邱靚琳，瞿利花，單士剛，李明軒**，周 蕊

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)起源于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其發(fā)生率約占肝臟原發(fā)惡性腫瘤的90%[1]。肝癌在腫瘤疾病中僅次于胃癌和肺癌的死亡率[2]，它具有患病不易察覺、發(fā)病后惡性程度高以及治療和預(yù)后較差等特點(diǎn)[3]，嚴(yán)重?fù)p害人民的生命健康及生活質(zhì)量。研究表明[4]，導(dǎo)致HCC發(fā)生的主要風(fēng)險因素有感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、過度飲酒、接觸亞硝胺類致癌物以及黃曲霉素的暴露等。原癌基因的激活以及抑癌基因的失活是促進(jìn)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞的根本原因[5]。因此，找尋新的HCC相關(guān)基因，探討該基因在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的HCC生物標(biāo)志物和藥物治療靶點(diǎn)，從而造福腫瘤患者。

炎癥細(xì)胞因子/趨化因子的協(xié)同表達(dá)涉及決定基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和mRNA降解速率的多個步驟。雖然轉(zhuǎn)錄是炎癥細(xì)胞因子/趨化因子表達(dá)調(diào)控的第一步，但包括mRNA降解在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是控制蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵。RNA結(jié)合蛋白通過與細(xì)胞因子mRNA 3′端非編碼區(qū)上富含AU元件(AU-rich element，ARE)的結(jié)構(gòu)結(jié)合[6]，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子mRNA的穩(wěn)定性。K-H型剪接調(diào)控蛋白(KH-type splicing regulatory protein，KSRP)是一種重要的RNA結(jié)合蛋白，有研究證實(shí)KSRP可以通過結(jié)合具有重要免疫功能的mRNA 3′UTR的ARE結(jié)構(gòu)，來調(diào)控免疫功能因子[7]。研究表明[8-9]，在蛋氨酸/膽堿缺乏飲食的小鼠中，KSRP可抑制肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化。另外有報道稱[10]，γ干擾素(IFN-γ)刺激肝細(xì)胞可以上調(diào)KSRP表達(dá)，提示KSRP可能在肝臟相關(guān)疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但是，KSRP對HCC增殖凋亡影響的具體分子機(jī)制目前尚未報道。

本研究通過轉(zhuǎn)染shRNA敲低KSRP在HepG2中的表達(dá)，并分析對其細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究HCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

人肝腫瘤細(xì)胞系HepG2來源于本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫；KSRP敲低質(zhì)粒購于上海毅樂生物科技有限公司，過表達(dá)質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室自構(gòu)建；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶均購于美國GIB-CO公司；慢病毒包裝輔助質(zhì)粒Gag、Rev、Vsvg購于Addgene代理公司；轉(zhuǎn)染試劑NeofectTM購于NEOFECT公司；CCK-8檢測試劑盒購于MedChemExpress公司；RIPA(強(qiáng))細(xì)胞/組織蛋白裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光劑均購于武漢賽維爾生物科技有限公司；BCA法蛋白定量試劑盒購于Biosharp公司；KSRP一抗購于Bethyl公司；α-Tubulin購于Santa Cruz生物技術(shù)公司；HRP標(biāo)記的二抗購于北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；FACSCanto流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天(Beyotime)公司；Illumina TruSeq RNA文庫制備試劑盒由康圣環(huán)球基因技術(shù)有限公司提供。

1.2 研究方法

1.2.1 KSRP與肝癌的臨床關(guān)聯(lián)分析

肝癌組織中KSRP表達(dá)的臨床數(shù)據(jù)來源于Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE60502)，利用該數(shù)據(jù)庫分析KSRP在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建

在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，將HepG2細(xì)胞用含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞長至60%～80%匯合度時，使用慢病毒敲低或過表達(dá)KSRP，通過嘌呤霉素篩選敲低或過表達(dá)KSRP的穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞系。

1.2.3 Western印跡實(shí)驗(yàn)

收集待檢測細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞后提取總蛋白，使用10%的SDS-PAGE凝膠電泳，通過恒流350mA，轉(zhuǎn)2h的條件轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再使用5%牛奶封閉1h，之后用一抗4℃孵育過夜，第二天用TBST洗膜后，二抗孵育1h，再次使用TBST洗滌3次，最后使用ECL發(fā)光液在暗室中用膠片曝光顯影，結(jié)果使用Image J灰度分析后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力檢測

將細(xì)胞在96孔板(3×103個/孔)中分別培養(yǎng)24、48、72、96h。棄去培養(yǎng)基，將100μL含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基和10μL的CCK-8測定緩沖液加至各孔中，37℃避光孵育1h后，在450nm處檢測吸光度(OD)值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5 RNA序列(RNA-seq)

使用穩(wěn)定敲低KSRP的細(xì)胞，根據(jù)說明書使用Illumina TruSeq RNA制備試劑盒構(gòu)建文庫。檢測KSRP shRNA處理后的細(xì)胞與對照細(xì)胞的差異表達(dá)。每組3次獨(dú)立重復(fù)。計數(shù)用碎片每千堿基每百萬(FPKM)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用String Tie軟件(v1.3.4d)計算轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。RNA-seq FASTQ文件保存在NCBI的基因表達(dá)Omnibus(GEO)中，可通過GEO登錄號訪問。RNA測序由Kindstar(Kindstar,Wuhan,China)完成。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

收集對數(shù)生長期穩(wěn)定敲低的KSRP和陰性對照HepG2細(xì)胞，按每孔5×105個接種在6孔板中。培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，加入體積分?jǐn)?shù)為70%預(yù)冷乙醇500μL置于4℃固定過夜，染色前用PBS洗去固定液。加RNase A 100μL置37℃恒溫水浴30min，再加PI染液400μL染色，置4℃冰箱，避光孵育30min。流式細(xì)胞儀檢測，數(shù)據(jù)分析處理采用Moditfit軟件，每個樣品均分析10 000個細(xì)胞。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測

收集對數(shù)生長期穩(wěn)定敲低的KSRP和陰性對照HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，接種于6孔板。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，PBS洗滌、離心2次，加入100μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI Staining Solution，輕輕混勻，避光、室溫反應(yīng)10～15min，之后加入400μL的1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上，樣品在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。數(shù)據(jù)分析處理采用FlowJo 7.6軟件。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 KSRP在HCC患者中的表達(dá)

根據(jù)GEO中的臨床信息，如圖1所示，在18名病人的組織樣本中，HCC組織中KSRP的表達(dá)量明顯高于癌旁組織(P<0.001)。

圖1 HCC組織及其對應(yīng)癌旁組織KSRP的表達(dá)水平(***P<0.001)

2.2 過表達(dá)KSRP對肝癌細(xì)胞系增殖能力的影響

使用慢病毒過表達(dá)KSRP，通過嘌呤霉素篩選過表達(dá)KSRP的穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞系，如圖2A所示。隨后，采用CCK-8法檢測過表達(dá)KSRP后，HepG2細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果如圖2B所示，過表達(dá)KSRP后能顯著促進(jìn)HepG2的增殖能力(P<0.01)。

圖2 過表達(dá)KSRP對肝癌細(xì)胞系增殖能力的影響(**P<0.01)

2.3 敲低KSRP對肝癌細(xì)胞系增殖能力的影響

為驗(yàn)證KSRP在肝癌細(xì)胞系中的促癌能力，使用慢病毒敲低KSRP，通過嘌呤霉素篩選敲低KSRP的穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞系，如圖3A所示。隨后，通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，如圖3B所示，敲低KSRP后能顯著抑制HepG2的增殖能力(P<0.01)。

(**P<0.01)

2.4 敲低KSRP對RNA剪接的影響

使用Trizol法提取HCC細(xì)胞中的RNA，通過RNA-seq分析KSRP敲低后對基因轉(zhuǎn)錄的影響。如圖4所示，與對照組相比，KSRP敲低后MKI67的外顯子數(shù)量明顯減少，表明KSRP敲低后抑制了MKI67基因的表達(dá)(P<0.05)。

圖4 RNA-seq分析KSRP敲低后對抗原KI-67(MKI67)的影響

2.5 敲低KSRP對細(xì)胞周期的影響

采用對數(shù)生長期穩(wěn)定敲低KSRP和陰性對照HepG2細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果如圖5所示，相比于陰性對照組，敲低KSRP后G2/M期細(xì)胞從6.32%減少為0.18%，而S期細(xì)胞從28.37%增加到33.14%，表明敲低KSRP將HepG2細(xì)胞阻滯于S期(P<0.05)。

2.6 敲低KSRP對細(xì)胞凋亡率的影響

采用對數(shù)生長期穩(wěn)定敲低KSRP和陰性對照HepG2細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測KSRP對HepG2凋亡的影響。如圖6流式細(xì)胞散點(diǎn)圖所示，HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出4種不同類型的細(xì)胞群：活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。shNC組細(xì)胞凋亡率為3.1%，低于shKSRP組的23.7%(P<0.05)，結(jié)果證明敲低KSRP能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡。

圖6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測KSRP對HepG2凋亡的影響

3 討 論

HCC是一種常見的人類惡性腫瘤，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，也是主要的肝癌亞型[11]，其分子發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為是一個多步驟的過程，在這個過程中，細(xì)胞和分子的改變逐漸積累，如基因組突變、表觀遺傳調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)錄組、細(xì)胞信號通路和代謝過程的改變等。有報道稱HCC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是由促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制肝細(xì)胞凋亡和化療耐藥的多效性細(xì)胞信號通路所介導(dǎo)的[12-13]。KSRP是一種RNA結(jié)合蛋白，它能夠識別并結(jié)合多種炎癥細(xì)胞因子mRNA的3′UTR中的ARE結(jié)構(gòu)，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本的降解或穩(wěn)定性降低[7]。有報道稱[14]，KSRP可以作為炎癥反應(yīng)以及癌癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，尤其是在肝臟促炎細(xì)胞因子和趨化因子的微調(diào)以及非小細(xì)胞肺癌等癌癥細(xì)胞的增殖遷移方面發(fā)揮功能。在生理和病理?xiàng)l件下，KSRP的表達(dá)在細(xì)胞中都受到嚴(yán)格控制。雖然HCC有著較高的發(fā)病率和死亡率，但KSRP在該腫瘤中的作用和功能目前尚未報道。在本研究中，我們根據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫中的臨床信息發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，HCC組織中KSRP的表達(dá)升高，通過CCK-8等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低KSRP能顯著抑制肝癌細(xì)胞系HepG2的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，這些結(jié)果提示KSRP可能是HCC中一種潛在的癌基因，參與該腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

細(xì)胞周期失調(diào)和腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。當(dāng)細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制受到破壞時，細(xì)胞周期會出現(xiàn)紊亂、失常，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞不受控地?zé)o限增殖，特定DNA損傷會導(dǎo)致細(xì)胞無法凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤生成[15]。因此，調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)因子一定與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行深入研究，可以促進(jìn)腫瘤防治的進(jìn)展。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)測定KSRP敲低前后的HepG2細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果證明敲低KSRP后可以阻滯HepG2細(xì)胞周期，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，提示敲低KSRP后能夠抑制HCC的發(fā)展。

MKI67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，是評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)之一。目前臨床研究證實(shí)[16]，MKI67陽性腫瘤細(xì)胞的分?jǐn)?shù)(MKI67的標(biāo)記指數(shù))增高與多種惡性腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MKI67在胃癌[17]、肝細(xì)胞癌[18]等多種腫瘤中的表達(dá)與治療效果和預(yù)后都呈負(fù)相關(guān)。本研究通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)敲低KSRP后引起HCC細(xì)胞中MKI67基因表達(dá)減少，提示敲低KSRP可以抑制HCC的細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究初步證明了KSRP在HCC中發(fā)揮癌基因的作用，解析了其在HCC發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，這些發(fā)現(xiàn)有助于為HCC的預(yù)防和診治提供新的思路，但仍需進(jìn)一步深入研究。