徐易潔，張紅玉，解修超*，鄧大紅，魏嘉毅，舒顆

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723000）

甘蔗（Saccharum officinarum）為禾本科甘蔗屬多年生草本植物，是世界重要的糖料作物和能源作物。我國(guó)是世界第三大甘蔗生產(chǎn)國(guó)，擁有豐富的甘蔗資源。甘蔗中含有豐富的糖分和水分，還含有對(duì)人體新陳代謝有益的各種維生素、脂肪、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、鈣、鐵等[1]，汁液也可發(fā)酵做成糖酒。酵母菌在果酒發(fā)酵過(guò)程中起著十分重要的作用[2-3]。與其它真菌相比，酵母菌具有生長(zhǎng)周期短、易培養(yǎng)、發(fā)酵性能優(yōu)良、不易污染等特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、食品發(fā)酵等行業(yè)中具有極高的應(yīng)用價(jià)值[4]。近年來(lái)，許多學(xué)者從植物中分離出了內(nèi)生酵母菌株，并將其應(yīng)用于食品發(fā)酵行業(yè)中，如從葡萄[5]、無(wú)花果[6]、桑葚[7]和枸杞[8]等果實(shí)中分離出可以用于釀酒的內(nèi)生酵母菌株。

植物內(nèi)生酵母菌是指在其生命周期的一部分時(shí)間內(nèi)定植在健康植物組織中，而不會(huì)對(duì)寄主植物造成損害的一類酵母菌，它與植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了互惠共生、相互依存的關(guān)系[9]。甘蔗中內(nèi)生菌資源十分豐富[10]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于甘蔗的研究主要集中于內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其相關(guān)應(yīng)用[11-13]，而對(duì)甘蔗中另一類特殊的內(nèi)生真菌——內(nèi)生酵母菌的種類及其應(yīng)用的研究較少。目前，在甘蔗葉片中被分離出的內(nèi)生酵母有148株，主要為子囊菌類酵母[14]；甘蔗尾中被分離出的內(nèi)生酵母主要為Kazachstania humilis和扁平云假絲酵母（Candida humilis）等[15]。在甘蔗內(nèi)生酵母菌的應(yīng)用方面，Khunnamwong等[14]從甘蔗葉片中分離出對(duì)甘蔗紅腐病具有一定生防效果的異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。關(guān)于甘蔗內(nèi)生酵母菌株用于發(fā)酵行業(yè)的報(bào)道鮮見(jiàn)。甘蔗中的內(nèi)生酵母菌種類豐富，但在各行各業(yè)中的開(kāi)發(fā)率和利用率相對(duì)較低。本文旨在研究甘蔗中內(nèi)生酵母菌的種類、內(nèi)生酵母菌株的生長(zhǎng)性能和發(fā)酵性能，為后續(xù)應(yīng)用于發(fā)酵行業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

甘蔗：市售；硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硝酸鉀、硫酸銨、氯化鈉、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂（comprehensive potato dextrose agar medium，CPDA）培養(yǎng)基（1 L）：土豆 200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀5 g、硫酸鎂3 g、維生素B 0.5 g、蛋白胨5 g、瓊脂15 g，pH自然。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose agar medium，YPD）培養(yǎng)基（1 L）：酵母浸粉 10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，純化時(shí)加0.1 mg/mL氯霉素，pH自然。

碳源同化試驗(yàn)培養(yǎng)基：將YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖等比例分別換成木糖、肌醇、麥芽糖、檸檬酸、琥珀酸、淀粉、半乳糖醇，其余組分一致，pH自然。

氮源同化試驗(yàn)培養(yǎng)基：將YPD培養(yǎng)基中的蛋白胨等比例分別換成硫酸銨、硝酸鉀、尿素，其余組分一致，pH自然。

糖發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基：將YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖等比例分別換成海藻糖、甘露糖、果糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖，其余組分一致，pH自然。

以上培養(yǎng)基配制完成后均121℃高溫滅菌25 min備用。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-2102C型數(shù)顯式恒溫?fù)u床：上海志成科技發(fā)展有限公司；E600型高級(jí)研究顯微鏡：日本Nikon公司；Mycycler型PCR擴(kuò)增儀、GelDoc型凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-rad公司；Allegra6型低溫高速離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司；SW-CJ-1D型單人超凈工作臺(tái)：上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；YXQ-LS-50S型高壓滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UA2550型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；DYCZ-22A型水平電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘蔗內(nèi)生酵母菌的分離與純化

對(duì)新鮮甘蔗樣品表面進(jìn)行消毒[16]，切小段研磨后收集汁液。將汁液用無(wú)菌水稀釋，得到 10-2、10-4、10-6、10-8梯度稀釋液，分別吸取100 μL稀釋液于含有0.1 mg/mL氯霉素的CPDA固體培養(yǎng)基中涂布，26℃培養(yǎng)48 h～72 h，挑取不同形態(tài)的單個(gè)菌落，接種于加入0.1 mg/mL氯霉素的YPD固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h～72 h。菌落重復(fù)劃線，觀察菌落形態(tài)并記錄特征，直至純化出單一形態(tài)菌株。將菌株保藏在40%甘油中，凍存于-20℃冰箱備用。

1.3.2 酵母菌株的生理生化鑒定

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[17]進(jìn)行碳氮源同化以及糖發(fā)酵的生理生化試驗(yàn)。

1.3.3 酵母菌株的分子生物學(xué)鑒定

1.3.3.1 酵母菌基因組總DNA的提取及片段擴(kuò)增

采用十六烷基三乙基溴化銨（cetyltriethylammoni um bromide，CTAB）法[18]提取菌株基因組 DNA，于-20 ℃下保存。

26S rDNA D1/D2區(qū)序列的擴(kuò)增引物為NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和 NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）條件：94℃、5 min預(yù)變性，94 ℃、1 min，58℃、1 min，72℃、1 min，36個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸10 min。

1.3.3.2 測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳條帶檢測(cè)后送往上海生工（生物）工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank序列進(jìn)行同源性比較，選取GenBank中相似度最高的已知序列，通過(guò)Clustalx比對(duì)后，用MEGA 7.0軟件采用鄰接（neighbour-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 酵母菌株產(chǎn)氣性能測(cè)定

將63株酵母菌從甘油管中挑出，活化后接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)24 h，分別以2%接種量接種于裝有YPD液體培養(yǎng)基的杜氏小管中，26℃培養(yǎng)72 h，觀察并記錄杜氏管[19]中菌株的產(chǎn)氣情況、凝聚性以及發(fā)酵液的氣味，初步篩選出產(chǎn)氣性能良好的菌株。

1.3.5 酵母菌株生長(zhǎng)性能的測(cè)定

1.3.5.1 最適生長(zhǎng)溫度和pH值的確定

將1.3.4中篩選出的產(chǎn)氣性能良好的菌株活化后接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基內(nèi)，26℃培養(yǎng)24 h，分別以2%的接種量接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在不同溫度（24、26、28、34、37、40 ℃）和其對(duì)應(yīng)最適溫度條件下的不同pH 值（4.5、5.0、6.0、6.5、7.5）中培養(yǎng) 24 h，取試驗(yàn)生長(zhǎng)菌液于比色皿中，以未接種的YPD液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600 nm條件下的OD值，以確定菌株的最適生長(zhǎng)溫度和pH值。

1.3.5.2 生長(zhǎng)曲線繪制

方法同1.3.5.1中所述，將1.3.4中篩選的產(chǎn)氣性能良好的菌株放置于其最適生長(zhǎng)溫度和最適pH值中培養(yǎng)72 h，每隔4 h取試驗(yàn)菌液于比色皿中，以未接種的YPD液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600 nm條件下的OD值。

1.3.6 酵母菌株發(fā)酵性能的測(cè)定

乙醇、氯化鈉以及葡萄糖的耐受性測(cè)定：將1.3.5中篩選的生長(zhǎng)性能優(yōu)良的菌株活化后接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)24 h，分別以2%的接種量接種于含不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%）、不同氯化鈉濃度（60、80、100、120、140 g/L）和不同葡萄糖濃度（100、150、200、250、300 g/L）的 YPD 液體培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)24 h，在600 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)OD值。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)試驗(yàn)條件下獲得3組平行試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS 22.0對(duì)不同試驗(yàn)條件下所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行均值計(jì)算，使用GraphPad Prism 8.0.2進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗內(nèi)生酵母菌的分離與鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

通過(guò)富集培養(yǎng)和劃線分離，共分離得到酵母菌63株。對(duì)菌株進(jìn)行菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)對(duì)比，最終得到8株生長(zhǎng)狀況良好且形態(tài)不同的酵母，將其編號(hào)為J-1～J-8，菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)如圖1所示。

圖1 酵母菌株的菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)Fig.1 Colony morphology and cell morphology of yeasts

菌株J-1～J-8的菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)描述如表1所示。

表1 甘蔗內(nèi)生酵母菌菌落和形態(tài)特征Table 1 Morphological characters of endophytic yeast colony

2.1.2 菌株生理生化鑒定結(jié)果

2.1.2.1 菌株碳氮源同化試驗(yàn)結(jié)果

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》，共使用7種碳源和3種氮源對(duì)8株菌進(jìn)行碳氮源同化試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 碳氮源同化試驗(yàn)Table 2 Carbon and nitrogen source assimilation

2.1.2.2 菌株的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

參照《酵母菌的特性與鑒定手冊(cè)》共使用8種糖對(duì)8株菌進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 糖發(fā)酵試驗(yàn)Table 3 Sugar fermentation test

由表1、表2、表3可知，菌株J-1～J-8符合酵母菌的基本特征。菌株J-5和J-8菌落中間凸起，細(xì)胞呈橢圓形、檸檬形，兩端出芽，無(wú)子囊孢子，有菌絲，初步推測(cè)為假絲酵母屬（Candida sp.）。剩余菌株暫無(wú)鑒定結(jié)果，需通過(guò)分子生物學(xué)進(jìn)一步確認(rèn)。

2.1.3 酵母菌的分子遺傳學(xué)鑒定結(jié)果

采用30 μL體系擴(kuò)增26S rDNA D1/D2區(qū)后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有菌株的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)在500 bp～700 bp，且十分明亮。將PCR擴(kuò)增獲得的8株酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列提交到NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酵母菌26S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of yeasts based on 26S rDNA gene sequences

如圖2所示，菌株J-1～J-8分別和Cystobasidiumminutum（MT756553）、Hanseniaspora uvarum（KY103574）、Meyerozyma guilliermondii（KF263938）、Debaryomyces hansenii（KU316760）、Candida oleophila（MN371957）、Wickerhamomyces anomalus（MG773362）、Papiliotrema terrestris（MN913546）、Candida zeylanoides（MH459420）聚集在同一分支，親緣關(guān)系近。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比，其序列相似性均達(dá)到99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定，可將菌株J-1～J-8分別鑒定為Cystobasidium minutum、葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guiliermondii）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、嗜油假絲酵母（Candida oleophila）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、Papiliotrema terrestris以及類筒假絲酵母（Candida zeylanoides）。

2.2 酵母菌株產(chǎn)氣性能的測(cè)定結(jié)果

采用杜氏管發(fā)酵法觀察63株酵母菌的產(chǎn)氣情況，從中篩選出8株具有產(chǎn)氣性能且沉淀良好、發(fā)酵液氣味適宜的酵母菌株，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 酵母菌株發(fā)酵力測(cè)定Table 4 Fermentability determination of yeast strains

由表4可知，26℃培養(yǎng)3 d后，菌株J-1和菌株J-8產(chǎn)氣量少，但沉淀良好，有一定的芳香味。菌株J-3產(chǎn)氣量一般，沉淀良好，有果香味。其余菌株產(chǎn)氣量大、沉淀良好、酒香味濃郁。由此，初步篩選出產(chǎn)氣性能良好的菌株為 J-2、J-4、J-5、J-6 和 J-7。

2.3 酵母菌株生長(zhǎng)性能的測(cè)定結(jié)果

2.3.1 最適生長(zhǎng)溫度和pH值的確定

將篩選出的產(chǎn)氣性能良好的酵母菌株分別在不同溫度和pH值下培養(yǎng)24 h。結(jié)果如表5所示。

表5 菌株的最適生長(zhǎng)溫度和最適pH值Table 5 Optimal growth temperature and pH for yeast strains

由表5可知，將產(chǎn)氣性能良好的酵母菌株分別在不同溫度和pH值下培養(yǎng)24 h后，除菌株J-4的最適生長(zhǎng)溫度為28℃、最適生長(zhǎng)pH值為5.0外，菌株J-2、J-5、J-6和J-7的最適生長(zhǎng)溫度和最適pH值均為26℃和5.0。

2.3.2 生長(zhǎng)曲線的繪制

5株酵母菌株的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。

圖3 酵母菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of yeast strain

由圖3可知，菌株J-2和J-6的生長(zhǎng)速率最快，在8 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)階段；24 h時(shí)，吸光度均達(dá)到最大值，其最大值分別為 1.601±0.030 和 1.993±0.081，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。由此，進(jìn)一步篩選出兩株生長(zhǎng)性能優(yōu)良的菌株J-2和菌株J-6。

2.4 酵母菌株發(fā)酵性能測(cè)定結(jié)果

菌株在乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%～20%條件下的生長(zhǎng)情況如圖4所示。

圖4 酵母菌株的耐乙醇試驗(yàn)生長(zhǎng)曲線Fig.4 Ethanol tolerance diagram of yeast strains

由圖4可知，菌株J-6在不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇中生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良，十分平穩(wěn)，OD值平均為1.800±0.010。菌株J-2在乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%時(shí)，生長(zhǎng)情況最好，OD值為0.812±0.009。隨著乙醇的體積分?jǐn)?shù)升高，菌株J-2的OD值逐漸減小。通過(guò)對(duì)比可知，菌株J-6的乙醇耐受能力較強(qiáng)。

菌株在氯化鈉濃度為60 g/L～140 g/L的生長(zhǎng)情況如圖5所示。

圖5 酵母菌株的耐鹽試驗(yàn)生長(zhǎng)曲線Fig.5 Salt tolerance diagram of yeast strains

由圖5可知，隨著氯化鈉濃度的增加，菌株J-2和菌株J-6的生長(zhǎng)能力逐漸下降。當(dāng)氯化鈉濃度為140 g/L時(shí)，菌株J-6的OD值為0.752±0.011，而菌株J-2在氯化鈉濃度為120 g/L時(shí)，幾乎已無(wú)生長(zhǎng)跡象。通過(guò)對(duì)比可知，菌株J-6的耐鹽能力較強(qiáng)。

菌株在葡萄糖濃度為100 g/L～300 g/L的生長(zhǎng)情況如圖6所示。

圖6 酵母菌株的耐糖試驗(yàn)生長(zhǎng)曲線Fig.6 Suger tolerance diagram of yeast strains

由圖6可知，菌株J-2隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的不斷增加，其生長(zhǎng)能力呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，在葡萄糖濃度為200 g/L時(shí)生長(zhǎng)能力最強(qiáng)，OD值達(dá)到1.490±0.007；在其余葡萄糖濃度下的生長(zhǎng)情況差，且OD值均未超過(guò)0.8。菌株J-6在葡萄糖濃度為150 g/L時(shí)生長(zhǎng)能力最強(qiáng)，OD值達(dá)到1.901±0.010；在葡萄糖濃度為300 g/L時(shí)生長(zhǎng)情況差，OD值為1.211±0.011。通過(guò)對(duì)比可知，菌株J-6的耐糖能力較強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

甘蔗汁中含有十分豐富的適合酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵的養(yǎng)分[20-21]，其汁液本身也可發(fā)酵為酒。由此，根據(jù)內(nèi)共生理論推斷[22]，從甘蔗中分離出的內(nèi)生酵母菌菌株生長(zhǎng)性能和發(fā)酵性能也較為優(yōu)良。

本試驗(yàn)從甘蔗分離的內(nèi)生酵母菌株中，篩選出一株發(fā)酵性能良好的非釀酒酵母，該菌株可耐受體積分?jǐn)?shù)20%乙醇、140 g/L氯化鈉和300 g/L葡萄糖，經(jīng)鑒定為異常威克漢姆酵母。

據(jù)相關(guān)報(bào)道，除甘蔗外，異常威克漢姆酵母也從萵苣[23]、柑橘[24]和葡萄[25]等植物中被分離出來(lái)。該菌耐低溫[26]、可產(chǎn)香[27]、產(chǎn)酯[28]、產(chǎn)尿素[29]，且產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力強(qiáng)[30]，在發(fā)酵行業(yè)應(yīng)用廣泛，如發(fā)酵面團(tuán)[31]、酒曲和醬油的釀造[32-33]、制備低溫大曲[34]、凍干菌劑[35]等。毛祥等[36]從四川麩醋曲藥中分離出的異常威克漢姆酵母菌亞種的最適生長(zhǎng)pH值為5.0～5.5，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，在酒精度為10%vol的情況下幾乎不生長(zhǎng)。Meng等[37]從醬曲中分離出在含140 g/L NaCl培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的異常威克漢姆酵母。范光森等[38]從貢酒曲中分離出兩株異常威克漢姆酵母，一株具有較好的NaCl耐受性，另一株能耐受體積分?jǐn)?shù)14%乙醇。由此可推測(cè)，本試驗(yàn)篩選出的異常威克漢姆酵母菌株可用于酒曲發(fā)酵和醬曲發(fā)酵等食品發(fā)酵行業(yè)。

甘蔗是制造蔗糖的原料，可直接生產(chǎn)酒精[39]。內(nèi)生菌株是植物生長(zhǎng)發(fā)育和代謝過(guò)程中的重要組成部分，可通過(guò)“生物轉(zhuǎn)化”作用，影響宿主的生物活性和其代謝物的積累[40]。該菌株乙醇和糖耐受性強(qiáng)，可推測(cè)，二者之間有著密切的聯(lián)系。據(jù)報(bào)道，熊建春[41]利用安琪酵母為出發(fā)菌株，篩選出適合轉(zhuǎn)化甘蔗汁發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的優(yōu)良釀酒酵母。李翠[42]在提高甘蔗汁酒精發(fā)酵酒度的研究中使用了釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae GJ2008和釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae GGFS16。Limtong等[43]用馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)燃料乙醇，獲得效果較好。由此可推測(cè)，利用從甘蔗中分離出乙醇耐受性強(qiáng)的內(nèi)生酵母菌株來(lái)轉(zhuǎn)化甘蔗汁發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，能達(dá)到更加良好的酒精發(fā)酵效果。