黃 茜，郝雅麗，王 娜，周榮秒，李 琰*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所分子生物學(xué)研究室，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050011)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種常見(jiàn)的影響育齡婦女內(nèi)分泌和代謝的疾病[1]，是由環(huán)境和遺傳因素共同引起的一種多因素疾病[2-3]，環(huán)境因素包括飲食營(yíng)養(yǎng)、地理位置等[4-5]。此外，突變、多態(tài)性可能是PCOS的遺傳發(fā)病機(jī)制[6]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是肝素結(jié)合的同源二聚體糖蛋白，介導(dǎo)血管生成和血管的通透性[7]，由卵巢顆粒細(xì)胞等分泌[8]。VEGF在卵泡的發(fā)生和維持正常生殖功能中發(fā)揮著重要作用，研究顯示PCOS女性血清中VEGF水平升高[9]。高血管化可能導(dǎo)致內(nèi)膜異常生長(zhǎng)，引發(fā)高雄激素血癥，這也是多囊卵巢綜合征的標(biāo)志之一[10]。本研究旨在探討VEGF基因SNP位點(diǎn)與PCOS遺傳易感性的相關(guān)性。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2018年11月—2019年11月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院就診的PCOS患者152例為研究組，另選取同時(shí)期的健康體檢者160例為對(duì)照組。依據(jù)美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)(American Society of Reproductive Medicine，ASRM)鹿特丹工作小組參與修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，至少符合2項(xiàng)才能被診斷為多囊卵巢綜合癥：①月經(jīng)稀發(fā)或停經(jīng)；②臨床表現(xiàn)和生化指標(biāo)顯示雄激素過(guò)剩；③卵巢發(fā)生多囊性的改變(卵巢的直徑在2～9 mm，并且卵泡的數(shù)量≥12個(gè)或卵巢的體積≥10 mL)。同時(shí)患者應(yīng)該排除其他能夠?qū)е赂咝奂に氐牟∫?，如柯興綜合征、先天性腎上腺增生以及分泌雄激素的腫瘤等。所有的患者在3個(gè)月內(nèi)均未使用或服用過(guò)激素類的藥物。所有研究對(duì)象均有正常規(guī)律的月經(jīng)周期和至少一次成功懷孕史，同時(shí)未患有內(nèi)分泌紊亂的相關(guān)疾病，無(wú)糖尿病家族史，經(jīng)陰道超聲檢查未顯示卵巢有多囊性的改變。

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均知情同意且簽署知情同意書(shū)。

1.2外周血標(biāo)本采集及DNA的提取 所有研究個(gè)體均在月經(jīng)第2～3天空腹采集靜脈血2管，每管5 mL，其中1管加入枸櫞酸鈉抗凝劑進(jìn)行抗凝處理，并放置于4 ℃冰箱保存。在采血后的7 d內(nèi)，用蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析的方法提取了外周血DNA。另外一管用化學(xué)發(fā)光分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)分別測(cè)定了黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、促卵泡激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、雌二醇(estradiol，E2)和總睪酮(testosterone，T)的含量。

1.3VEGF基因分型 采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測(cè)反應(yīng)(polymerase chain reaction-ligase detection reaction,PCR-LDR)的方法對(duì)VEGF基因rs699947和rs1570360進(jìn)行了基因分型。由上海捷瑞生物工程有限公司完成。為了驗(yàn)證基因分型結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，對(duì)每一個(gè)SNP位點(diǎn)的所有基因型都隨機(jī)的選擇了15%的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。多重Logistic回歸分析比較相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度比值比(odds ratio,OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組一般資料比較 研究組體重指數(shù)和肥胖家族史陽(yáng)性個(gè)體的分布高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組的年齡比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 一般情況分析

2.2VEGF基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率分布與PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 以符合條件的健康體檢人群作為對(duì)照，與AA基因型相比，攜帶VEGF基因rs699947位點(diǎn)CC或C等位基因顯著顯著增加了PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)。未顯示VEGF基因rs1570360位點(diǎn)與PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 VEGF基因SNP位點(diǎn)基因型及等位基因分布情況

2.3VEGF基因SNP位點(diǎn)與PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的多因素分析 以是否罹患PCOS(對(duì)照組=0，研究組=1)為因變量，以年齡(連續(xù)變量)、肥胖家族史(無(wú)=0，有=1)以及VEGF基因的SNP位點(diǎn)基因型(rs699947：AA=0，AC=1，CC=2)(rs1570360：GG=0，GA=1，AA=2)為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示在控制了年齡和肥胖家族史因素后，VEGF基因rs699947位點(diǎn)與PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍存在關(guān)聯(lián)。攜帶CC基因型可能增加了PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，OR值為2.896(P=0.005)；肥胖家族史陽(yáng)性個(gè)體的患病風(fēng)險(xiǎn)是陰性個(gè)體的3.185倍95%CI=1.878～5.402，P<0.001，未顯示年齡與PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 VEGF基因SNP位點(diǎn)與PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性分析

3 討 論

本研究采用病例-對(duì)照的方法分析了VEGF基因兩個(gè)SNP位點(diǎn)(rs699947和rs1570360)與PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)系。結(jié)果顯示，rs699947與PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是顯著相關(guān)的，與AA基因型相比，攜帶CC基因型或C等位基因可能增加了PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在控制了年齡和肥胖家族史等因素后，rs699947的CC基因型仍顯著增加了PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

VEGF是一種二聚肝素結(jié)合糖蛋白[12]，在卵巢生理和病理[13]過(guò)程中起著非常重要的作用。VEGF在多種生物學(xué)過(guò)程中介導(dǎo)了新血管的形成以及增加了血管的通透性，例如黃體形成、胚胎發(fā)生和腫瘤發(fā)生等[13]。VEGF也是維持卵巢濾泡周?chē)骱驼{(diào)節(jié)濾泡內(nèi)含氧水平[14]的一個(gè)重要因素。早期對(duì)VEGF在PCOS病理生理學(xué)中的研究主要集中在PCOS女性中VEGF分泌水平的改變，一些最新的研究主要關(guān)注VEGF基因SNP多態(tài)性和PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。VEGF基因的調(diào)控區(qū)域包含了許多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是極其復(fù)雜的，包括轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的調(diào)控[15]。VEGF基因在卵巢、乳腺、肝臟、肺和腎臟等多種組織中的表達(dá)水平取決于其啟動(dòng)子活性。本文選取的rs699947和rs1570360是兩個(gè)位于VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)的SNP位點(diǎn)，位于基因啟動(dòng)子區(qū)的SNP可能通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的結(jié)合作用，從而影響基因的表達(dá)水平。

Almawi等[16]在巴林島人群中進(jìn)行了一項(xiàng)研究，研究納入了PCOS患者382例和健康對(duì)照393例，研究分析了VEGF基因的12個(gè)SNP位點(diǎn)和PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系,其中包括rs699947和rs1570360，研究結(jié)果并未顯示單一SNP位點(diǎn)和PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)系。Vural等[17]研究了土耳其人群中rs699947等3個(gè)SNP位點(diǎn)和PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，結(jié)果并未顯示這3個(gè)SNP位點(diǎn)和PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)系。Gomes等[18]分析了巴西人群VEGF基因rs699947等3個(gè)位點(diǎn)和PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，單因素分析顯示rs1570360在隱性模型組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究分析VEGF基因兩個(gè)SNP位點(diǎn)與PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示rs699947與PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是顯著相關(guān)的，與AA基因型相比，攜帶CC基因型或C等位基因可能增加了PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究的研究結(jié)果與以往研究不一致，可能是與研究對(duì)象的遺傳背景的差異相關(guān)，這提示在進(jìn)行SNP位點(diǎn)與疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究中應(yīng)該重點(diǎn)考慮研究群體地域性和種族性的差異。綜上所述，本研究結(jié)果表明攜帶VEGF基因rs699947的CC基因型顯著增加了中國(guó)北方婦女患PCOS的風(fēng)險(xiǎn)。