張京,鄭憲鑫,楊嵐婷,王建勛

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266071)

糖尿病心肌病是糖尿病病人高死亡率的因素之一[1]。研究表明，高糖血癥是糖尿病心肌病發(fā)生的始動因素[2]，高糖血癥能夠促進(jìn)活性氧(ROS)過度釋放，進(jìn)而通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡而引起糖尿病心肌損傷[3]。心肌細(xì)胞凋亡和糖尿病心肌病的發(fā)生存在密切關(guān)系[4-5]。但高糖誘導(dǎo)引起心肌細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制尚不清楚。具有半胱天冬酶募集域的凋亡抑制因子(ARC)是一種在心臟和骨骼肌中高表達(dá)并具有高效抑制凋亡作用的內(nèi)源性多功能蛋白[6-7]。ARC具有很強(qiáng)的心臟保護(hù)功能，而這種保護(hù)功能主要體現(xiàn)在其對凋亡性心肌細(xì)胞的抑制[8]。有研究結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞中ARC參與調(diào)控多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，比如心肌梗死、心臟缺血再灌注損傷和心肌肥大[9-11]。還有研究顯示，ARC在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著抑制作用[12]，在心臟缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞程序性壞死中ARC也有強(qiáng)保護(hù)作用[13]。同時有研究顯示，ARC可以抑制線粒體凋亡途徑引起的細(xì)胞死亡[10]。P53在調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡過程中起到重要作用。P53通過與死亡相關(guān)的蛋白相互作用或作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞死亡[14]。有研究顯示，P53可以促進(jìn)線粒體呼吸導(dǎo)致的活性氧生成和脂質(zhì)積累過多導(dǎo)致的糖尿病心臟功能障礙[15]；靶向抑制P53可以有效預(yù)防糖尿病心肌病[16]；P53可以結(jié)合ARC的啟動子區(qū)域并在凋亡開始時在轉(zhuǎn)錄水平上降低其表達(dá)[17]。但P53是否可以通過調(diào)控ARC的表達(dá)調(diào)節(jié)糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展有待研究。既往有研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病性心肌病模型中敲低ARC會引起心肌細(xì)胞焦亡，這表明ARC可以通過抑制高糖誘導(dǎo)的炎性因素來保護(hù)心臟[18]。但ARC是否可以通過抑制心肌細(xì)胞凋亡抑制糖尿病心肌病的發(fā)展尚不清楚。本文研究檢測了ARC對高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響，并觀察過表達(dá)ARC對ROS和線粒體膜電位的影響，進(jìn)一步探討ARC影響高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠心肌細(xì)胞(H9c2細(xì)胞)、人胚胎腎細(xì)胞293(HEK293細(xì)胞)為本實驗室之前所有，在液氮中凍存；DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶購自美國Gibico公司；RIPA裂解液購自上海雅酶生物科技有限公司；ARC抗體購自美國CST公司；p53抗體購自英國Abcam公司；鏈脲佐菌素(STZ)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；Tunel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(FITC)購自上海翊圣生物科技有限公司；caspase3/7活性檢測試劑盒以及線粒體膜電位檢測試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ROS檢測試劑盒購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；腺病毒ARC(Ad-ARC)、腺病毒h-半乳糖苷酶(Ad-β-gal)、腺病毒si-ARC(Ad-si-ARC)、腺病毒scr-ARC(Ad-scr-ARC)、腺病毒si-p53(Ad-si-p53)和腺病毒 scr-p53 (Ad-scr-p53)為本實驗室之前合成[17]。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞和HEK293細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2實驗分組及處理 以高糖(50 mmol/L)處理的H9c2細(xì)胞為HG組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為正常對照組(C組)。高糖處理0、3、6、12、24 h的H9c2細(xì)胞標(biāo)記為C、3、6、12、24組。將腺病毒ARC、Ad-β-gal、Ad-si-ARC、Ad-scr-ARC、Ad-si-p53、Ad-scr-p53分別轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中，作為Ad-ARC組、Ad-β-gal組、Ad-si-ARC組、Ad-scr-ARC組、Ad-si-p53組、Ad-scr-p53組；將腺病毒ARC、Ad-β-gal、Ad-si-ARC、Ad-scr-ARC、Ad-si-p53、腺病毒scr-p53分別轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中再進(jìn)行高糖處理，作為HG+Ad-ARC組、HG+Ad-β-gal組、HG+Ad-si-ARC組、HG+Ad-scr-ARC組、HG+Ad-si-p53組、HG+Ad-scr-p53組。

1.2.3腺病毒的擴(kuò)增和感染 HEK293細(xì)胞傳代于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞生長至占全板密度100%，加入腺病毒感染2～3 d，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)肉眼可見的空洞時收集細(xì)胞，于液氮中反復(fù)凍融3次后，12 000 r/min離心5 min，收集上清中更多的腺病毒，放于-80 ℃保存，用于后續(xù)實驗。細(xì)胞換成無血清培養(yǎng)液后將腺病毒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，4 h后換成有血清培養(yǎng)液。

1.2.4Western blot方法檢測ARC和P53蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞處理后以RIPA裂解液提取蛋白，取20 μg蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后進(jìn)行PVDF膜濕轉(zhuǎn)(28 W、90 min)，用50 g/L的脫脂奶粉溶液封閉1 h，分別加入ARC(1∶1 500)、p53(1∶1 500)和內(nèi)參β-actin(1∶10 000)一抗，4 ℃過夜，TBST洗3次，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，在蛋白凝膠成像儀上曝光拍照。應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶的灰度值，結(jié)果以ARC/β-actin和P53/β-actin比值表示。

1.2.5Tunel染色檢測細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞使用預(yù)冷的PBS清洗3次，多聚甲醛固定細(xì)胞，固定完成后吸出多聚甲醛，用PBS洗3次，加入含體積分?jǐn)?shù)0.20的TritonX-100通透處理10 min，吸出TritonX-100，用PBS洗2次，按照Tunel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.6caspase3/7活性檢測 收集各組細(xì)胞，用PBS洗3次，加入2.5 g/L胰酶消化后收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各組相對于C組的caspase3/7活性，按caspase 3/7活性測定試劑盒說明書操作。

1.2.7ROS檢測 在6孔板中常規(guī)培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至占全板密度50%時，加入腺病毒ARC感染細(xì)胞24 h，再換成高糖(50 mmol/L)含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)36 h，應(yīng)用熒光顯微鏡檢測各組的ROS水平，按照ROS檢測試劑盒說明書操作。

1.2.8線粒體膜電位檢測 在6孔板中常規(guī)培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%左右時，加入腺病毒感染細(xì)胞24 h，換成含體積分?jǐn)?shù)0.10血清的高糖(50 mmol/L)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，應(yīng)用熒光顯微鏡檢測各組線粒體膜電位，根據(jù)線粒體膜電位檢測試劑盒說明書操作。

1.2.9小鼠心肌組織ARC蛋白表達(dá)檢測 6周齡雄性C57BL/6J小鼠10只(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，飼養(yǎng)在環(huán)境控制的繁殖室中(溫度(20±2) ℃，濕度(60±5)%，12 h/12 h晝夜循環(huán))，自由飲水。隨機(jī)分為健康對照組和鏈脲佐菌素組(STZ組)，每組5只。STZ組腹腔注射STZ 120 mg/kg(檸檬酸鹽緩沖液溶解，pH 值4.5)建立糖尿病小鼠模型[19]。連續(xù)注射STZ 3 d后，尾靜脈采血測定小鼠的空腹血糖，連續(xù)2次血糖水平>16.7 mmol/L診斷為糖尿病小鼠模型造模成功。健康對照組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水。造模成功后10周斷頸處死小鼠，取心臟，常規(guī)方法提取蛋白，Western blot方法檢測ARC蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠心肌組織ARC及高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中ARC、P53的表達(dá)

Western blot檢測顯示，健康對照組和STZ組小鼠心肌組織ARC蛋白的相對表達(dá)量分別為1.21±0.07和0.76±0.08，兩組比較差異有顯著性(t=7.507，P<0.05)(圖1A)。H9c2細(xì)胞C組的ARC和P53蛋白相對表達(dá)量分別為1.69±0.05和0.90±0.02；高糖處理3、6、12、24 h后，ARC的蛋白相對表達(dá)量分別降低至1.04±0.03、0.87±0.03、0.75±0.02、0.60±0.01(n=3，F(xiàn)=612.9,P<0.05)，P53的蛋白相對表達(dá)量分別升高至0.92±0.04、0.96±0.08、1.00±0.06、1.13±0.05(n=3，F(xiàn)=8.0，P<0.05)。ARC的表達(dá)量隨著高糖誘導(dǎo)時間的增加而降低，24 h降低最明顯(q=45.01，P<0.05)；而P53的表達(dá)量隨著高糖誘導(dǎo)時間的增加而增加，24 h增加最明顯(q=5.07，P<0.05)(圖1B)。

A：STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠心肌組織ARC表達(dá)；B:高糖誘導(dǎo)不同時間H9c2細(xì)胞中ARC、P53表達(dá)。圖1 STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠心肌組織ARC及高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中ARC、P53表達(dá)的 Western blot檢測

2.2 敲低ARC對高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡影響

為了探討ARC在高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中的作用，本研究構(gòu)建了ARC敲低的腺病毒(圖2A)。Western blot結(jié)果顯示,C組、Ad-scr組和Ad-ARC-siR-NA組H9c2細(xì)胞的ARC蛋白的相對表達(dá)水平分別為1.17±0.01、1.17±0.02和0.68±0.01，與Ad-scr組相比，Ad-ARC-siRNA組H9c2細(xì)胞ARC蛋白表達(dá)水平降低(F=1 049.0，t=34.12，P<0.05)。Tunel染色結(jié)果顯示，與C組比較，HG組H9c2細(xì)胞的凋亡率明顯增加(圖2B)，HG+Ad-si-ARC組的H9c2細(xì)胞凋亡率較HG+Ad-scr-ARC組更高(F=807.2，t=17.04，P<0.05)。與C組比較，HG組H9c2細(xì)胞的caspase3/7活性增加，HG+Ad-si-ARC組H9c2細(xì)胞的caspase3/7活性較HG+Ad-scr-ARC組更高(F=290.8，t=5.86，P<0.05)。敲低ARC可以增強(qiáng)高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡及caspase3/7活性。見表1和圖2。

表1 敲低ARC后高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡率和caspase3/7活性比較

A：Western blot檢測各組H9c2細(xì)胞中ARC表達(dá)；B：Tunel染色檢測各組H9c2細(xì)胞經(jīng)高糖處理36 h細(xì)胞凋亡數(shù)。20倍。圖2 敲低ARC對高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響

2.3 過表達(dá)ARC對高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，C組、Ad-β-gal組和Ad-ARC組H9c2細(xì)胞ARC的蛋白相對表達(dá)水平分別為0.87±0.02、0.95±0.03和1.16±0.02，各組比較差異有顯著性(F=155.9,P<0.05)，與Ad-β-gal組相比，Ad-ARC組H9c2細(xì)胞ARC蛋白表達(dá)水平升高(t=11.53，P<0.05)。Tunel染色結(jié)果顯示，與HG+Ad-β-gal組相比較，HG+Ad-ARC組H9c2細(xì)胞的凋亡率(圖3B)明顯減少(F=480.6，t=15.55，P<0.05)；與HG+Ad-β-gal組比較，HG+Ad-ARC組H9c2細(xì)胞的caspase3/7活性(圖3C)明顯減少(F=229.5，t=6.66，P<0.05)。過表達(dá)ARC可以抑制高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡及caspase3/7活性。見表2。

A：熒光顯微鏡檢測Ad-β-gal、Ad-ARC腺病毒轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，經(jīng)高糖處理36 h后線粒體膜電位變化，綠色熒光增加代表膜電位減少，紅色熒光增加代表膜電位增高；B：用綠色和紅色熒光對線粒體膜電位定量，紅色熒光減少代表線粒體膜電位增加。圖3 ARC對高糖引起的線粒體膜電位增高的影響

表2 過表達(dá)ARC后各組H9c2細(xì)胞凋亡率以及caspase3/7活性比較

2.4 過表達(dá)ARC對高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

將C組的ROS水平設(shè)為1，HG組、HG+NAC組相對于C組的ROS水平分別為2.96±0.07、1.08±0.05。與C組相比，HG組的ROS水平增加，并且這種ROS水平的增加可以被抗氧化劑NAC清除(F=1 594.0，t=39.08，P<0.05)。進(jìn)一步檢測顯示，HG組、HG+Ad-β-gal組、HG+Ad-ARC組相對于C組的ROS水平分別為2.96±0.07、2.57±0.03、1.32±0.07，與HG+Ad-β-gal組相比，HG+Ad-ARC組的ROS水平減少(F=991.3，t=26.81，P<0.05)，說明過表達(dá)ARC可以抑制高糖引起的ROS水平增加。

2.5 過表達(dá)ARC對高糖引起的線粒體膜電位增高的影響

對過表達(dá)ARC后線粒體膜電位紅綠熒光比率分析顯示，C組、HG組、HG+Ad-β-gal組、HG+Ad-ARC組的紅色熒光占總熒光的比值分別為0.86±0.01、0.25±0.01、0.22±0.02、0.79±0.02，與C組比，HG組的線粒體膜電位增加;與HG+Ad-β-gal組相比，HG+Ad-ARC組的線粒體膜電位下降(F=1 153.0,t=34.38，P<0.05)。提示過表達(dá)ARC可抑制高糖引起的線粒體膜電位增高。見圖3。

2.6 高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡中P53對ARC的作用

Western blot結(jié)果顯示，C組、Ad-scr-p53組和Ad-si-p53組H9c2細(xì)胞P53蛋白相對表達(dá)量分別為1.18±0.02、1.17±0.04和0.68±0.06，各組間比較差異有顯著性(F=164.4，P<0.05)；其中Ad-si-p53組H9c2細(xì)胞P53蛋白表達(dá)水平較Ad-scr-p53組降低(t=13.05，P<0.05)。C組、HG組、HG+Ad-scr-p53組、HG+Ad-si-p53組的P53蛋白相對表達(dá)水平分別為0.84±0.02、1.32±0.05、1.33±0.06、0.53±0.06，ARC的蛋白相對表達(dá)水平分別為1.39±0.02、0.68±0.01、0.63±0.02、1.28±0.04。敲低p53表達(dá)可恢復(fù)高糖引起的ARC的減少(F=780.4,t=24.78，P<0.05)。C組、HG組、HG+Ad-scr-p53組、HG+Ad-si-p53組的caspase3/7活性分別為1.16±0.06、5.04±0.16、5.18±0.17、2.23±0.09，HG+Ad-si-p53組的caspase3/7活性較HG+Ad-scr-p53組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=725.8，t=26.00，P<0.05)。表明P53在高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡中參與調(diào)控ARC的表達(dá)。見圖4。

A：轉(zhuǎn)染Ad-si-p53、Ad-scr-p53腺病毒后H9c2細(xì)胞中P53表達(dá)；B：Ad-si-p53、Ad-scr-p53腺病毒轉(zhuǎn)染后經(jīng)高糖處理36 h各組P53、ARC的表達(dá)。圖4 Western blot檢測高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡中P53對ARC的作用

3 討 論

抗凋亡蛋白ARC在心肌組織中高表達(dá)并有著很強(qiáng)的心臟保護(hù)功能[6-7]。ARC具有兩個功能域CARD和P/E，其中CARD與caspase的CARDS、caspase接頭蛋白RAIDD和凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)具有高度同源性[6]。研究顯示，ARC可以與caspase家族及其受體蛋白相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，還可以維持線粒體膜電位的穩(wěn)定并減少線粒體中活性氧的釋放[10]。更加有趣的是，ARC可以通過抑制淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的JNK途徑的激活和凋亡來減少2型糖尿病中胰島β細(xì)胞的丟失，這意味著ARC有防治糖尿病的潛力。本文試圖找到ARC在高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中是否存在著未被發(fā)現(xiàn)的保護(hù)途徑。心肌細(xì)胞凋亡的增加是糖尿病心肌病發(fā)展過程中的一個重要病理表現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的增加會對心臟的結(jié)構(gòu)功能造成很大的損害，找到抑制心肌細(xì)胞凋亡的新方法十分必要，抑制心肌細(xì)胞凋亡也成為預(yù)防和治療糖尿病心肌病的重要研究方向。

本文首先檢測了糖尿病小鼠心臟中ARC的表達(dá)，結(jié)果顯示，與健康對照組相比，STZ組ARC蛋白表達(dá)降低。接著我們在細(xì)胞水平進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示，與對照組相比，HG組H9c2細(xì)胞的ARC蛋白水平明顯下降；Tunel染色和caspase3/7活性檢測顯示，與對照組相比較，HG組H9c2細(xì)胞凋亡率和caspase3/7活性增加，HG+Ad-si-ARC組H9c2細(xì)胞的凋亡率和caspase3/7活性較HG+Ad-scr-ARC組更高，而HG+Ad-ARC組H9c2細(xì)胞凋亡率和caspase3/7活性較HG+Ad-β-gal組降低，提示敲低ARC可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，ARC過表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，ARC可以有效地抑制高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。本文結(jié)果還顯示，與C組比，HG組的ROS水平和線粒體膜電位增加；與HG+Ad-β-gal組相比，HG+Ad-ARC組的ROS水平和線粒體膜電位下降，提示過表達(dá)ARC可以有效抑制高糖誘導(dǎo)引起的ROS水平和線粒體膜電位的增加，這表明ARC可以通過線粒體途徑調(diào)控高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。p53是一種腫瘤抑制基因，已有研究顯示，p53可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控抑制ARC表達(dá)[17]，但在糖尿病心肌病模型中該發(fā)現(xiàn)并未被證實。本文Western blot檢測結(jié)果顯示，與HG+Ad-scr-p53組相比，HG+Ad-si-p53組的ARC蛋白表達(dá)增高，表明在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中P53參與調(diào)控ARC的表達(dá)。

綜上所述，ARC通過線粒體途徑抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，P53可以調(diào)控ARC并抑制其表達(dá)。本研究結(jié)果為糖尿病心肌病的治療提供了新的靶點(diǎn)。