相關死亡的第3大原因，東亞地區(qū)的發(fā)病率極高，一旦發(fā)現(xiàn)多數(shù)被診斷為晚期[46]。因此，研究胃癌的致病機制并尋找有效的腫瘤標志物以提高早期診斷率成為了重中之重。CHEN等[47]的研究表明，lncRNA HIF1A-AS2的高表達與胃癌的不良預后顯著相關，HIF1A-AS2敲降可抑制胃癌細胞的體外增殖能力，所以HIF1A-AS2在胃癌的早期診斷中可作為潛在診斷標志物。

5 總結與展望

HIF-1是轉錄因子家族的一個重要成員，在調(diào)節(jié)機體氧的穩(wěn)態(tài)、生物體生理及病理過程中發(fā)揮重要作用。在低氧腫瘤細胞尤其是實體瘤中HIF-1存在著過度表達，并控制下游上百種基因的表達，包括葡萄糖轉移酶-1(GLUT-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、酪氨酸激酶(c-Met)等，影響腫瘤細胞的代謝、增殖、轉移、侵入和凋亡。許多與HIF-1α相互作用的蛋白是HIF-1靶基因的產(chǎn)物，參與前饋或反饋回路，從而放大或消除細胞對低氧的反應。未來對HIF-1α調(diào)節(jié)因子的研究仍然是熱點，探究與HIF相關的基因和結合蛋白有望為臨床以及藥物研究提供新的方向和機遇。