張貴珍 余祖江 韓雙印（鄭州大學第一附屬醫(yī)院感染科，鄭州 450052）

嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor-T cells，CAR-T）治療是目前被臨床廣泛關注的一種新型細胞免疫療法，從患者或異體供者血液中獲取T細胞后利用基因工程技術將靶向腫瘤抗原的CAR引入到T細胞，體外擴增后回輸患者體內發(fā)揮特異性抗腫瘤作用。2017年CAR-T細胞治療迎來了階段性勝利，美國食品藥品監(jiān)督管理局先后批準兩個CD19 CAR-T活細胞藥物“Tisagenlecleucel”和“Axi?cabtagene ciloleucel”，用于急性B細胞白血病和B細胞淋巴瘤 的 治療［1-2］。2020年7月，第三個CD19 CAR-T藥物“brexucabtagene autoleucel”也獲得加速審批，用于治療復發(fā)難治性套細胞淋巴瘤患者［3］。

CAR-T細胞在血液系統(tǒng)腫瘤中取得了令人矚目的進展極大提高了研究者的熱情將CAR-T研究延伸至實體瘤治療領域中。CAR-T抗腫瘤效果有賴于CAR對腫瘤抗原的特異性識別。因此，合適的抗原靶點對CAR-T治療的成功實施至關重要。B7-H3（也稱CD276）是一種在多種實體瘤中過表達的B7家族成員跨膜蛋白，由于其在免疫學和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的生物學作用而備受關注，在腫瘤免疫治療領域中作為分子靶點被廣泛研究［4］。

1 B7-H3的分子特征

B7-H3基因由CHAPOVAL等［5］于2001年在人樹突狀細胞cDNA文庫中首次克隆而出，因其結構與B7家族基因相似，故命名為B7Homolog 3（B7-H3）。B7-H3位于人類染色體15q24.1，含10個外顯子，其mRNA長4.1 kb。B7-H3分子是Ⅰ型跨膜蛋白，為免疫球蛋白超家族成員，由1個氨基端信號肽、1個胞外結構域（含免疫球蛋白樣可變區(qū)IgV和恒定區(qū)IgC）、1個跨膜域和1個僅有45個氨基酸的胞內域組成。B7-H3與其他B7家族成員20%~27%的氨基酸具有同一性，是最保守的家族成員，人B7-H3與小鼠B7-H3的序列相似性高達88%。由于外顯子復制，人B7-H3有兩種剪切異構體：即2Ig-B7-H3，胞外域含IgV-IgC，包含316個氨基酸，分子量為45~66 kD；4Ig-B7-H3是胞外域為IgV-IgC-IgV-IgC的另一種異構體，含534個氨基酸，分子量為90~110 kD，是人體組織中最主要的存在形式［6-7］。此外，由于內含子的可變剪切，可生成可溶性B7-H3（soluble B7-H3，sB7-H3）；膜型B7-H3也可被基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）裂解形成sB7-H3，并可在人類血漿中檢測［8-9］。

2 B7-H3的表達與分布

B7-H3 mRNA廣泛表達于人類多種細胞和組織中。在非免疫性的靜止成纖維細胞、內皮細胞、成骨細胞和羊水干細胞上均可檢測到B7-H3 mRNA，在心臟、肝臟、胰腺、小腸、結腸、前列腺、子宮、胎盤、胸腺、脾臟等淋巴器官中也有表達，外周血單核細胞中不表達；但B7-H3蛋白的表達卻較為局限且呈低水平，主要表達于局灶性肝細胞以及胃、結腸的少數(shù)腔上皮細胞，廣泛的mRNA表達譜與局限的蛋白表達與轉錄后嚴密的調控機制有關［10-11］。B7-H3蛋白還可表達于未成熟和成熟的樹突狀細胞中，經誘導也可表達于NK細胞、B細胞、T細胞。然而，與健康組織的局限性表達不同，B7-H3蛋白在多種實體瘤中過表達，包括膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）、神經母細胞瘤（neuroblastoma，NB）、胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、腎癌、乳腺癌和宮頸癌等。多項研究表明，B7-H3在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者中表達率可高達100%［12］；SUN等［13］發(fā)現(xiàn)93.8%肝癌患者中B7-H3過表達；前列腺癌患者的B7-H3表達率也高達95.9%；76%的NB和100%的髓母細胞瘤及超過70%的GBM均呈現(xiàn)B7-H3過表達［14］；此外，95%的腎透明細胞癌患者的腫瘤間質和脈管系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)了B7-H3陽性表達［15］。

3 B7-H3功能與腫瘤

目前對B7-H3特異性受體和下游信號知之甚少，但大量研究表明B7-H3對固有免疫和適應性免疫均有調節(jié)作用。早期研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3陽性的NB細胞可免受NK細胞介導的裂解作用，推測NK細胞表面可能含有與B7-H3結合的抑制性受體［16］。在T細胞介導的適應性免疫中，最初研究表明B7-H3作為共刺激分子，可促進CD4+和CD8+T細胞的增殖，增強細胞毒性T淋巴細胞活性，選擇性刺激IFN-γ的產生。然而隨研究深入，越來越多的證據表明B7-H3可抑制T細胞的活化，并有效抑制活化T細胞的增殖、細胞因子產生和細胞毒性功能。臨床前研究表明，阻斷B7-H3可增強CTL和NK細胞活性，減少腫瘤相關巨噬細胞的數(shù)量，減輕腫瘤負荷［17-18］。

除上述免疫調節(jié)功能外，B7-H3也在腫瘤發(fā)生、增殖、凋亡等生物學進程中發(fā)揮作用。多項研究表明B7-H3可改變細胞糖代謝，增加腫瘤細胞的有氧糖酵解能力，即Warburg效應，促進腫瘤發(fā)生相關生物大分子的合成［19］。B7-H3可能通過抑制Nrf2的轉錄提高活性氧和低氧誘導因子1-α（hypoxia-induc?ible factorα，HIF1-α）的水平，從而上調乳酸脫氫酶A和丙酮酸脫氫酶激酶1，促進糖酵解［20-22］。B7-H3還可提高基質金屬蛋白酶水平，募集并激活VEGF和Tie-2，促進血管內皮細胞在基質間隙的擴散和遷移，從而促進腫瘤新生血管的形成［23］。此外，B7-H3可能通過PI3K/AKT途徑干擾細胞周期，加快G1期/S期進程，促進腫瘤細胞快速增殖［24］。研究顯示B7-H3基因表達可明顯促進宮頸癌、食管癌、口腔癌和結直腸癌細胞的增殖，基因敲除后細胞增殖明顯減弱。在肝癌研究中發(fā)現(xiàn)B7-H3可通過JAK2/STAT3/SLUG通路靶向上皮-間質轉化過程，促進肝癌的侵襲和轉移［25］。尚有研究表明B7-H3還與腫瘤耐藥有關。B7-H3可能通過JAK2/STAT3和PI3K/Akt/mTOR途徑激活survivin，Mcl-1，Bcl-xL和Bcl-2等凋亡抑制因子抑制caspase級聯(lián)反應，或與主穹隆蛋白結合，激活MAPK激酶途徑，促進腫瘤干細胞的產生，從而發(fā)揮抗腫瘤細胞凋亡作用并使其對化療藥物產生耐藥性［26-28］。B7-H3的過表達和其在腫瘤進展中的生物學作用也得到了臨床數(shù)據的支持。大量研究表明，B7-H3過表達與腫瘤分級、高腫瘤負荷、淋巴結轉移、高復發(fā)率和總體生存期縮短有關。TANG等［29］的研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3在高級別神經膠質瘤中的表達較高，而在低級別膠質瘤中表達較低，在正常腦組織中不表達；低級別膠質瘤患者中，B7-H3低表達組中位生存期136.1個月，而高表達組僅55.5個月。

4 B7-H3 CAR-T用于實體瘤免疫治療

B7-H3過表達和在腫瘤生物學進程中的功能使其在實體瘤免疫治療中備受關注。靶向B7-H3的單克隆抗體MGA271在腎細胞癌和膀胱癌臨床前模型中表現(xiàn)出有效的抗腫瘤活性。Ⅰ期臨床試驗已在前列腺癌、黑色素瘤、NSCLC等患者中開展。在轉移性NB的補救治療中，131I標志的8H9使83.3%的患者生存期延長，中位生存期達33個月［30］。目前，Ⅰ期臨床試驗已在腹膜腫瘤、GBM和軟腦膜轉移瘤患者中開展。mAb376.96是靶向B7-H3的另一種單克隆抗體。單藥應用于卵巢癌、胰腺癌模型時，與未治療組相比可延長小鼠中位生存期2~3倍［31-32］。此外，新型雙特異性抗體（如MGD009）、抗體偶聯(lián)藥物（如mAb276-PBD、MGC018和8H9-PE38）在肺癌、結腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中已有研究，在異種移植模型中產生了實質性腫瘤消退，部分已進入臨床試驗階段。

與傳統(tǒng)放化療及抗體治療相比，CAR-T細胞治療具有獨特的優(yōu)勢。CAR由胞外域、跨膜域和胞內域組成（圖1）。胞外單鏈可變片段（single-chain variable fragment，scFv）用于識別抗原靶點，胞內域含CD3鏈和共刺激分子，用于傳遞活化、共刺激信號。第一代CAR-T胞內域僅含CD3ζ結構。第二代和第三代CAR-T胞內域分別含有一個和兩個共刺激分子（如CD28、4-1BB）與CD3ζ串聯(lián)。第四代CAR-T引 入了增 強T細 胞功能 的細胞因 子［33-34］。CAR-T細胞靶向性強，靶點范圍廣，可識別蛋白質、糖類和脂類等多種腫瘤抗原；CAR-T以MHC非限制性方式識別腫瘤抗原，因此不受腫瘤中MHC表達下調的影響；CAR-T內信號域的修飾可彌補共刺激分子的下調，在CAR胞內信號域加入CD28和4-1BB等共刺激分子可顯著增強T細胞增殖、存活、細胞因子分泌和腫瘤溶解能力。此外，CAR-T在體外可快速大量增殖，可在短期內獲得足夠的腫瘤特異性細胞滿足治療所需［34-35］。

圖1 CAR結構示意圖Fig.1 Schematic structure of CAR

目前靶向B7-H3的CAR-T在神經系統(tǒng)腫瘤、骨肉瘤、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等多種實體瘤中研究。有研究測試了基于MGA271的第二代CAR-BBζ-T在B7-H3陽性骨肉瘤、髓母細胞瘤、尤文氏肉瘤細胞系中的作用，體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)B7-H3 CAR-T可有效靶向腫瘤細胞并分泌大量IFN-γ、TNF-α和IL-2［36］。隨后有相關研究團隊在非典型畸胎橫紋肌樣瘤（atypi?cal teratoid/rhabdoid tumors，ATRTs）中測試了B7-H3 CAR-T對8種不同ATRT細胞系的殺傷作用，結果表明B7-H3 CAR-T可有效殺傷腫瘤細胞，其中與BT12細胞系共培養(yǎng)時，即使以1∶5效靶比，仍可清除幾乎所有腫瘤細胞［37］。DU等［11］發(fā)現(xiàn)B7-H3 CAR-T反應強度與腫瘤細胞表面B7-H3的表達量有關，即B7-H3 CAR-T優(yōu)先靶向B7-H3高表達腫瘤細胞，對抗原低表達腫瘤細胞活性顯著降低，顯示出“治療窗”，與上述團隊在不同B7-H3表達水平的NALM-6細胞系中研究相似。B7-H3 CAR-T的抗原密度依賴性反應在GBM中也得到驗證。在B7-H3高表達GBM組，B7-H3 CAR-T可產生強烈的特異性裂解作用，在中表達組可觀察到中等強度細胞裂解，而在B7-H3陰性或低表達組未觀察到明顯反應，提示B7-H3 CAR-T可能更適用于治療B7-H3高表達腫瘤［29］。此外，B7-H3 CAR-T在卵巢癌、神經母細胞瘤和黑色素瘤的體外試驗中亦顯示出有效的抗腫瘤活性［11，38］。

為探究不同CAR結構對T細胞功能的影響，研究者基于不同B7-H3 mAb設計了包含不同共刺激信號的CAR-T［36］。體外試驗表明基于MGA271的第二代CAR-BBζ-T在特異性識別B7-H3陽性腫瘤細胞同時細胞因子分泌能力最佳。同樣，DU等［11］基于mAb376.96構建了二代B7-H3 CAR-28ζ-T和B7-H3 CAR-BBζ-T，發(fā)現(xiàn)兩種CAR-T均可特異性識別并殺傷B7-H3陽性PDAC細胞系，但在靶向組成性表達PD-L1的PDAC細胞系時，相比B7-H3 CAR-28ζ-T，B7-H3 CAR-BBζ-T表面PD-1表達更低，并具有較強的抗腫瘤活性，表明B7-H3 CAR-BBζ-Ts對PD-L1介導的抑制作用較小。除優(yōu)化CAR結構外，研究者們也從CAR-T表面共表達分子上另辟蹊徑。HUANG等［39］基 于mAb7E12設 計 了 共 表 達PD-1誘騙受體（PD28/PDmut7R）的B7-H3 CAR-T，該受體由CD28的共刺激信號域或組成性活化IL-7受體胞內域與PD-1的胞外域嵌合而成，以期將PD-1介導的抑制信號逆轉為刺激信號，從而改善CAR-T的抗腫瘤活性。與B7-H3陽性肺巨細胞癌或卵巢癌細胞系共培養(yǎng)，PD28 CAR-T或PDmut7R CAR-T可產生更高水平的Th1細胞因子，提示PD-1誘騙受體在B7-H3 CAR-T的共表達可提高其抗腫瘤活性。

基于前期良好的體外試驗結果，研究者們相繼開展了B7-H3 CAR-T體內試驗。在骨肉瘤（n=5）和尤文氏肉瘤（n=5）原位異種移植模型中，向NSG小鼠尾靜脈注射1×107個B7-H3 CAR-T導致了腫瘤的完全退縮和消除，并顯著延長小鼠生存期。在骨肉瘤轉移模型中，B7-H3 CAR-T組（n=10），9例小鼠生存時間超過5個月，而對照組（n=5）均在50 d內死亡，生存獲益明顯［36］。B7-H3在多種神經系統(tǒng)腫瘤中過表達，為測試B7-H3 CAR-T能否有效穿越血腦屏障并根除腫瘤，研究者向髓母細胞瘤原位異種移植小鼠尾靜脈注射B7-H3 CAR-T，注射7 d后，小鼠顱內即可檢測到大量B7-H3 CAR-T，最終5只小鼠顱內腫瘤均被有效根除；即便在高侵襲性模型中，仍有效清除腫瘤（4只/6只），與CD19 CAR-T對照組相比，顯著延長小鼠生存期（20 dvs80 d）［36］。受到前期結果的鼓舞，有相關研究團隊繼續(xù)探索了B7-H3 CAR-T在兒童ATRTs中的作用［37］。在兩組侵襲性ATRT-PDX（patient-derived xenograft，PDX）模型中，B7-H3 CAR-BBζ-T靜脈給藥后（1×107個細胞）成功根除腫瘤（10只/10只，9只/10只）。與靜脈注射相比，局部（腫瘤內或腦室內）給予B7-H3 CAR-BBζ-T歸巢更快，抗腫瘤效果更好，與其他學者在卵巢癌研究中的結論相似［11］。劑量滴定實驗顯示，腦室內給予0.25×106個B7-H3 CAR-T可清除60%的小鼠腫瘤，清除全部小鼠腫瘤需0.5×106個B7-H3 CAR-T，而靜脈注射組則需2.5×106個B7-H3 CAR-T。此外，局部給藥全身炎癥因子水平更低，表明局部應用CAR-T的毒性可能小于全身應用。在腫瘤再挑戰(zhàn)模型評估中，無論是靜脈注射還是腦室內給藥均介導了抗原特異性的免疫記憶，為防止腫瘤復發(fā)提供了可能。GBM也是備受關注的中樞神經系統(tǒng)腫瘤。國內學者構建了靶向B7-H3的第三代CAR-T（CD28-4-1BB-CD3ζ）［29］。在 原 位GBM-PDX模 型（n=5）中向NOD-SCID小鼠靜脈注射2×106個B7-H3 CAR-T后觀察到明顯的腫瘤生長抑制，2只小鼠復發(fā)。排除抗原丟失引起的復發(fā)后，TANG等［29］采用不同劑量給藥，發(fā)現(xiàn)B7-H3 CAR-T呈現(xiàn)劑量依賴性抗腫瘤作用和生存期延長，在NB模型中得出了同樣的結論。NEHAMA等［40］還測試了含不同共刺激分子的B7-H3 CAR-T在GBM模型中的抗腫瘤作用，B7-H3 CAR-28ζ-T組和B7-H3 CAR-BBζ-T組未觀察到治療相關不良反應，均出現(xiàn)持續(xù)的腫瘤退縮，并具有顯著的生存獲益（6只/11只>120 dvs6只/10只>120 d），兩組差異無統(tǒng)計學意義。同樣地，在PDAC細胞系原位異種移植模型、轉移模型和PDAC-PDX模型中，兩種B7-H3 CAR-T也表現(xiàn)出相似的抗腫瘤特性，其中，在PDAC-PDX模型中，B7-H3 CAR-T可有效根除腫瘤并持續(xù)控制腫瘤生長長達80 d。但在靶向組成性表達PD-L1的PDAC模型時，CAR-BBζ-T表面PD-1表達更低，抗腫瘤作用明顯優(yōu)于CAR-28ζ-T，與體外試驗結果一致［11］。為提高CAR-T的抗腫瘤作用，HUANG等［39］在人肺巨細胞癌和卵巢癌皮下異種移植模型中測試了共表達PD-1誘騙受體（PD28/PDmut7R）的B7-H3 CAR-T，與對照組相比，共表達PD-1誘騙受體的B7-H3 CAR-T，特別是PD?mut7R CAR-T，表現(xiàn)出更優(yōu)異的抗腫瘤活性，且在腫瘤再挑戰(zhàn)模型中，單次注射5 d后即可成功清除腫瘤。另有學者發(fā)現(xiàn)在B7-H3 CAR-28ζ-T細胞表面共表達41BBL，可增強CAR-T細胞的體內擴增能力，改善其抗腫瘤活性，并將共表達41BBL的CAR-T細胞用于早期臨床試驗［41］。針對實體瘤的抗原異質性，國內華西醫(yī)院學者設計了同時靶向CD70和B7-H3的CAR-T細胞，與單靶點CAR-T相比，低劑量的雙靶點CAR-T細胞即可有效控制肺癌和黑色素瘤異種移植瘤并改善模型動物的總體存活率［42］。CAR-T的安全性是CAR-T應用中的焦點，為此，有研究探究了具有免疫能力的荷瘤C57BL/6J小鼠中的潛在毒性，結果表明B7-H3 CAR-T不僅可控制PDAC生長達4周，且血細胞計數(shù)和組成均無顯著變化，未檢測到組織損傷和器官毒性［11］。

臨床前期令人鼓舞的結果也推動了B7-H3 CAR-T向臨床階段的發(fā)展。國內學者率先發(fā)表了B7-H3 CAR-T用于1例復發(fā)性間變性腦膜瘤患者的結果。研究者將B7-H3 CAR-T采用局部腔內注射方式連續(xù)治療3個周期，患者耐受性良好，未出現(xiàn)3級及以上的毒性反應。B7-H3 CAR-T可浸潤至輸注裝置附近的腫瘤組織并可有效控制浸潤部位的腫瘤生長，但無法浸潤至遠處腫瘤組織。免疫組化分析顯示，治療3個周期后，浸潤部位的腫瘤組織B7-H3表達量明顯降低，而遠處無浸潤部位B7-H3仍呈高表達［43］。第一例臨床治療結果提示局部注射B7-H3 CAR-T是安全的，并可產生局部生物學活性，未來解決抗原損失和CAR-T細胞浸潤可進一步增強B7-H3 CAR-T療效。目前B7-H3 CAR-T已有多項臨床試驗進行（表1）。其中一項Ⅰ期臨床試驗計劃將B7-H3 CAR-T腫瘤內或腦室內局部給藥，評估其在彌漫性膠質瘤、ATRT等在內的多種兒童復發(fā)性或難治性中樞神經系統(tǒng)腫瘤中的安全性和可行性（NCT04185038）。一項Ⅰ/Ⅱ期試驗由國內一家機構開展，預探究在難治性或復發(fā)性GBM中，與替莫唑胺單藥相比，局部給予B7-H3 CAR-T聯(lián)合替莫唑胺的安全性和有效性（NCT04077866）。

表1 最近正在開展的B7-H3 CAR-T細胞治療實體瘤的臨床試驗Tab.1 Recently ongoing clinical trials with B7-H3 CAR-T cell therapy in solid tumors

5 總結與展望

CAR-T在血液系統(tǒng)腫瘤中的進展為實體瘤的免疫治療奠定基礎。以B7-H3為靶點的CAR-T臨床前研究展示了良好的耐受性和抗腫瘤作用。但由于實體瘤的復雜性和臨床前實驗的局限性，B7-H3 CAR-T的臨床實施未來還需在以下方面做出努力：①深入研究B7-H3受體和信號傳導機制為CART應用提供理論基礎；②引入趨化因子受體或尋求最佳給藥方式促進CAR-T細胞浸潤；③發(fā)掘CAR-T調控因子、優(yōu)化共刺激結構、同時靶向腫瘤基質或聯(lián)合免疫檢查點治療以克服實體瘤免疫抑制微環(huán)境；④基于實體瘤的高度異質性，設計多靶點CAR-T，防止因單靶點耐受而免疫逃逸；⑤完善治療體系，確定最佳給藥時機和劑量，在保證抗腫瘤作用同時盡量減少毒副作用。CAR-T治療腫瘤存在研究意義，盡管存在諸多困難，但隨著人們對腫瘤生物學、免疫學認識的不斷加深和CAR-T技術的成熟與改進，CAR-T將為眾多實體瘤患者治療提供研究基礎。